豬人工授精新技術(shù)的研究進(jìn)展

豬人工授精新技術(shù)的研究進(jìn)展

1射精過(guò)程的精子特性及影響因素體內(nèi)授精部位的精卵比例是相同的，即使在祖母懷孕之前也是如此。然而,需要非常多的精子才能使母豬成功懷孕,自然交配時(shí)公豬射入母豬子宮頸管的精子數(shù)為50×109個(gè),這么多的精子數(shù)將有助于活力較強(qiáng)的精子克服母豬子宮內(nèi)部的阻力,從而快速到達(dá)受精部位。與自然交配時(shí)精子射入的數(shù)量相比,人工授精時(shí)要想達(dá)到高的妊娠率就必須面對(duì)這樣一個(gè)問(wèn)題,即母豬獲得高妊娠率時(shí)所需的最小輸精劑量。最近在討述如何降低豬人工授精的精子劑量時(shí),主要介紹如何利用現(xiàn)有輸精技術(shù)減少授精的精子數(shù)。然而,卵母細(xì)胞受精所要求的最低精子數(shù)不僅取決于人工輸精技術(shù),而且還受其他因素的影響,它們包括精子的受精能力和母豬的身體狀況。自然交配時(shí),公豬射精后將精液儲(chǔ)存在母豬子宮頸管內(nèi),其中的精子會(huì)通過(guò)移動(dòng)迅速進(jìn)入子宮內(nèi)和子宮角。公豬一次射精的精子含量高達(dá)50×109~70×109個(gè),并帶入大量的精漿(250~400mL),以擴(kuò)張母豬的子宮和子宮角。眾所周知,由于授精后有部分精液在生殖道內(nèi)會(huì)產(chǎn)生倒流,造成25%~40%或是更多的精液浪費(fèi)掉。剩余的精液除了小部分能到達(dá)受精位點(diǎn)外,其余的均被多形核白細(xì)胞(PolyMorphonuclearLeukocyte,PMN)作為由精漿和精子引發(fā)的炎癥應(yīng)答所吞噬。中性白細(xì)胞在受精后0.5~3h進(jìn)入子宮腔內(nèi),這可能是受高水平的雌性激素刺激所致。伴隨著中性白細(xì)胞進(jìn)入子宮腔的還有巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞,但是粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞似乎粘附在子宮內(nèi)膜基質(zhì)上。損失的數(shù)十億精子很顯然不是沒(méi)有原因的,并且只有那些最終能到達(dá)卵母細(xì)胞的精子才會(huì)被接受。眾所周知,公豬每次射出的精液存在著異質(zhì)性,且通常和精子的成熟度或內(nèi)部的遺傳特性有關(guān);每次射出的精液在精子形態(tài)學(xué)、鞭毛活性等等方面都有很大差異。此外,精子進(jìn)入輸卵管很大程度上是一個(gè)選擇性的過(guò)程,這主要取決于每個(gè)精子固有的運(yùn)動(dòng)能力。由于運(yùn)動(dòng)能力是精子的特性,此特性也是選擇精子的最佳機(jī)制。能進(jìn)入輸卵管的相對(duì)精子數(shù)上的差異隨公豬的不同而不同,甚至是來(lái)自不同公豬的含有相同精子數(shù)的精液在這方面也不同。能獲得最大受精率的最小精子數(shù)不僅取決于公豬,而且也取決于授精前所用精液的操作過(guò)程。冷凍-凍融過(guò)程、流式分選操作或分期射精都會(huì)弱化精子,影響它們?cè)诖菩陨车乐械纳婺芰痛婊顣r(shí)間,因此能夠到達(dá)輸卵管的精子數(shù)要少于新鮮精液。此外,另一個(gè)縮短精子壽命的因素是精子質(zhì)膜周圍精液漿的減少,這是由于高倍稀釋所致。射精時(shí)出現(xiàn)的精漿主要影響精子的生理學(xué)特性,增強(qiáng)射精后精子的運(yùn)動(dòng)能力和膜的穩(wěn)定性。在高倍稀釋的精子中添加精漿能增強(qiáng)精子的受精能力,對(duì)精子細(xì)胞產(chǎn)生的這種有益作用可能與異質(zhì)二聚體PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ有關(guān),該物質(zhì)有利于高倍稀釋的精子保持活力、運(yùn)動(dòng)能力和線粒體的活性。天然PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ?qū)Ω弑断♂尩墓i精子功能所產(chǎn)生的有益作用主要體現(xiàn)在其獨(dú)立的PSP-Ⅱ亞單位上,并且似乎不需要其多聚糖部分。