犬繁殖調(diào)控技術(shù)的研究進展

犬繁殖調(diào)控技術(shù)的研究進展

根據(jù)2005年底公布的《狗血漿蛋白》，狗和人之間的基因相似性度高于人類和大鼠。作為一種研究人類疾病的動物模型，犬可以發(fā)揮很大的潛力，現(xiàn)在是國內(nèi)外科學(xué)家的研究熱點。因此在這種背景下,犬的繁殖生物技術(shù)也進入了快速發(fā)展階段。但是由于犬具有一些獨特的生殖生理特點,使犬繁殖控制技術(shù)的發(fā)展目前仍然面臨著一些困難,如誘導(dǎo)發(fā)情、精液冷凍保存及人工授精(artificialinsemination,AI)、胚胎移植(embryotransfer,ET)、體外受精(invitrofertilization,IVF)等胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)以及克隆(clone)等,這些技術(shù)的應(yīng)用不僅能夠提高良種犬繁殖潛能,保護犬的種質(zhì)資源,對犬作為實驗動物的基礎(chǔ)研究具有重要促進作用。1外源激素的誘導(dǎo)主養(yǎng)試驗與一般家畜相比,犬雖是季節(jié)性發(fā)情動物,但是具有一個相對較長的發(fā)情周期,其持續(xù)時間大約相當于其它大家畜的10倍,除此之外,犬的生殖活動和繁殖率也具有一定的不穩(wěn)定性,交配妊娠率有較大的差別。由于犬的間情期黃體壽命與妊娠期的一樣長,因此犬經(jīng)常會出現(xiàn)假孕現(xiàn)象。犬一般在出生后10~12個月開始表現(xiàn)性行為,大多數(shù)犬約每年發(fā)情2次,發(fā)情期所持續(xù)時間為一周左右,每次間隔約為半年。發(fā)情期的間隔長短因品種個體、營養(yǎng)狀況不同而有較大差異。據(jù)統(tǒng)計家養(yǎng)犬1年只發(fā)情1次的占26.1%,發(fā)情兩次的占65.2%,發(fā)情3次的占8.7%。母犬的發(fā)情周期表現(xiàn)受體內(nèi)生殖激素的變化所調(diào)控,在進入發(fā)情期前體內(nèi)雌激素水平明顯升高,持續(xù)約7d后,開始下降,孕激素水平較低;而此時LH水平急劇升高,持續(xù)時間較短,當LH達峰值后24~48h,開始排卵,雌激素水平后降至正常值。母犬到了性成熟年齡后和配種季節(jié)到來后仍未見發(fā)情,可采用激素誘導(dǎo)發(fā)情。目前在國內(nèi)外應(yīng)用于誘導(dǎo)母犬發(fā)情的外源性激素大致分為以下幾類:促性腺激素釋放激素(GnRH),促性腺激素、促乳素抑制因子(PIF)、雌激素(E2)、前列腺素(PGF2α)、多巴胺激動劑等。國外對激素類藥物誘導(dǎo)犬發(fā)情的研究較早,從1939年開始以來,已經(jīng)有超過40種的激素類處理組方用于誘導(dǎo)犬的發(fā)情。Ithaca指出,只有當母犬卵巢上的卵泡發(fā)育到一定的水平時,對母犬給予GnRH才會有效,GnRH并不能增加生長卵泡的數(shù)目,只能促使其成熟的卵泡排卵。GnRH的脈沖釋放和閾值對于卵泡的持續(xù)生長和發(fā)育具有很重要的意義。因此應(yīng)用GnRH及其類似物誘導(dǎo)發(fā)情時,必須要有連續(xù)滴注藥或規(guī)律頻繁給或?qū)⑵渲谱鞒删忈屩苿┻M行皮下埋植。利用GnRH來誘導(dǎo)乏情母犬發(fā)情,其處理時間一定要超過8d才會出現(xiàn)效果。國內(nèi),余道倫等等實驗表明,小劑量的妊娠馬血清促性腺激素(PMSG)(150~300)IU單獨使用時不能有效地誘導(dǎo)發(fā)情母犬的發(fā)情排卵,大劑量(500)IU應(yīng)用時雖可有效地誘導(dǎo)發(fā)情排卵,但受胎率較低,因此提高單獨應(yīng)用PMSG的誘導(dǎo)發(fā)情效果尚需進一步研究。