高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定代溫灸膏中的主要藥效成分

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定代溫灸膏中的主要藥效成分

代文灸膏是一種常見的中藥橡膠膏劑。中國(guó)藥典（2010年版）將其放入成方制劑中。它由肉桂、肉桂、棗、胡椒、生姜等成分組成。具有溫經(jīng)、祛寒、鎮(zhèn)痛等功效?！?個(gè)層次多維結(jié)構(gòu)”的組分結(jié)構(gòu)理論認(rèn)為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)是由多組分構(gòu)成的整體,單一成分測(cè)定不能全面控制復(fù)方制劑質(zhì)量。代溫灸膏中肉桂活血通經(jīng),辣椒溫脈鎮(zhèn)痛,生姜解表散寒,其中多組分協(xié)同作用,共同構(gòu)成了復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)。肉桂酸和桂皮醛為肉桂及其揮發(fā)油中主要有效成分,具有解痙止痛、解熱、擴(kuò)張血管、抗菌、抗腫瘤及促進(jìn)免疫等藥理作用。辣椒中主要藥效成分為辣椒總堿,主要生物活性物質(zhì)是辣椒堿,其次是二氫辣椒堿,可緩解局部疼痛及瘙癢等癥狀。生姜中6-姜酚為其解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳的主要活性成分,用于風(fēng)寒感冒、胃寒嘔吐、寒痰咳嗽等癥。由此可知,肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿及6-姜酚是肉桂、肉桂揮發(fā)油、辣椒及生姜的代表性成分,并是各組分中起主要藥效活性的單體成分。中國(guó)藥典(2010年版)收錄了該制劑定性鑒別質(zhì)量控制指標(biāo),包括肉桂揮發(fā)油中桂皮醛和辣椒中辣椒堿的薄層色譜法。文獻(xiàn)有報(bào)道HPLC法測(cè)定制劑中相關(guān)成分的含量,而復(fù)方制劑中肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿及6-姜酚多成分同時(shí)測(cè)定未見報(bào)道,尚未建立該復(fù)方制劑中多組分、多成分、多角度的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本項(xiàng)研究建立RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定肉桂、肉桂揮發(fā)油、辣椒,生姜中5種代表性成分肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿及6-姜酚,以期此方法為代溫灸膏中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究建立條件,同時(shí)為代溫灸膏應(yīng)用和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)和參考。1儀器和試劑盒1.1超聲清洗器1200高效液相色譜儀(包括四元泵,自動(dòng)進(jìn)樣器,DAD檢測(cè)器,美國(guó)Agilent公司);KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BP-211D分析天平(德國(guó)Sartorius公司,1/10萬(wàn))。1.2藥品、化學(xué)品檢定所和6-姜酚對(duì)照品肉桂酸(110786-200503)、桂皮醛(批號(hào)110710-200212)、辣椒堿(批號(hào)110839-200403)、二氫辣椒堿(111666-200401)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,6-姜酚(批號(hào)241-200709,純度99%)購(gòu)自上海同田生物科技有限公司;甲醇、乙腈、磷酸(TEDIA,色譜純),水為超純水,其他試劑均為分析純。代溫灸膏,湖南飛鴿藥業(yè)有限公司,規(guī)格為每片4cm×4cm,批號(hào)為0906024,0906026,0907016;陰性樣品由本實(shí)驗(yàn)室自制。2線性關(guān)系考察及檢測(cè)限、穩(wěn)定性試驗(yàn)2.1溶液制備2.1.1對(duì)照品溶液精密稱取肉桂酸2.83mg、桂皮醛10.20mg、辣椒堿8.10mg、二氫辣椒堿5.08mg、6-姜酚6.56mg,置于10mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。2.1.2供試品溶液取代溫灸膏產(chǎn)品8片,除去蓋襯,剪成條狀,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇20mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)40min(2次),取出,放冷,搖勻,于25mL量瓶中定容,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,即得供試品溶液。2.1.3陰性樣品溶液按照處方比例,取缺辣椒、肉桂、生姜和肉桂油的其他藥材,按膏劑制備工藝制得陰性樣品,按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。2.2色譜條件色譜柱:AlltimaC18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-水,梯度洗脫(0~20min:乙腈35%→50%;20~40min:乙腈50%→70%);流速:1.0mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL。在此條件下肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿及6-姜酚均達(dá)到基線分離。HPLC色譜圖見圖1。2.3線性關(guān)系考察及檢測(cè)限測(cè)定精密量取“2.1.1”項(xiàng)下的溶液0.2,0.5,0.8,1.0,1.3,1.5mL,分別置于10mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得系列對(duì)照品溶液。