最佳受精率由受精-排卵間隔、精子受精生命期、母豬個(gè)體狀況和授精部位的綜合影響決定。母豬生殖道中儲(chǔ)存的精子越多,占據(jù)輸卵管的成活精子也就越多,因此只需較少的精液就能夠達(dá)到采用常規(guī)人工授精技術(shù)所獲得的相同受精率。所以,應(yīng)該根據(jù)精子在母豬生殖道內(nèi)儲(chǔ)存位置的狀況開(kāi)發(fā)人工授精技術(shù),而目前考慮的是其它會(huì)影響受精成功的因素。深部授精的新方法旨在使精子繞過(guò)子宮或限制精子通過(guò)子宮而直接進(jìn)入輸卵管,因而可以減少精子因噬菌作用而造成的損失,并可以避免精子的逆流。2工藝教學(xué)ai2.1標(biāo)準(zhǔn)1:傳統(tǒng)精子輸注法目前,人工授精已經(jīng)很大程度上取代了豬場(chǎng)中的自然交配,究其原因在于人工授精具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單和快捷(通常由養(yǎng)豬生產(chǎn)者自己操作)的優(yōu)點(diǎn),并且已經(jīng)成功應(yīng)用多年。對(duì)于養(yǎng)豬業(yè)來(lái)說(shuō),其較大的價(jià)值體現(xiàn)在全球每年注冊(cè)的大約有2500萬(wàn)次人工授精上。在歐洲,每年高達(dá)85%~90%的豬授精是采用人工授精的。人工授精的目的是在輸卵管中建立一個(gè)具有適當(dāng)功能的精子儲(chǔ)庫(kù),以使所有排出的卵子都能受精。該授精方法借助一根導(dǎo)管吸住子宮頸從而將精液輸入子宮頸的后部(大約為子宮頸向里15cm處)。該方法推薦利用一個(gè)大容量的導(dǎo)管輸入大量的精子(通常超過(guò)2500×106個(gè)),整個(gè)發(fā)情期輸精2~3次。此方法規(guī)定了公豬每次射精可以制成大約20~25份的輸精劑量,每頭公豬每年平均授精精液產(chǎn)量為1500份,每年大約能給700頭母豬授精。雖然當(dāng)授精的精液所含精子為2500×106個(gè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)難以滿意的結(jié)果,但利用含2000×106個(gè)精子的常規(guī)人工授精方法,再對(duì)豬群進(jìn)行科學(xué)的管理,仍能取得較高的分娩率和窩產(chǎn)仔數(shù)。此外,每份精液即使含有1000×106個(gè)精子,只要輸精時(shí)機(jī)把握恰當(dāng),并且輸精過(guò)程中精液不出現(xiàn)倒流,也能取得較好的受精率。直到目前為止,常規(guī)人工授精足以能滿足養(yǎng)豬業(yè)的需求。然而,減少可用精子和/或弱化精子細(xì)胞(即冷凍-凍融后的精子、性別分流精子、精子基因轉(zhuǎn)移、包被精子,等等)數(shù)量的新型精子技術(shù)則要求開(kāi)發(fā)新的授精技術(shù),以實(shí)現(xiàn)利用較少的精子也能取得滿意的受精率。此外,減少獲得成功受精所需的精子數(shù)量,可降低高附加值精液(即性別分流)的固定生產(chǎn)成本,促進(jìn)此類新精液生物技術(shù)的應(yīng)用。在過(guò)去的數(shù)十年里,基于輸精劑量輸入位點(diǎn)的新授精技術(shù)得到了快速的發(fā)展,并無(wú)疑受到了要求上述新精液技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)中有效應(yīng)用的推動(dòng)。此新方法使精液能夠輸入子宮內(nèi)(子宮頸后或子宮內(nèi)授精)、或深部的子宮角(深部子宮內(nèi)授精)、或輸卵管內(nèi)(腹腔鏡法人工授精)內(nèi)。2.2精子的輸注此授精方法的目的是將精液輸入母豬的子宮體內(nèi)。本世紀(jì)初,自1959年Hancock最先報(bào)道此授精方法以來(lái),多家實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)豬場(chǎng)再次興起了使用子宮頸后輸精的方法,由此表明子宮內(nèi)輸精可減少每次輸精所需的精子數(shù)和所用的精液劑量。但此方法的主要障礙是母豬子宮頸管,其特征是管內(nèi)有許多頸褶。已開(kāi)發(fā)的多個(gè)輸精設(shè)備可以使精液穿過(guò)經(jīng)產(chǎn)母豬的子宮頸,把精子直接輸送到子宮或子宮后角。