康泰膠囊對(duì)腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸黏膜crh-r1mrna表達(dá)的影響

康泰膠囊對(duì)腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸黏膜crh-r1mrna表達(dá)的影響

腸易激綜合征（ibs）是一種常見(jiàn)的臨床胃腸功能疾病。它是由腹痛、腹脹和糞便（腹瀉和便秘）引起的臨床表現(xiàn)為虛假大便（糞便和粘膜大便）引起的癥狀。沒(méi)有具有組織特征的疾?。ㄐ螒B(tài)、細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)代謝指數(shù)等）。由于病因及其發(fā)病機(jī)制尚不十分明了,因此,目前臨床尚缺乏單一、安全、完全有效的治療IBS的藥物?？堤?fù)方是廣州中醫(yī)藥大學(xué)周福生教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)用來(lái)治療腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)的經(jīng)驗(yàn)方。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)臟高敏感性大鼠模型,觀(guān)察康泰復(fù)方對(duì)模型大鼠直腸擴(kuò)張后腹部回縮反射閾值(AWR)的影響,以及結(jié)腸黏膜促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)及CRH-R1mRNA的表達(dá),初步探討康泰復(fù)方治療D-IBS的可能機(jī)制。1材料表面1.1動(dòng)物1.2人體潤(rùn)滑試劑馬來(lái)酸曲美布汀片(商品名:舒麗啟能,天津田邊制藥有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20030290);醋酸(廣州化學(xué)試劑廠(chǎng),批號(hào):200305012);人體潤(rùn)滑劑;血壓計(jì)(魚(yú)躍牌);避孕套(第六感超薄型);2mL注射器;輸液導(dǎo)管(直徑1mm)。cDNA試劑盒(Fermentas公司),Trizolreagent(Invitrogen公司),TaqDNA聚合酶(上海申能博彩生物科技有限公司),引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。1.3中藥風(fēng)味處理康泰膠囊(由防風(fēng)、白芍、木香等組成)由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院制做,生產(chǎn)批號(hào):20080901,1g藥粉相當(dāng)于生藥量4.1g。2方法2.1高敏感大鼠模型的復(fù)制和評(píng)估2.1.1單次給藥和實(shí)驗(yàn)操作新生育齡7天SD大鼠100只,隨機(jī)分出10只為正常組。其余為模型組,每10只與其母鼠共同飼養(yǎng)在同一籠內(nèi),模型組自第1天開(kāi)始,每天給予直腸內(nèi)醋酸刺激:將人體潤(rùn)滑劑潤(rùn)滑后的輸液導(dǎo)管(直徑1mm)經(jīng)肛門(mén)插入2cm。注入0.5%醋酸0.5mL,連續(xù)刺激14天。在第14天后的2周內(nèi),不進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)操作。發(fā)育至大鼠25天育齡后,將母鼠與幼鼠分離。分離后的大鼠每5只一籠,給予足夠的食物、水分。2.1.2大鼠好的打氣充壓awr上述模型大鼠在直腸刺激停止2周后(第5周),評(píng)價(jià)大鼠AWR。將血壓計(jì)、針管與自制指套氣囊用三通管連接,用針管向氣囊內(nèi)打氣時(shí)可以在血壓計(jì)上讀出氣囊內(nèi)壓力。大鼠在清醒狀態(tài)下,將人體潤(rùn)滑劑潤(rùn)滑后的氣囊經(jīng)肛門(mén)插入約5cm,用膠布把導(dǎo)管和大鼠尾巴根部纏在一起,固定氣囊。將其放在特制的透明塑料籠內(nèi),大鼠在此籠內(nèi)不能轉(zhuǎn)身。15min后待大鼠適應(yīng)環(huán)境,逐漸打氣擴(kuò)張腸道,評(píng)價(jià)其AWR;觀(guān)察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的壓力閾值。2.2按照不同的給藥方案,在灌胃時(shí)保證治療上述模型組動(dòng)物在模型復(fù)制成功后,在大鼠7周齡時(shí),按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、康泰膠囊高、中、低劑量組和西藥組,每組10只,分別給予生理鹽水、康泰膠囊1.52、3.04、6.08g/kg(分別相當(dāng)于成人用量的5、10、20倍)及馬來(lái)酸曲美布汀片0.1g/kg灌胃,每天1次,連續(xù)灌胃2周。正常組不灌胃。各組常規(guī)飼料喂養(yǎng)、給水。