中藥復方對慢性約束性應激大鼠海馬中總rna的影響

中藥復方對慢性約束性應激大鼠海馬中總rna的影響

根據(jù)研究數(shù)據(jù)，內(nèi)源性氨基酸廣泛參與靶場的調(diào)節(jié)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫球蛋白之間發(fā)揮重要作用。在前一種實驗中，作者發(fā)現(xiàn)在適當?shù)倪m應過程中，身體的免疫功能顯著降低。本實驗對其發(fā)生的機理進行深入研究,旨在揭示慢性束縛應激產(chǎn)生的機理,以及中藥復方抗慢性束縛性應激的機理。材料和方法1.動物和綜合體、實驗中的中藥、模型方法和統(tǒng)計學處理參見已發(fā)表論文。2.試劑和機器2.1生物酶活性的研究TRIZOLReagent(Gibcol公司)、DEPC(Sigma),DNA分子量Marker(DL2000,Takara),λ/DNAHindⅢMarker(華美生物工程公司),TaqDNAPolymerase、dNTP(Promega),RT-PCR試劑盒(北京鼎國生物技術有限公司),氯仿、異丙醇(國產(chǎn)分析純)。2.2主要的檢測儀器2Κ15高速低溫冷凍離心機、SEM-320型電泳儀、PCR儀、DF-C恒壓恒流電泳儀、臺式培養(yǎng)箱、恒溫搖床、8823A型紫外檢測儀、組織研磨器、FIT-5000凝膠圖像分析系統(tǒng)。3.實驗方法3.1rna的提取RNA的提取和含量的測定造模結(jié)束后,立即將大鼠斷頭處死。在冰盤上取雙側(cè)海馬。100mg海馬組織中加入1ml預冷的TR-IZOL,在組織研磨器中充分研磨,冰上放置5min。按說明書方法提取RNA。取約2μl總RNA樣品,在1%瓊脂糖,TAE緩沖系統(tǒng)中進行電泳。電泳條件為:恒壓100V,電泳約20min。凝膠成像系統(tǒng)下觀察28S、18S、5S條帶的情況。取出適量RNA樣品稀釋成一定倍數(shù)(10或20倍),應用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。根據(jù)A260的值計算RNA濃度,并根據(jù)A260/A280比值計算其純度,要求為1.8～2.0,比值低于1.7者棄去。3.2半定量pcr檢測根據(jù)Genebank的序列,用Primer5.0軟件分別設計了β-actin、腦啡肽(enkephalin,Enk)和前強啡肽(prodynorphin,Prod)的引物,由三博遠志生物技術公司合成。其中β-actin作為半定量PCR的內(nèi)參照。引物序列如下:(1)β-actin:上游引物:5ue78d-CATCTCTT-GCTCGAAGTCCA-3ue78d,下游引物:5ue78d-ATCATGTTT-GAGACCTTCAACA-3ue78d;(2)Enk:上游引物:5ue78d-ATG-GCGTTCCTGAGACT-TTGA-3ue78d,下游引物:5ue78d-TAGAGTTTTGGCGTATTT-CGGAGGC-3ue78d;(3)Prod:上游引物:5ue78d-ATGGCGTGGTCCAGGCTGATGC-3ue78d,下游引物:5ue78d-AGTTTGTAGATTTAGAAGCCTTATCC-3ue78d。分別擴增Enk基因(810bp)、Prod基因(747bp)。3.3反向轉(zhuǎn)移反應3.4礦物油pcr反應PCR反應:取等量的RT-PCR產(chǎn)物,分別擴增β-actin、Enk和Prod基因。(1)50μl反應體系包括:RT反應產(chǎn)物6μl,10×PCRBuffer4.5μl,dNTP(10mmol/L)1μl,SensePrimer(Enk或Prod)1μl(50pmol),AntisensePrimer(Enk或Prod)1μl(50pmol),TaqDNA聚合酶1μl,DEPC-ddH2O35.5μl。同時,將Enk或Prod的引物換為β-actin的引物,其它反應體系與上述相同進行PCR反應。(2)混勻后離心,加入50μl輕質(zhì)礦物油進行PCR反應。反應條件為:94℃預變性3min;94℃40s;52℃45s,72℃45s,進行30個循環(huán);之后72℃再延伸15min。