核酸等溫?cái)U(kuò)增

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用1編輯ppt核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)2編輯ppt核酸等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢(shì)3編輯ppt核酸等溫?cái)U(kuò)增的種類4編輯ppt環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)〔LAMP〕5編輯pptLAMP引物設(shè)計(jì)原那么6編輯pptLAMP擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)7編輯pptLAMP擴(kuò)增過程8編輯ppt9編輯ppt環(huán)引物在莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)狀結(jié)構(gòu)處識(shí)別并不斷延伸，使雙鏈過早翻開，有利于復(fù)雜莖環(huán)結(jié)構(gòu)的成環(huán)和外引物置換作用。這一定程度上加速了整個(gè)LAMP擴(kuò)增循環(huán)階段的反響。10編輯pptLAMP的操作過程11編輯ppt檢測(cè)方法12編輯pptLAMP技術(shù)在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用13編輯ppt14編輯pptLAMP技術(shù)小結(jié)15編輯pptLAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)16編輯ppt存在缺陷所識(shí)別的靶位序列長(zhǎng)度不得過大，一般在300bp以內(nèi)。因此，無法進(jìn)行長(zhǎng)片段DNA的擴(kuò)增；LAMP技術(shù)具備高靈敏度，對(duì)操作要求嚴(yán)格分區(qū)，否那么極易受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；LAMP的反響結(jié)果只有兩種即擴(kuò)增與不擴(kuò)增，故在產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增時(shí)是難以進(jìn)行后續(xù)鑒定的；產(chǎn)物相當(dāng)復(fù)雜，無法進(jìn)行后續(xù)的回收、鑒定、克隆等基因工程操作。17編輯ppt18編輯ppt19編輯ppt20編輯ppt21編輯ppt22編輯pptNASBA的優(yōu)缺點(diǎn)NASBA是種RNA擴(kuò)增法，因此其主要應(yīng)用是對(duì)RNA病毒的檢測(cè)。整個(gè)反響能在42℃條件下進(jìn)行，經(jīng)過兩個(gè)小時(shí)的擴(kuò)增可將模板RNA放大至109~1010倍。靈敏度高、特異性強(qiáng)、保真度高。反響成分復(fù)雜、需要三種酶導(dǎo)致本錢偏高、須重復(fù)參加逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶。23編輯ppt滾環(huán)放大(rolling

circleamplification,RCA)技術(shù)基于滾環(huán)只有在單鏈閉合狀態(tài)并有相應(yīng)引物存在下才能同溫滾動(dòng)復(fù)制的原理?；谶B接酶連接、引物延伸與鏈置換擴(kuò)增反響的一種等溫核酸擴(kuò)增方法。在恒溫的條件下,可以產(chǎn)生大量的與環(huán)型探針互補(bǔ)的重復(fù)序列。RCA反響體系組成：噬菌體φ29DNA聚合酶、單鏈環(huán)狀DNA模板和引物〔一條或一對(duì)也可多條〕。噬菌體φ29DNA聚合酶具備很強(qiáng)的鏈置換活性，無需模板別離，酶性穩(wěn)定，可連續(xù)數(shù)小時(shí)高效催化合成DNA。24編輯pptRCA的擴(kuò)增原理25編輯pptSAT技術(shù)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)〔SimultaneousAmplificationandTesting，簡(jiǎn)稱SAT〕是將新一代的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、低污染、反響穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸〔RNA〕的一個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)〔100～1000個(gè)〕RNA拷貝；每一個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，實(shí)時(shí)反映擴(kuò)增循環(huán)情況。26編輯pptSAT技術(shù)的原理SAT技術(shù)〔SimultaneousAmplificationandTesting〕是基于TMA〔Transcriptionmediatedamplification〕恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開展起來的一項(xiàng)最新核酸檢測(cè)技術(shù)，是國(guó)內(nèi)企業(yè)自主研發(fā)的專利技術(shù)27編輯pptSAT技術(shù)的優(yōu)勢(shì)針對(duì)靶標(biāo)核酸特異設(shè)計(jì)的引物和分子信標(biāo)，實(shí)現(xiàn)特異性的擴(kuò)增和檢測(cè)，有效防止假陰性結(jié)果。

SAT檢測(cè)的靶標(biāo)核酸是RNA，而RNA在病原體外的環(huán)境中易降解，檢測(cè)結(jié)果可作為區(qū)分死菌、活菌的依據(jù)，因此更利于用藥之后療效的監(jiān)測(cè)和判愈。

SAT技術(shù)的高靈敏度、高特異性那么可以最大程度地確保檢測(cè)結(jié)果的高度準(zhǔn)確，高度可靠，有效防止假陽性、假陰性結(jié)果。28編輯pptIMSA擴(kuò)增29編輯pptIMSA擴(kuò)增的原理30編輯pptIMSA擴(kuò)增的原理31編輯ppt32編輯ppt33編輯ppt34編輯pptIMSA擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)IMSA不僅擁有LAMP檢測(cè)技術(shù)類似的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)，在引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增原理上還具有其獨(dú)有的特點(diǎn)，使得其具備比LAMP更高檢測(cè)靈敏度的潛力。該技術(shù)一定程度上能打破日本LAMP專利在我國(guó)的應(yīng)用限制，使其更好地效勞于我國(guó)的傳染病防控、食品平安檢測(cè)和環(huán)境物種保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域。35編輯pptRPA技術(shù)36編輯pptRPA〔recombinasepolymeraseamplification〕技術(shù)，2006年由劍橋大學(xué)的OlafPiepenburg等人建立。該技術(shù)利用一種重組酶使單鏈引物與雙鏈DNA模板中互補(bǔ)片段結(jié)合，啟動(dòng)DNA復(fù)制；不需要DNA解鏈過程。其具有便攜，免去PCR儀等大型實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的使用；快速，20分鐘內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果；靈敏度高，幾個(gè)拷貝即可檢出；便于保藏，采用凍干粉末狀酶等優(yōu)點(diǎn)。近年來，各國(guó)學(xué)者陸續(xù)利用RPA技術(shù)，對(duì)于DNA病毒、細(xì)菌等進(jìn)行核酸檢測(cè)。RPA技術(shù)簡(jiǎn)介37編輯pptRPA的原理38編輯ppttetrahydrofuranabasic–sitemimic(THF)四氫呋喃非堿基位點(diǎn)類似物39編輯ppt40編輯pptBasicRPAexoRPA