大多數(shù)這類輸精設(shè)備與商用人工授精Spirette管配套使用,而后者起到類似子宮鎖一樣的功能,堵住子宮頸,防止精液倒流。這類輸精設(shè)備通常比普通導(dǎo)管長(zhǎng)15~20cm,通過(guò)Spirette管內(nèi)腔插入,隨后穿過(guò)子宮頸管向內(nèi)伸入到子宮內(nèi)。雖然有關(guān)此方法的介紹有很多種,但大多數(shù)每次輸入30mL含1000×106個(gè)精子的精液。此輸精方法最主要的優(yōu)點(diǎn)在于可以減少因精液逆流造成的精子損失,但最近有報(bào)道稱,逆流精液將占到授精精液的三分之二。Watson報(bào)道了英國(guó)于2002年首次利用子宮頸后人工授精技術(shù)進(jìn)行的大型商用性試驗(yàn)。結(jié)果表明,采用子宮頸后輸精技術(shù)進(jìn)行的3000×106、2000×106或1000×106個(gè)精子劑量輸精,所得到的產(chǎn)仔率和產(chǎn)仔數(shù)都與利用常規(guī)人工授精技術(shù)進(jìn)行的3000×106或2000×106個(gè)精子劑量輸精相同,僅在借助常規(guī)人工授精技術(shù)進(jìn)行的1000×106個(gè)精子劑量輸精時(shí),母豬的產(chǎn)仔率和產(chǎn)仔數(shù)有所下降(P<0.001)。母豬子宮頸后輸精技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、高效和安全的特點(diǎn),并且每次輸入的精子數(shù)可以減少到1000×106個(gè)。當(dāng)利用500×106個(gè)精子劑量時(shí),也可達(dá)到相同的效果。雖然本次試驗(yàn)表明,在進(jìn)行子宮頸后人工授精時(shí),向子宮直接輸入1000×106個(gè)精子可以取得良好的受精率,驗(yàn)證了公豬一次性射精可以配制成3份人工授精精液的說(shuō)法,但是相同的方法卻未能在其他豬場(chǎng)取得成功。最近在匈牙利和克羅地亞對(duì)1783頭經(jīng)產(chǎn)母豬進(jìn)行的一次生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)獲得了相似的試驗(yàn)結(jié)果,采用常規(guī)人工授精技術(shù)或子宮頸后授精技術(shù)的母豬分娩率分別達(dá)到88.1%和87.8%,但是采用子宮頸后授精技術(shù)的母豬在輸入1000×106個(gè)精子時(shí),產(chǎn)仔數(shù)明顯的下降(12.3頭∶10.2頭)。將子宮頸后授精技術(shù)的精子輸入量減少到500×106個(gè)時(shí),母豬的產(chǎn)仔率[78.0%∶88.2%(常規(guī)授精技術(shù)產(chǎn)仔率,下同)]和窩產(chǎn)仔數(shù)(9.4頭∶11.6頭)均下降。因此,豬場(chǎng)采取正確的管理措施是非常重要的。子宮頸后人工授精技術(shù)的普及率不僅不同國(guó)家各不相同,而且即使是同一個(gè)國(guó)家的不同地區(qū)也不相同。在采用本授精方法時(shí)應(yīng)特別注意要采用正確的授精技術(shù),以將對(duì)子宮頸及子宮的損傷降至最低程度,因?yàn)榘雱傂缘臄U(kuò)展型輸精管可能會(huì)損傷生殖組織。2.3宮內(nèi)深部輸精法對(duì)因子分析的影響子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)(DeepIntrauterineInsemination,DUI)是將精子輸送到較深部位的子宮角的一種方法。筆者所在實(shí)驗(yàn)室于1999年首次對(duì)本方法進(jìn)行了介紹,并在貝爾茨維爾舉辦的“公豬精液保存”大會(huì)上作了介紹。影響本技術(shù)在母豬中應(yīng)用的主要障礙是母豬生殖道復(fù)雜的解剖學(xué)特性,授精效果不僅會(huì)受母豬子宮頸部褶皺的影響(與子宮頸后輸精法相同),而且還會(huì)受子宮角的長(zhǎng)度和彎曲特性影響。最初的輸精導(dǎo)管是用改良的柔韌纖維內(nèi)窺鏡制成,其長(zhǎng)1.35m,外周直徑3.3mm,內(nèi)圈直徑1.2mm。