培養(yǎng)條件對大腸桿菌的生長

培養(yǎng)條件對大腸桿菌的生長摘要大腸桿菌（Escherichiacoli，E.coli）是微生物學(xué)和遺傳學(xué)常用的實驗材料，為單細(xì)胞原核生物，寬約0.5×1～3微米；具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁；周身具鞭毛，能運動。大腸桿菌是在人和動物腸道中生活的、不會致病的正常棲居菌，但若進(jìn)入膽囊、膀胱等處也會引起炎癥。它能利用多種糖類物質(zhì)產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，其代謝類型為異養(yǎng)兼性厭氧型；其代謝活動能產(chǎn)生大腸桿菌素（抑制腸道內(nèi)其他分解蛋白質(zhì)的微生物生長），還能合成維生素B和K。它們在腸道中大量繁殖，幾乎占糞便干重的1/3。實驗室中用于培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)稱為培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為：液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。將已知的菌種引入新配制的培養(yǎng)基的過程稱為接種。而在固體培養(yǎng)基表面用蘸有菌種的接種環(huán)連續(xù)劃線，既可以達(dá)到接種的目的，又可以實現(xiàn)分離菌種的目的。這是因為劃線過程中接種環(huán)與培養(yǎng)基表面接觸，接種環(huán)上的菌液逐漸減少，因此劃線最后部分細(xì)菌間的距離加大，經(jīng)過培養(yǎng)后可出現(xiàn)由單個細(xì)菌細(xì)胞形成單菌落，這樣就達(dá)到了分離細(xì)菌的目的。關(guān)鍵詞：培養(yǎng)條件；大腸桿菌；生長目錄1前言 前言大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)為革蘭氏陰性短桿菌，又稱腸埃希氏菌。大腸桿菌是人和許多動物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌，周身鞭毛，能運動，無芽孢。主要生活在大腸內(nèi)。大腸桿菌革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴，其代謝活動能抑制腸道內(nèi)分解蛋白質(zhì)的微生物生長，減少蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物對人體的危害，還能合成維生素B和K，以及有殺菌作用的大腸桿菌素。正常棲居條件下不致病。但若進(jìn)入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在腸道中大量繁殖，幾占糞便干重的1/3。兼性厭氧菌。在環(huán)境衛(wèi)生不良的情況下，常隨糞便散布在周圍環(huán)境中。若在水和食品中檢出此菌，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)，從而可能有腸道病原菌的存在。因此，大腸菌群數(shù)（或大腸菌值）常作為飲水和食物（或藥物）的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)菌體抗原的不同，可將大腸桿菌分為150多型，其中有16個血清型為致病性大腸桿菌，常引起流行性嬰兒腹泄和成人肋膜炎。大腸桿菌是研究微生物遺傳的重要材料，如局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)就是1954年在大腸桿菌K12菌株中發(fā)現(xiàn)的。培養(yǎng)基中加入伊紅美藍(lán)遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否存在。在不致病的情況下（正常狀況下），可認(rèn)為是互利共生（一般高中階段認(rèn)為是這種關(guān)系）；在致病的情況下，可認(rèn)為是寄生。它的基因組DNA為擬核中的一個環(huán)狀分子。同時可以有多個環(huán)狀質(zhì)粒DNA。大腸桿菌是研究微生物遺傳的重要材料。大腸桿菌是細(xì)菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，只含有核糖體簡單的細(xì)胞器，沒有細(xì)胞核有擬核；大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運載體。作為外源基因表達(dá)的宿主，大腸桿菌遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡單，培養(yǎng)條件簡單，繁殖迅速，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達(dá)體系，常做高效表達(dá)的首選體系，是生物學(xué)上重要的實驗材料。實驗室中用于培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)稱為培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為：液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。將已知的菌種引入新配制的培養(yǎng)基的過程稱為接種。