按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20μL,以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得5個(gè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍,見表1。精密稱取5種化合物適量,以甲醇制成0.100mg·mL-1的溶液,用甲醇逐級(jí)稀釋,進(jìn)樣,按3倍信噪比計(jì)算肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿及6-姜酚檢測(cè)限,結(jié)果分別為0.2,0.2,0.2,0.1,0.02ng。2.4精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液(肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿、6-姜酚質(zhì)量濃度分別為0.0283,0.1020,0.0810,0.0508,0.0656mg·mL-1)20μL,按“2.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定其峰面積,計(jì)算肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿、6-姜酚的RSD分別為0.79%,0.98%,0.50%,0.68%,0.55%。表明儀器精密度良好。2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于室溫放置,在同一天0,1,2,4,6,8h分別進(jìn)樣20μL,計(jì)算肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿、6-姜酚峰面積的RSD分別為1.1%,1.8%,1.6%,1.5%,1.7%。2.6重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為0906024的樣品6份,每份8片,按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作,制備6份供試品溶液,每份精密吸取20μL進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿、6-姜酚含量平均值(n=6)分別為22.73,434.1,311.1,148.9,241.9μg·片-1;RSD分別為1.8%,1.8%,1.3%,1.4%,2.0%。表明該方法重復(fù)性良好。2.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取批號(hào)為0906024的樣品4片共6份,分別加入“2.1.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液0.5mL,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液,按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣20μL,計(jì)算回收率。結(jié)果肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿及6-姜酚的平均回收率(n=6)分別為98.2%,100.0%,99.2%,99.1%,100.1%;RSD分別為1.4%,1.0%,1.1%,1.2%,1.0%。2.9樣品含量測(cè)定取3批代溫灸膏樣品各8片,按“2.1.2”項(xiàng)下方法,每批樣品平行制備供試品溶液3份。精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液20μL、各供試品溶液20μL,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算各樣品中肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿、二氫辣椒堿和6-姜酚含量,見表2。3討論3.1超聲提取和熱回流提取比較代溫灸膏中桂皮醛、6-姜酚比較穩(wěn)定,但具有揮發(fā)性,用蒸餾或加熱回流提取的方法提取時(shí)二者會(huì)大量丟失,造成含量測(cè)定結(jié)果偏低。預(yù)實(shí)驗(yàn)采用加熱回流和超聲提取方法進(jìn)行比較,結(jié)果超聲提取方法提取樣品中易揮發(fā)性成分含量較高,其他成分也無(wú)影響。選擇不同溶劑(甲醇,70%甲醇水溶液,乙醇,70%乙醇水溶液)、不同提取時(shí)間(30,40,50min)進(jìn)行提取,結(jié)果70%甲醇水溶液、超聲40min(2次)提取率最高。本法選擇樣品8片(4cm×4cm),70%甲醇水溶液20mL,超聲提取40min(2次),最后定容至25mL量瓶中備用。3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定對(duì)對(duì)照品溶液的紫外波長(zhǎng)掃描顯示,肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿,二氫辣椒堿及6-姜酚的最大吸收波長(zhǎng)分別為274,290,280,280,275nm,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在280nm所檢測(cè)的各峰分離度及峰形均佳,靈敏度也較高,所以檢測(cè)波長(zhǎng)選擇280nm。3.3中性劑的選擇本研究比較了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流動(dòng)相體系,經(jīng)多次試驗(yàn)選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液,并調(diào)整洗脫程序。最終在乙腈-0.1%磷酸水溶液組成的系統(tǒng),以本研究中的梯度洗脫程序來(lái)分離樣品中肉桂酸、桂皮醛、辣椒堿,二氫辣椒堿及6-姜酚5個(gè)成分的分離效果、保留時(shí)間及理論塔板數(shù)均較為理想,所得色譜峰形對(duì)稱,該法準(zhǔn)確、可靠,重復(fù)性好。3.4質(zhì)量指標(biāo)選擇難代溫灸