兩年以后,筆者實(shí)驗(yàn)室根據(jù)先前所用內(nèi)窺鏡管的推進(jìn)力和靈活性,利用新的廉價(jià)設(shè)備制成了新的DUI輸精管。這種新的輸精管長(zhǎng)1.80m,外周直徑4mm,內(nèi)圈直徑1.80mm,其操作特點(diǎn)是在插入商用人工授精Spirette管(以便形成子宮鎖)后,再在Spirette管內(nèi)插入DUI輸精管,穿過(guò)子宮頸管,再向前進(jìn)入子宮和子宮角?？梢灶A(yù)測(cè)的是,DUI導(dǎo)管會(huì)造成子宮粘膜的潛在性損傷,甚至?xí)＜澳肛i今后的繁殖力。有報(bào)道指出,在當(dāng)借助柔韌纖維內(nèi)窺鏡進(jìn)行子宮內(nèi)深部輸精時(shí),可以在一些母豬的子宮內(nèi)膜壁上留下明顯的傷痕。然而,任何已經(jīng)發(fā)生的子宮內(nèi)膜損傷都不會(huì)造成母豬子宮內(nèi)部或外部的出血。進(jìn)行子宮內(nèi)深部輸精時(shí)和輸精完畢之后,母豬子宮的出血率非常低(<2%),并且與常規(guī)人工授精法相近。此外,對(duì)子宮深部輸精實(shí)施前(即常規(guī)人工授精)和實(shí)施后的繁殖性能比較后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異,由此表明子宮內(nèi)深部輸精法不會(huì)影響母豬隨后的繁殖力。因此,我們推測(cè),輸精導(dǎo)管通過(guò)子宮頸進(jìn)入子宮內(nèi)不會(huì)對(duì)子宮頸和/或子宮角產(chǎn)生明顯的傷害,并且也不會(huì)對(duì)母豬的繁殖力產(chǎn)生負(fù)面影響。然而,輸精軟導(dǎo)管可以使一側(cè)子宮角產(chǎn)生像子宮內(nèi)腔輸入大量精液后引起子宮擴(kuò)張一樣的相似作用。多項(xiàng)試驗(yàn)證實(shí),將柔韌導(dǎo)管插進(jìn)母豬一側(cè)子宮角的成功率在90%以上,每次授精大約需3~4min的時(shí)間。正如先前討論到有一次將精液輸入了一側(cè)子宮角內(nèi)。但精子能夠到達(dá)對(duì)側(cè)的輸卵管,并能使較高比例的卵母細(xì)胞受精。研究表明,精子能從授精子宮角的精液儲(chǔ)庫(kù)運(yùn)出,并且通過(guò)腹膜遷移通道送到另一側(cè)子宮角。這種假設(shè)是基于這樣一種現(xiàn)象,即雖然借助子宮內(nèi)深部輸精法輸入低劑量的精子后能在兩側(cè)輸卵管內(nèi)發(fā)現(xiàn)胚胎,但僅在一側(cè)輸卵管內(nèi)找到了精子的蹤影。我們獲得的試驗(yàn)結(jié)果充實(shí)了此假設(shè):通過(guò)腹腔鏡將母豬的兩側(cè)子宮角切斷,隨后誘導(dǎo)其發(fā)情。結(jié)果發(fā)現(xiàn),精子能夠經(jīng)腹膜(trans-peritoneal)和子宮兩種不同的途徑到達(dá)對(duì)側(cè)子宮角,并且使大部分卵母細(xì)胞受精。雖然經(jīng)腹膜途徑僅使很少部分的母豬(芻5%)懷孕,然而子宮內(nèi)途徑似乎是卵母細(xì)胞受精的主要方法(酆75%)。筆者的試驗(yàn)結(jié)果表明:與常規(guī)人工授精技術(shù)相比,子宮內(nèi)深部授精技術(shù)可利用精子密度稀釋20倍或原精液至少稀釋8~20倍的稀釋精液使人工誘變發(fā)情的斷奶母豬成功懷孕,且不會(huì)影響產(chǎn)仔率和窩產(chǎn)仔數(shù)。已有多項(xiàng)試驗(yàn)測(cè)定了非人工誘變同步發(fā)情母豬利用子宮內(nèi)深部授精技術(shù)后的繁殖性能,并對(duì)該方法能否適合商業(yè)性應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)估。第一個(gè)商業(yè)性試驗(yàn)在西班牙和美國(guó)進(jìn)行,試驗(yàn)時(shí)通過(guò)子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)給母豬輸入150×106的稀釋精子(20倍稀釋),結(jié)果采用子宮內(nèi)深部授精技術(shù)的母豬妊娠率與對(duì)照組相比并不顯著下降,大概降低2.3%~7.0%。