王祿華等將6只試驗犬在第1天皮下注射PGF2α0.5mg,分上、下午兩次注射,24h后皮下注射PMSG20IU/kg體重,每天1次,連用10d,交配后肌內(nèi)或皮下注射促排3號,24h后復(fù)配1次。結(jié)果表明試驗犬都出現(xiàn)了發(fā)情癥狀,發(fā)情率為100%,但受配率較低。在生產(chǎn)中,經(jīng)常用hCG與PMSG結(jié)合使用,誘導(dǎo)處于乏情期的母犬發(fā)情,且上述兩種激素聯(lián)合使用要比單獨使用PMSG誘導(dǎo)發(fā)情的效果好的多。張玉西等研究,用相同PMSG和hCG配合處理母犬,發(fā)現(xiàn)在發(fā)情率、受胎率方面經(jīng)產(chǎn)母犬顯著優(yōu)于未經(jīng)產(chǎn)犬。譚建華等用PGF2α、eCG及hCG聯(lián)合使用具有促進發(fā)情、卵泡發(fā)育和超數(shù)排卵的功能,并能維持早期胚胎的著床。孫兆增等將40只處于乏情期的比格犬乙烯雌酚隔天給藥且藥量逐漸加大的方法誘導(dǎo)發(fā)情的效果較好。李小慧等利用溴隱亭誘導(dǎo)母犬發(fā)情,將所有的試驗犬每天口服溴隱亭1次,結(jié)果表明在試驗所用的9只犬中,有3只蘇北紅犬出現(xiàn)發(fā)情癥狀,而另外6只羅維納犬中,只有1只在處理后出現(xiàn)發(fā)情癥狀,經(jīng)分析,出現(xiàn)差異的原因可能與犬的種類和繁殖史有關(guān)系。目前對于激素誘導(dǎo)犬發(fā)情的效果不一致,還沒有可用于生產(chǎn)及臨床上的合適組方,存在一定的問題。使用PMSG組合對乏情母犬進行人工誘導(dǎo)發(fā)情是最有效的方法,但用PMSG誘導(dǎo)發(fā)情的最大缺點是容易使卵巢產(chǎn)生不排卵的大卵泡并且由于PMSG半衰期長,誘情失敗后會導(dǎo)致母犬長時間不發(fā)情,甚至喪失繁殖力。使用雌激素的方法,由于注射雌激素對于卵泡發(fā)育的促進作用較小,容易導(dǎo)致母犬出現(xiàn)假發(fā)情,并且雌激素的副作用常會影響母犬的正常性周期。使用前列腺素類藥物時會產(chǎn)生一些副作用,如口水增多、嘔吐、腹瀉、運動失調(diào)、不安、尿頻等。2犬精子庫的制備1959年Seager首次報道了犬的凍精人工授精獲得成功。之后,犬精液冷凍已成為犬生殖生理學(xué)研究的一部分,相繼建立了采精、精液品質(zhì)評價、稀釋及人工授精的有關(guān)參數(shù),最高受孕率可達92%。國外一些大學(xué)和養(yǎng)犬俱樂部建立了犬精子庫,提供繁殖配種服務(wù)。我國在這方面的研究起步較晚,目前尚處于試驗研究階段。Rota等通過添加EquexSTM到常用的Tris卵黃液中,提高了在38℃解凍后犬精子的存活率,經(jīng)陰道或子宮內(nèi)輸精,妊娠率達到了84%。Abe等用脫脂牛奶、葡萄糖和甘油代替卵黃液,結(jié)果表明解凍后精子的活力及各參數(shù)與傳統(tǒng)的卵黃液方法無明顯差別,且對2只受體犬進行人工受精后,產(chǎn)下6只幼犬。Bencharif等研究用含有6%卵黃的低密度脂蛋白冷凍液與傳統(tǒng)的含有20%卵黃的冷凍液進行比較研究,發(fā)現(xiàn)在低密度脂蛋白冷凍液中精子的活力以及在冷凍與解凍的過程中對精子的保護力都比傳統(tǒng)的冷凍液好。用此精液對6只受體犬進行子宮內(nèi)人工受精獲得100%懷孕率。3對妊娠合并進行時間對接妊娠和分娩行為的影響開展犬的人工授精對于充分發(fā)揮優(yōu)秀種公犬的作用,提高繁殖效率具有重要意義。