(3)PCR反應結(jié)束后,取10μl的PCR產(chǎn)物,同時選用DL2000核酸分子量Marker在1%瓊脂糖凝膠上電泳,恒壓100V,電泳約20min,以使產(chǎn)物充分分離,觀察目的DNA的大小。3.5瓊脂糖凝膠的圖像分析PCR反應產(chǎn)物20μl進行核酸電泳,對經(jīng)過電泳之后的1%瓊脂糖凝膠用FIT-5000凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描分析,以在組織中表達穩(wěn)定的β-actin條帶作為內(nèi)參照,用目的基因的光密度與內(nèi)參照條帶的光密度的比值為半定量分析數(shù)據(jù)。結(jié)果1.總氮電泳的結(jié)果2.各組enkmrna表達水平的比較由表1可見,7天模型組大鼠海馬的ProdmR-NA的表達水平明顯升高,與正常對照組比較P<0.01,EnkmRNA含量雖也有上升,但是與正常對照組比較無統(tǒng)計學意義。21天模型組的EnkmR-NA、ProdmRNA的表達水平都比正常對照組和7天模型組有明顯的升高(P<0.01)。逍遙散組和四君子湯組的EnkmRNA的表達水平較21天模型組有顯著降低(P均<0.01),金匱腎氣丸組的EnkmRNA表達水平雖然較21天模型組有所降低,但是沒有統(tǒng)計學差異。三個用藥組都能不同程度地降低海馬中ProdmRNA的表達,與21天模型組相比P均<0.01。逍遙散組的EnkmRNA和ProdmRNA的表達水平明顯比金匱腎氣丸組低(P<0.05,P<0.01)。腦啡肽對海馬免疫功能的抑制作用內(nèi)源性阿片肽是在哺乳動物腦中天然生成的具有阿片樣作用的物質(zhì)的一種,主要分為腦啡肽家族、內(nèi)啡肽家族和強啡肽家族。有研究資料表明內(nèi)源性阿片肽廣泛參與應激的調(diào)節(jié),并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間起著重要的調(diào)節(jié)作用。作為內(nèi)源性阿片肽的一種,腦啡肽在腦內(nèi)分布廣泛,它生成和釋放后,通過內(nèi)阿片肽受體發(fā)揮一系列作用,除了鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)心血管、呼吸和體溫外,還有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,對正常狀態(tài)下和應激狀態(tài)下的機體免疫功能都有一定的影響。研究表明腦啡肽中的甲硫腦啡肽和亮腦啡肽都可影響正常人T淋巴細胞活性、花環(huán)形成率及自然殺傷細胞的活性。甲硫腦啡肽和亮腦啡肽可以明顯抑制電擊應激大鼠自然殺傷細胞毒的作用并能被納洛酮阻斷,說明機體內(nèi)源性阿片肽樣物質(zhì)在應激刺激免疫功能中有重要作用。海馬是內(nèi)啡肽調(diào)節(jié)免疫的重要結(jié)構(gòu)基礎,而白細胞介素1α(IL-1α)則是它調(diào)節(jié)免疫的重要介質(zhì)。研究表明,大鼠海馬內(nèi)微量注射甲硫腦啡肽或亮腦啡肽能明顯增強刀豆蛋白A刺激的脾淋巴細胞增殖反應(小鼠的實驗也證明了這一點),并且用RT-PCR技術證明了腦啡肽抑制脂多糖(LPS)誘導的大鼠海馬腦區(qū)IL-1α基因表達,在離體培養(yǎng)的新生大鼠海馬膠質(zhì)細胞上,進一步證實這種作用,由于這種抑制作用可被阿片受體阻斷劑納洛酮所阻斷,所以這種抑制性影響可能是通過作用于海馬膠質(zhì)細胞上的阿片受體所致。據(jù)報道,丘腦、下丘腦、海馬、嗅球、弓狀核、室旁核等神經(jīng)元均有IL-1免疫活性物質(zhì)及受體,以IL-1作下丘腦推挽灌流可促進腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子的釋放,通過垂體-腎上腺軸,進而抑制外周免疫功能。這些結(jié)果說明中樞內(nèi)IL-1很可能參與機體免疫功能的負性調(diào)節(jié)。腦啡肽對海馬膠質(zhì)細胞IL-1基因表達的抑制性作用,解釋了海馬內(nèi)注射腦啡肽增強機體免疫反應的機理,即腦啡肽通過作用于具有產(chǎn)生IL-1α能力的海馬膠質(zhì)細胞或某些神經(jīng)細胞膜上的阿片受體,抑制IL-1α基因表達,從而減少腦內(nèi)IL-1α合成,導致IL-1α對下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的激活效應減弱,并通過降低血液中腎上腺皮質(zhì)激素的含量增強機體的免疫功能。