在西班牙進(jìn)行的試驗(yàn)中,試驗(yàn)組母豬的窩產(chǎn)仔數(shù)比對(duì)照組減少1.2頭,差異不明顯;而在美國(guó)進(jìn)行的試驗(yàn)中,試驗(yàn)組母豬窩產(chǎn)仔數(shù)減少了2.4頭,差異顯著(P<0.05)。繁殖性能上的這一下降表明了經(jīng)濟(jì)效益上的一個(gè)潛在損失,并且在總的商業(yè)模式中要在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用子宮內(nèi)深部輸精法時(shí)必須加以考慮的。在實(shí)際生產(chǎn)中,利用子宮內(nèi)深部授精技術(shù)進(jìn)行150×106的稀釋精液輸精所造成的窩產(chǎn)仔數(shù)減少,與存在單側(cè)與局部?jī)蓚?cè)授精有關(guān)。在采用子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)通過(guò)5mL擴(kuò)充器輸入150×106個(gè)精子的母豬中,出現(xiàn)局部?jī)蓚?cè)和單側(cè)受精的母豬比例遠(yuǎn)高于采用常規(guī)人工授精技術(shù)輸入3000×106個(gè)精子的對(duì)照組母豬(36%,P<0.05)。同樣,在采用子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)的母豬中,與胚胎的透明帶(ZonaePellucidae,ZP)發(fā)生反應(yīng)的精子數(shù)少于采用常規(guī)人工授精技術(shù)的對(duì)照組母豬,這說(shuō)明到達(dá)精子儲(chǔ)庫(kù)的精子數(shù)很大程度上取決于授精的精子數(shù)。在同一天用同一次射精的精液進(jìn)行授精的每頭母豬在胚胎透明帶區(qū)的副精子數(shù)上也存在很大的差異,并且即使是同一頭母豬,無(wú)論采用哪種授精技術(shù),兩個(gè)子宮角在胚胎透明帶區(qū)的副精子數(shù)上間也存在著較高的差異。先前有報(bào)道稱發(fā)現(xiàn)了類似的母豬間的差異。母豬固有的特性(即子宮肌層收縮或局部吞噬作用)可能與單側(cè)受精有關(guān)。雖然筆者根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的初步研究結(jié)果,正在研究既能使母豬成功懷孕又能避免出現(xiàn)單側(cè)受精的子宮內(nèi)深部授精最小輸入精子劑量。但是,當(dāng)利用子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)給自然排卵的母豬輸入含600×106個(gè)精子的20mL精液時(shí),既沒(méi)有觀察到卵母細(xì)胞的單側(cè)受精現(xiàn)象,也沒(méi)有見(jiàn)到其局部?jī)蓚?cè)受精現(xiàn)象?？傊?相對(duì)于常規(guī)人工授精技術(shù)而言,采用子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)可以顯著減少每次輸精所需的精子數(shù),而與母豬是否為自然排卵或誘導(dǎo)排卵無(wú)關(guān)。子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)已使含有150×106~600×106個(gè)精子的稀釋精液或含1000×106個(gè)精子的冷凍-凍融精液獲得成功。另外,經(jīng)流式分選儀分選的精子借助子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)已可成功地產(chǎn)出仔豬。2.4臟器輸精的應(yīng)用當(dāng)用高附加值的精子(即性控精子或精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因精子)進(jìn)行人工授精時(shí),開(kāi)發(fā)利用超低精子數(shù)的小劑量授精技術(shù)可以提高授精效率,據(jù)認(rèn)為輸卵管內(nèi)授精能夠最大限度地減少每次輸精所需的精子數(shù)。通過(guò)剖腹技術(shù),將冷凍-凍融精子或性控精子直接輸入輸卵管,已使母豬成功妊娠。遺憾的是,剖腹技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中并不實(shí)用。