早在1880年,意大利生理學(xué)家Spallanzani首次用犬進行AI試驗取得成功并產(chǎn)下3只小狗。犬宮腔內(nèi)進行冷凍精液人工受精比陰道內(nèi)人工授精產(chǎn)仔率高,犬在適當?shù)臅r間進行人工受精的產(chǎn)仔率為78%(n=559;P<0.01),同胎產(chǎn)仔數(shù)約為5.8+/-0.2(P<0.05);進行兩次人工授精的產(chǎn)仔數(shù)和平均同胎產(chǎn)仔數(shù)均大于只授精一次;受體犬大于6歲比年輕犬產(chǎn)仔率低;另外精液的品質(zhì)也影響產(chǎn)仔率。Pretzer采用冷凍精液進行子宮頸內(nèi)人工授精,懷孕率為89.4%、產(chǎn)仔率為87.5%及同胎產(chǎn)仔數(shù)為6.9+/-2.7,均好于之前的研究結(jié)果。Kim等采用冷凍精液對犬分別進行子宮腔內(nèi)人工授精及陰道內(nèi)授精,結(jié)果表明,子宮腔內(nèi)人工授精懷孕率為100%而陰道內(nèi)僅為20%。上述報道表明目前子宮腔內(nèi)人工授精效果較陰道內(nèi)效果好。選擇最適時間進行人工授精對受精效率有重要影響。犬在促黃體素峰值之后24~28h卵巢排卵,此時孕酮濃度為2.12~4.06ng/mL,平均濃度:2.78ng/mL;孕酮在排卵前濃度為0.8~1.56ng/mL,平均1.12ng/mL;在排卵后濃度1.88~2.81ng/mL,平均2.34ng/mL;在孕酮濃度為2.5~10nmol/L即LH高峰之后第3天進行第1次冷凍精液人工受精,第5天進行第2次冷凍精液人工受精效果較好。Shimatsu等研究發(fā)現(xiàn)在LH峰值之后的3~7d進行自然交配可以得到較滿意的產(chǎn)仔率及同胎產(chǎn)仔數(shù),但是在LH之后第7天進行交配的母犬妊娠時間明顯長于在LH之后第3天和第5天進行交配的妊娠時間。Tsutsui在研究自然交配的母犬時發(fā)現(xiàn),子宮頸在排卵后的平均第5天關(guān)閉,在開始排卵之后的第6、7、8、9天進行子宮頸內(nèi)鮮精人工授精,懷孕率分別為100%,71.4%,37.5%和0%。此結(jié)果證實卵母細胞在成熟之后的4~5d進行子宮內(nèi)人工受精效果最好。4進行體外引引,獲得體外受精的胚胎,并在離子交叉子間沖卵犬的胚胎移植技術(shù)目前僅在實驗室研究階段,還沒有可用于生產(chǎn)上的成熟技術(shù)。這主要是由于誘導(dǎo)犬的同期發(fā)情、胚胎體外培養(yǎng)及胚胎移植技術(shù)等還不成熟,但是相關(guān)的研究一直在進行,目前已經(jīng)取得了一定進展。Kinney等報道將8個桑棋胚植入受體犬的子宮后產(chǎn)下2只幼仔。Tsutsui等報道手術(shù)采集發(fā)情后14~15d的5只供體犬28枚胚胎,將這些胚胎再分別植入5只自然發(fā)情母犬子宮內(nèi),其中有2只受體犬受孕,各自產(chǎn)下2只幼仔。Tsutsui等認為犬的胚胎移植受超數(shù)排卵和同期發(fā)情的限制成功率較低,并且比較了子宮切除法與手術(shù)沖卵法這兩種沖胚方式的胚胎回收率,前一種方法顯著高于后一種(97.1%和42.5%)且用于早期胚胎移植的胚胎應(yīng)從輸卵管中沖卵獲得,輸卵管切除術(shù)比輸卵管沖卵獲得率高(95%和28.2%)。Tsutsui等將犬原核期至8細胞期的早期胚胎移入輸卵管下游獲得成功,表明犬的輸卵管胚胎移植是可以實現(xiàn)的。