但有些學者對腦啡肽的免疫調(diào)節(jié)作用有著不同的認識,他們認為腦啡肽對免疫功能的作用與劑量有關,即在小劑量可增強免疫功能,大劑量則產(chǎn)生抑制效應。但是腦啡肽對免疫系統(tǒng)的影響還可以通過交感神經(jīng)來實現(xiàn)。有研究表明第三腦室內(nèi)注射Met-Enk后引起脾淋巴細胞增殖的降低,但是這種效應并不是Met-Enk的外周效應。因為Met-Enk作為中樞神經(jīng)遞質(zhì),其血腦屏障的通透率很低,并且在血液中有大量的高降解能力的氨基肽酶,可以在很短的時間內(nèi)將血液中的Met-Enk降解。所以可以認為這種效應是Met-Enk與第三腦室周圍組織作用的結(jié)果。它雖不與外周免疫細胞直接接觸,但可以通過作用于中樞的某些核團,改變核團神經(jīng)元的興奮性,再通過神經(jīng)回路或神經(jīng)內(nèi)分泌回路影響外周免疫反應。Met-Enk的信號傳遞到免疫系統(tǒng)主要依賴于HPA軸或淋巴器官上分布的交感神經(jīng)系統(tǒng)。已證明脾交感神經(jīng)纖維末梢有可能與脾實質(zhì)淋巴細胞之間進行突觸樣化學傳遞。所以MetEnk可以通過影響交感神經(jīng)來影響機體的免疫功能。此外IL-2或干擾素(IFN-α)也可能在中樞內(nèi)通過阿片受體途徑影響脾交感神經(jīng)興奮性而最終調(diào)節(jié)脾淋巴細胞的增殖。本實驗表明在慢性束縛應激7天時,EnkmR-NA在海馬中的表達就有所上升,但是不甚明顯,束縛21天時上升較為明顯,與正常對照組和7天模型組比較P<0.01。Enk含量的上升會抑制中樞IL-1α基因表達,可能會引起腦內(nèi)的IL-1α水平有所下降。逍遙散和四君子湯能夠明顯抑制海馬EnkmRNA的上升,可能是它們增強機體免疫功能的重要機理之一。金匱腎氣丸抑制EnkmRNA上升的效果不顯著,但是它增強機體免疫力的作用十分顯著,這提示機體免疫力的調(diào)節(jié)是通過多種途徑進行的,Enk對免疫功能的調(diào)節(jié)只是影響免疫功能的途徑之一。前強啡肽是內(nèi)源性阿片肽家族的另一重要成員。在紋狀體、海馬和下丘腦中含量最高。前強啡肽mRNA的生成在許多腦區(qū)內(nèi)均受某些狀況影響,例如在新紋狀體中,γ-氨基丁酸(GABA)可使其降低。海馬中的前強啡肽mRNA則受點燃作用的下向調(diào)節(jié)。強啡肽具有極強的阿片活性,近年來研究發(fā)現(xiàn)急性腦出血患者血漿中有強啡肽A的增高,提示它可能是繼發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的重要因素之一。但是也有不同學者認為強啡肽A對腦缺血有保護作用,有研究表明側(cè)腦室內(nèi)注射強啡肽A,可使腦缺血大鼠大腦皮層水腫明顯減低,同時皮層內(nèi)Ca2+含量明顯減低,而Mg2+含量增高。強啡肽A1-13還與機體的免疫功能調(diào)節(jié)有密切的關系,研究表明在大鼠燒傷應激后脾內(nèi)強啡肽A1-13的含量明顯下降。這說明強啡肽A1-13可能是通過脾臟上的阿片受體,引起機體免疫功能抑制的,從而也提示它能增強機體的免疫功能。分子生物學水平證實在慢性嗎啡依賴大鼠海馬、紋狀體、下丘腦中前強啡肽原mRNA水平明顯下降,這種變化可能是阿片類藥物依賴和耐受的重要神經(jīng)生物學機理之一。由上可見,強啡肽A發(fā)揮不同作用時所通過的途徑也不同。強啡肽A另一個重要作用特點是它只在機體病理或損傷過程中起調(diào)節(jié)作用,對在正常狀態(tài)下的大鼠影響不大。本實驗表明,在慢性應激狀態(tài)下海馬內(nèi)的前強啡肽mRNA表達有明顯的上升,而且它的變化可能要比腦啡肽的變化早。從以前試驗結(jié)果來看,在慢性束縛性應激狀態(tài)下,強啡肽上升會對神經(jīng)系統(tǒng)造成一定的損傷,因為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(NT3)的含量在應激時都有所下降,對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用降低。上述三個復方都對應激大鼠有一定