與剖腹技術(shù)相比,腹腔鏡檢查技術(shù)在將精子直接輸入子宮或輸卵管時(shí)所造成的創(chuàng)傷要小小得多,通過(guò)經(jīng)過(guò)技術(shù)培訓(xùn)的人員,本技術(shù)已能夠在養(yǎng)豬場(chǎng)得到應(yīng)用。已有報(bào)道稱,腹腔鏡檢查技術(shù)已經(jīng)被用于使用低精子劑量的綿羊商業(yè)性人工輸精中。此外,通過(guò)腹腔鏡技術(shù)進(jìn)行的綿羊人工輸精是唯一不會(huì)影響受精率的子宮內(nèi)輸精的人工授精方法。就母豬而言,借助腹腔鏡檢查技術(shù)將精子輸入子宮角(接近子宮輸卵管連接處),可以在每個(gè)子宮角僅輸入10×106~20×106個(gè)精子的情況下實(shí)現(xiàn)92.3%的高受精率。但是,當(dāng)輸入的精子劑量減少到5×106時(shí),母豬妊娠率則顯著降至81.9%,這些研究結(jié)果與先前的報(bào)道相一致。在該研究中,研究人員借助剖腹技術(shù)將僅含10×106個(gè)精子的精液通過(guò)外科法授精技術(shù)輸入母豬子宮內(nèi),結(jié)果獲得了最理想的授精效果。筆者所在的實(shí)驗(yàn)室對(duì)腹腔鏡檢查技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn),以適用于母豬輸卵管內(nèi)輸精。這種改進(jìn)型技術(shù)必須麻醉的情況下進(jìn)行,操作時(shí)使母豬呈垂頭仰臥姿勢(shì),且與水平線呈20°的角度。在母豬腹部接近臍窩處切一個(gè)1.5cm長(zhǎng)的口子,向上拉起切口邊緣以對(duì)抗?fàn)恳?將一個(gè)帶有嵌入式0°腹腔鏡的12-mmOptoviw套管(EthiconEndo-surgery公司,美國(guó)俄亥俄州辛辛那提市)通過(guò)傷口插入母豬體內(nèi)。進(jìn)入腹腔以后,移走Optiview探頭,并用0°腹腔鏡取代。在腹腔內(nèi)注入CO2使壓力達(dá)到14mm汞柱。將兩個(gè)輔助端口放在半腹部左右兩邊,為腹腔鏡杜瓦爾(Duval)鉗狀骨針提供入口。用杜瓦爾鉗狀骨針?lè)謩e控制子宮角和夾緊輸卵管,使得輸精探針順利進(jìn)入。在兩個(gè)輸卵管都輸入精液后,移去套管針并進(jìn)行微創(chuàng)縫合。整個(gè)小外科手術(shù)的進(jìn)行時(shí)間要求控制在15min內(nèi)。輸卵管內(nèi)輸精的確可以將大量的精子(0.3×106~0.6×106)輸入管內(nèi)。母豬卵母細(xì)胞中的多精子受精塊要少于其他動(dòng)物,并且在體外時(shí),精子∶卵母細(xì)胞比例會(huì)影響多精子受精的卵母細(xì)胞。輸卵管內(nèi)腹腔鏡法授精的使用,預(yù)期會(huì)出現(xiàn)較高比例的多精子受精卵母細(xì)胞。因此,筆者檢測(cè)了輸入精子數(shù)(0.3×106、0.5×106和1.0×106)和相對(duì)于排卵的輸精時(shí)機(jī)(排卵前、排卵中和排卵后)對(duì)受精率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)輸入的精子數(shù)為0.3×106或是0.5×106個(gè)時(shí),多精子受精的發(fā)生率非常低。因此,利用腹腔鏡法授精技術(shù)進(jìn)行極小精子劑量的輸精時(shí),使母豬妊娠的可能性較高(圖1)。只有當(dāng)輸入的精子數(shù)為1.0×106個(gè)時(shí),多精子受精發(fā)生率才較為明顯。輸卵管的環(huán)境可對(duì)直接輸入輸卵管的精子穿透卵母細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)。筆者最近對(duì)相對(duì)于排卵的授精時(shí)間(排卵前、排卵中和排卵后)對(duì)卵母細(xì)胞的穿透和多精子受精發(fā)生率的作用進(jìn)行了評(píng)估(圖2)。雖然卵巢在輸精之前進(jìn)行了超聲波檢查,但用腹腔鏡觀察卵巢的狀態(tài)是生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的一種極好方法(圖3)。在進(jìn)行輸卵管內(nèi)輸精時(shí),當(dāng)輸入精液時(shí)母豬已經(jīng)將卵母細(xì)胞排入輸卵管,此時(shí)發(fā)生多精子受精的概率會(huì)大幅