而在固體培養(yǎng)基表面用蘸有菌種的接種環(huán)連續(xù)劃線，既可以達(dá)到接種的目的，又可以實現(xiàn)分離菌種的目的。這是因為劃線過程中接種環(huán)與培養(yǎng)基表面接觸，接種環(huán)上的菌液逐漸減少，因此劃線最后部分細(xì)菌間的距離加大，經(jīng)過培養(yǎng)后可出現(xiàn)由單個細(xì)菌細(xì)胞形成單菌落，這樣就達(dá)到了分離細(xì)菌的目的。2材料與方法2.1菌種處于安全考慮，工業(yè)生產(chǎn)用的菌株是在生物工程技術(shù)不斷篩選后被挑選出的菌株。這些菌株失去了細(xì)胞壁的重要組分，在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。這樣，即便由于操作不慎導(dǎo)致活菌從實驗室流出，也不易導(dǎo)致生化危機。發(fā)酵用菌種的篩選:用LB液體培養(yǎng)基鋪平皿,接種,30℃培養(yǎng)18h,挑單菌落接種于含5mlLB培養(yǎng)基(50μg/ml氨卞西林鈉)的試管中,30℃培養(yǎng)至OD600nm為0.4-0.6,升溫至42℃,培養(yǎng)3h,離心收集菌體,SDS檢測,選取表達(dá)量最高的克隆菌作為發(fā)酵用菌種?；蚬こ叹鸀榇竽c桿菌DH5α/pBV220。2.2試劑氯化鈉、氫氧化鈉、工業(yè)消泡劑、甘油、硫酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、無水硫酸鎂、酵母粉和蛋白胨、瓊脂等。2.3培養(yǎng)基及組成成分添加發(fā)酵大腸桿菌所需培養(yǎng)基包括種子罐培養(yǎng)基,發(fā)酵罐培養(yǎng)基（以種子培養(yǎng)基為基質(zhì),再添加適量營養(yǎng)成分、無機鹽和微量元素）。微生物生命活動過程中需要的化合物有碳源、氮源、生長因子、無機鹽和水。在提供上述幾種主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。每1L配制好的微量元素溶液中含有FeCl3·6H2O3.24g,ZnCl20.22g,CoCl2·6H2O0.24g,NaMoO4·2H2O0.24g,CaCl2·2H2O0.12g,CuSO4·5H2O0.20g,H3BO31.00g,MgSO40.74g及62mLw=38%的鹽酸溶液。取130μL上述微量元素溶液及4μL25g/L的維生素溶液,將其一起加入到100mL的培養(yǎng)基中。2.4培養(yǎng)方法從菌種選擇方面進(jìn)行研究。工業(yè)生產(chǎn)用的菌株是在生物工程技術(shù)不斷篩選后被挑選出的菌株。選取表達(dá)量最高的克隆菌作為發(fā)酵用菌種，基因工程菌為大腸桿菌DH5α/pBV220。一般用LB液體培養(yǎng)基來擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌。準(zhǔn)確稱取各成分。配置LB固體培養(yǎng)基時還需要加入瓊脂。在250ml三角瓶和500ml三角瓶中分別裝入30ml和230mlLB液體培養(yǎng)基。將三角瓶用6層紗布包住瓶口，再用牛皮紙包好，放入滅菌柜內(nèi)，121℃液體程序滅菌20min。2.4.1種子罐培養(yǎng)將一級種子接種于10L種子罐培養(yǎng)基(含Amp0.1g/mL)中，通氣量為50L/min,攪拌速度為200-1000r/min,當(dāng)培養(yǎng)至菌體光密度達(dá)到所需要求時,升溫至42℃,誘導(dǎo)表達(dá)一定時間。發(fā)酵中加入一定比例的工業(yè)消泡劑消除泡沫，以防泡沫過多，影響發(fā)酵。在接種前取樣一次,并將此樣品作為比色測定的參比溶液。接種后每隔30min取樣一次,測菌體光密度,最后取2mL發(fā)酵終止液進(jìn)行離心,測定菌體光密度、菌體濕重、菌體干重和rhG-CSF的表達(dá)量。2.4.2搖瓶發(fā)酵將在-70℃的甘油管中凍存的基因工程菌（大腸桿菌）菌種接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中,所有培養(yǎng)基均含氨芐西林鈉(Amp)0.1g/mL。將培養(yǎng)液在37.5℃,200r/min的搖床條件下培養(yǎng)17-18小時,取出，放于潔凈密閉工作臺中。手消毒后點燃酒精燈，于工作臺中吸取2mL菌液，再接種于裝有230mlLB液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中。將培養(yǎng)液放入搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌體光密度達(dá)到所需要求后,將其作為一級種子。3培養(yǎng)條件對工程菌的生長影響3.1實驗數(shù)據(jù)3.1.1溶解氧的測定按照4％接種量接人液體大腸桿菌種子液，37.5℃，200r／min，在pH7.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并以不同的通氣量，使溶氧指數(shù)達(dá)到20％、30％、40％、50％、60％、70%，18h后取菌液測定菌體密度。每個處理設(shè)3個重復(fù)。3.1.2培養(yǎng)溫度的測定在LB液體培養(yǎng)基中，按4％的接種量，30～40℃，200r／min，溶氧量50％，在pH7.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，取菌液測定菌體密度。