采用自然同期發(fā)情的10只供體犬及13只受體犬進行子宮內(nèi)早期胚胎移植,供體犬在交配后1~4d(排卵后5~7d)輸卵管切除回收早期胚胎;在排卵之后的第5天(交配后的1~2d)收集到的是原核期和2細胞期胚胎;第6天(交配后的1~4d)收集到的是4細胞期及8細胞期胚胎;排卵之后的第7天收集到8細胞期胚胎。在受體中有一只接受了2個原核期胚胎及一個2-細胞期胚胎的犬產(chǎn)下倆只幼犬,結(jié)果顯示雖然子宮內(nèi)移入早期胚胎可以得到幼犬但成功率較低,早期胚胎移植輸卵管中較適合。Jang等報道通過耳皮膚成纖維細胞進行體細胞核移植,采用排卵后72h體內(nèi)成熟卵母細胞,重組后的克隆胚胎移入自然同步發(fā)情(排卵后72h)受體母犬輸卵管中,最后獲得了雌性幼犬。董君艷等也報道將供體胚胎沖出后移植給2只自然發(fā)情受體犬成功受孕,并產(chǎn)下3只幼仔。余道倫等對自然發(fā)情同步配種的供體畢格犬輸卵管沖卵,受體畢格犬輸卵管鮮胚移植,結(jié)果表明,在8頭受體犬中有1頭犬于手術(shù)后成功懷孕并順利產(chǎn)下1頭雄性幼犬,這是國內(nèi)首次獲得輸卵管胚胎移植成活幼犬。孫秀青等進行了犬的輸卵管和子宮角胚胎移植,結(jié)果在8只輸卵管胚胎受體犬移植中有1只犬于手術(shù)后成功懷孕并順利產(chǎn)下1頭雄性幼犬,子宮角回收法的胚胎回收率稍低于輸卵管回收法。測定母犬的排卵時間是解決和提高受精率的一個重大問題。它包括了測定正常交配時間和實施AI的準確時間,也包括了何時可以收獲犬的卵子,以便進行體外受精或是直接收獲胚胎進行胚胎移植等。Abe等對拉布拉多犬研究發(fā)現(xiàn),在LH峰值后的11d發(fā)育的胚胎開始從輸卵管向子宮內(nèi)移動,并且在24h內(nèi)完成,在LH峰值后的13d所有胚胎都進入子宮內(nèi)并且開始著床,在11~13d中發(fā)育成桑葚胚,在14d內(nèi)發(fā)育成囊胚。5開展性基因轉(zhuǎn)染在胎兒中的應(yīng)用犬的克隆技術(shù)一直面臨著兩大難題,一是體外獲得成熟卵母細胞難度很大,犬的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)率很低,這是因為犬的排卵發(fā)生在第一次減數(shù)分裂開始時,卵子要在輸卵管經(jīng)1~3d發(fā)育才至成熟。二是犬的誘導(dǎo)發(fā)情技術(shù)還不完善,獲得同期發(fā)情的供受體難度較大。因此直到2005年才獲得世界上首例克隆犬,科學(xué)家們采用的是獲得體內(nèi)成熟卵母細胞及選擇自然發(fā)情的代孕母犬,將1095個胚胎植入123頭犬體內(nèi),有3個成功受孕,其中一個流產(chǎn),另1頭小犬出生22d后因肺炎死亡,最終一只代孕的拉布拉多獵犬于60d后產(chǎn)下一頭小獵犬。Hong等采用犬胎兒成纖維細胞作為核供體進行體細胞核移植,將50個重組胚移入自然發(fā)情的供體母犬體內(nèi),最終獲得2只體細胞克隆幼犬。Hossein等研究受體犬獲得重組胚胎數(shù)對克隆犬出生率的影響發(fā)現(xiàn),移入4~10個胚胎及26~40個胚胎的7只和12只犬無懷孕現(xiàn)象;移入11~25個胚胎的17只犬懷孕率為23.53%,最終5只犬誕生。結(jié)果顯示對于供體犬移入的重構(gòu)胚胎數(shù)量影響其懷孕及產(chǎn)仔率。Jang等研究顯示將小品種犬(貴賓犬)的體細胞移入大品種犬的去核卵母細胞中也可以獲得克隆犬。說明犬的克隆可在犬的不同品種間實現(xiàn)。Hong等采用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法及胎兒成纖維細胞體細胞核移植,首次獲得了表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因犬。目前所獲