每個處理設(shè)3個重復(fù)。3.1.3接種量的測定按照不同的接種量1％、2％、3％、4％、5％，接種于10L發(fā)酵罐中，在37.5℃，200r／min，溶氧量50％，pH7.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，18h取菌液測定菌體密度。每個處理設(shè)3個重復(fù)。3.1.4pH值的測定以35mol／L的Na2HPO4-NaH2PO4為緩沖液，將培養(yǎng)基分別調(diào)至pH6.0～8.5，4％的接種量，37.5℃，200r／min，溶氧量50％，培養(yǎng)18h后測定菌體密度。每個處理設(shè)3個重復(fù)。3.1.5轉(zhuǎn)速的測定按4％接種量接入含LB培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，在100～300r／min，自動控制pH7.5，溶氧量50％，pH7.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37.5℃培養(yǎng)18h后測定菌體密度。每個處理設(shè)3個重復(fù)。3.1.6培養(yǎng)時間的測定按4％接種量接入含LB培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，37.5℃，在培養(yǎng)過程中自動控制pH7.5，溶氧量50％，200r／min，培養(yǎng)10h后每隔2h測定菌體密度。每個處理設(shè)3個重復(fù)。3.1.7工程菌的生長時間及誘導(dǎo)時機在選定的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下,將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,測定工程菌在37.5℃時的生長曲線，觀察工程菌生長和rhG-CSF的表達(dá)。實驗同時還比較不同的誘導(dǎo)時機對工程菌生長和rhG-CSF表達(dá)的影響。3.2結(jié)果與分析3.2.1溶氧量對菌體生長的影響溶氧量的優(yōu)化根據(jù)發(fā)酵罐中不同的溶氧指數(shù)，得到培養(yǎng)18h時發(fā)酵體系的菌體密度。結(jié)果表明，菌體密度隨著在溶氧指數(shù)的增加而不斷增加，但在50％以后菌體密度增加緩慢。3.2.2培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響培養(yǎng)溫度優(yōu)化在35～40℃范圍內(nèi)菌體密度隨溫度的升高而升高，這符合大腸桿菌的生長特性。但在37～38℃時增長速度較快，隨后的增長比較平緩。結(jié)合大腸桿菌的一般培養(yǎng)特性和溫度與其他影響因素間的交叉影響，本試驗中設(shè)定培養(yǎng)溫度為37.5℃。3.2.3接種量對菌體生長的影響接種量的優(yōu)化不同的接種量可以對細(xì)菌的生長產(chǎn)生較大影響，3％～4％時，細(xì)菌的生長狀態(tài)優(yōu)于過低或高的接種量，過低的接種量會使菌體生長過慢而過高的接種量會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)早期大量消耗，并且會造成種子菌株的浪費。所以本試驗中采用4％的接種量。3.2.4pH值對菌體生長的影響pH值優(yōu)化利用不同pH值的培養(yǎng)基對大腸桿菌培養(yǎng)18h后，結(jié)果顯示。pH值在8.0時對菌體密度沒有很大影響，而pH值過低或過高均達(dá)不到良好的效果。pH值在7.5時所得到的菌體密度相對最高，其OD600nm達(dá)到3.25。3.2.5轉(zhuǎn)速對菌體生長的影響搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)化隨著溶氧量增大菌體密度相應(yīng)提高。在100～200r／min時菌體密度增長速度較快，200～300r／min時增長相對緩慢，說明200r／min的轉(zhuǎn)速已經(jīng)可以促進(jìn)空氣中氧的溶解。考慮到轉(zhuǎn)速的增加可能會產(chǎn)生泡沫等不利影響，所以，本試驗中所采取的最佳轉(zhuǎn)速為200r／min。在選定的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下,將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,測定的工程菌在37.5℃時的生長曲線如圖1所示。圖1工程菌間歇培養(yǎng)的生長曲線由圖1知,接種后菌體數(shù)量并不是立即增長，而是經(jīng)歷了1h左右的延遲期，這可能是由于菌體為適應(yīng)新的環(huán)境，誘導(dǎo)出了新的代謝途徑。之后菌體迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，生長大約18h后菌體光密度OD600nm最高可達(dá)22.0。在對數(shù)生長末期，營養(yǎng)物質(zhì)大多已被消耗，并且積累了抑制菌體生長的代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)體系中菌體數(shù)目的增長逐漸停滯，生長進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。實驗同時還比較了不同的誘導(dǎo)時機對工程菌生長和rhG-CSF表達(dá)的影響(表1)。表1誘導(dǎo)時機對工程菌生長和rhG-CSF表達(dá)的影響誘導(dǎo)時機D600菌體光密度D600菌體干重/(g?L-1)rhG-CSF表達(dá)量/%1.044.763.0923.52.077.775.5727.92.528.465.5829.33.1210.926.2530.43.4810.926.1535.94.4111.346.7137.75.0612.396.8930.9綜合考慮菌體生物量和rhG-CSF的表達(dá)量，為使rhG-CSF的產(chǎn)量最高，應(yīng)選擇在菌體光密度OD600nm≈4.5時對菌體進(jìn)行誘導(dǎo)，此時可得到較高的菌體干重，同時rhG-CSF的表達(dá)量也較高。3.2.6培養(yǎng)時間對菌體生長的影響優(yōu)化不同培養(yǎng)時間的結(jié)果顯示，12～18h細(xì)菌呈倍數(shù)增長，之后的增長緩慢。表明指數(shù)生長后期，細(xì)菌的能量已不適于大量繁殖，而是受代謝產(chǎn)物的影響。因此，為了縮短生長周期，細(xì)菌的收獲應(yīng)在指數(shù)生長后期，即18h為宜。通過試驗我們得到了大腸桿菌在10L發(fā)酵罐培養(yǎng)的最佳營養(yǎng)條件和最佳環(huán)境條件。從工業(yè)要求的角度，同時在遵循藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)原則、有效利用現(xiàn)有的設(shè)備達(dá)到預(yù)期生產(chǎn)規(guī)模的前提下，將在10L發(fā)酵罐中獲得的最佳發(fā)酵條件，應(yīng)用于200L發(fā)酵罐進(jìn)行生產(chǎn)試驗。結(jié)果顯示，大腸桿菌DH5α/pBV220經(jīng)高密度發(fā)酵后的菌體濃度可以達(dá)到12.94g／L，這不僅為其規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，也在GMP原則的指導(dǎo)下探索到了一套標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)工藝，使大腸桿菌的發(fā)酵更簡便、快捷、操作性更強，并具備進(jìn)一步工業(yè)化研究的潛力。在試驗中得到培養(yǎng)20h時細(xì)菌的密度依然呈上升趨勢，并明顯高于18h時，然而由于隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)菌會不斷地衰老死亡，活菌比例不斷減少，導(dǎo)致所得產(chǎn)物的免疫原性受到一定的影響。所以認(rèn)為，在進(jìn)行大腸桿菌高密度發(fā)酵時，控制培養(yǎng)時間在18h是比較合適的。溶解氧是影響細(xì)菌發(fā)酵的重要因素之一。溶氧指數(shù)是指測得水體的溶氧量與監(jiān)測水體有相同水溫和鹽度時的飽和溶氧量之比。本試驗采取連續(xù)流加，即補料前通過轉(zhuǎn)速和通氣量將溶氧控制點設(shè)定在50％。發(fā)酵后開始補料并通過控制補料、轉(zhuǎn)速和通氣量將溶解氧維持在50％。結(jié)果顯示，將壓縮空氣的通氣流量控制在5m／h，可以維持發(fā)酵系統(tǒng)50％的溶氧指數(shù)。另外，細(xì)菌快速生長期補加10％～20％的水，可以改變發(fā)酵液流變學(xué)性質(zhì)，增加氧的傳遞、提高攝氧率，從而利于發(fā)酵進(jìn)行。利用攪拌的方法可以有效加速氧的溶解，控制適宜的pH和培養(yǎng)基的溶氧指數(shù)。但過高的轉(zhuǎn)速會產(chǎn)生大量的泡沫，反而會導(dǎo)致溶氧濃度的降低。結(jié)論目前國內(nèi)外對大腸桿菌的腸毒素和內(nèi)毒素的研究，以及基因工程苗的應(yīng)用已相當(dāng)廣泛。對毒素的表達(dá)基因序列的研究測定；毒力因子的檢測；耐熱性腸毒素的生化及特性鑒定；毒素和菌體感染對體內(nèi)生物酶活性、血液中微量元素的動力學(xué)變化，以及免疫器官中微量元素動力學(xué)研究；用表達(dá)產(chǎn)腸毒素的基因和粘著素基因探針技術(shù)對產(chǎn)腸毒素和粘著素大腸桿菌的檢測；重組DNA疫苗、能產(chǎn)生IGA和IGM腸道菌苗的免疫學(xué)研究；基因構(gòu)建技術(shù)對志賀樣毒素進(jìn)行表達(dá)和基因序列研究；質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗藥性的產(chǎn)生研究；基因位點誘導(dǎo)突變的研究都比較深入。對大腸桿菌病的最終研究方向是生產(chǎn)一種可以對大部分的大腸桿菌有免疫保護(hù)的基因工程苗，以及利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)人類所需的基因工程產(chǎn)品。參考文獻(xiàn)[1]楊守深，曾雪花，林敏，王佳慧，曾曉菲，邱敏華，許慧婷，謝隱華，楊小燕.豬源大腸桿菌耐藥性及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶流行性分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2019，35（01）：45-50.[2]曹少謙，南楠，袁勇軍，戚向陽.枯草芽孢桿菌發(fā)酵提取物對大腸桿菌的抑制作用[