治療后再次進(jìn)行內(nèi)臟高敏感性評(píng)估,比較用藥組與對(duì)照組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)rt-pcr大鼠麻醉后立即開(kāi)腹取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織2塊放入液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80℃低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?用于RT-PCR檢測(cè)使用。具體方法如下:(1)按試劑盒步驟提取標(biāo)本中的mRNA,在紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)上檢測(cè)吸光度(A)值:A230、A260和A280,獲取樣品中RNA純度和含量,并計(jì)算出5g總RNA所需用量。(2)確定CRHSense:5’ATCTCACCTTCCAC-CTTCT3’;Anti-sense:5’CTCTTACACTGTGTCTCCAA3’。CRH-R1Sense:5’TTGTGTCTGTGTTCTACTGT3’;CRH-R1β-actinSense:5’CCATTGAACACGGCATTG3’;Anti-sense:5’ACTGCTTGATGCTGTGAA3’。β-actinAnti-sense:5’TACGACCAGAGGCATACA3’。擴(kuò)增長(zhǎng)度CRH463bp、CRH-R1162bp、β-actin234bp。(3)采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按以下條件:70℃水浴5min,冰上冷凍。離心片刻,加人1μL(200U/μL)ReverAidM-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶,42℃水浴60min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。(4)PCR反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性3min,94℃變性30s,52℃～56.5℃退火30s,72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳鑒定:用凝膠成像儀自帶分析軟件計(jì)算電泳條帶的光密度積分值,以樣品與內(nèi)參光密度積分值的比值反映各基因表達(dá)的強(qiáng)弱,從而對(duì)RT-PCR的電泳結(jié)果進(jìn)行半定量分析。2.4組間差異統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)以表示,2組間差異用t檢驗(yàn),多組間差異用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。3結(jié)果3.1大鼠內(nèi)臟高敏感性檢測(cè)見(jiàn)表1。采用幼鼠母子分離加直腸刺激法復(fù)制內(nèi)臟高敏感性D-IBS大鼠模型,對(duì)照組大鼠在出生后第6周其抬腹和拱背壓力閾值均低于正常組(P<0.05),說(shuō)明其內(nèi)臟高敏感性顯著升高,造模成功。3.2兩組大鼠內(nèi)臟高敏感性比較見(jiàn)表2。D-IBS內(nèi)臟高敏感性大鼠經(jīng)康泰膠囊治療2周后,各劑量組大鼠內(nèi)臟高敏感性較對(duì)照組降低(P<0.05),且康泰膠囊中、高劑量組已恢復(fù)到接近正常組水平(P>0.05)。提示康泰膠囊對(duì)D-IBS模型大鼠內(nèi)臟高敏感性有改善作用。3.3兩組大鼠crh-s1mrna值比較見(jiàn)表3。造模后對(duì)照組CRH-R1mRNA表達(dá)升高,與正常組比較,差異有顯著性意義(P<0.05)?？堤┠z囊治療后,各劑量組D-IBS大鼠CRH-R1mRNA值表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05);其中,低劑量組、高劑量組與正常組比較,差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)?？堤┠z囊各劑量組D-IBS大鼠的腸黏膜CRHmRNA值均有不同程度的降低,但是與對(duì)照組比較,差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。4康泰膠囊對(duì)d-ib-crhmrna表達(dá)的影響D-IBS是一種以腹部不適或腹痛伴排便習(xí)慣和(或)大便性狀改變?yōu)樘卣鞯墓δ苄约膊?。目?縱觀(guān)D-IBS的所有發(fā)病機(jī)制假說(shuō),都不可避免的與腸道神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理或生化異常相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠在造模后其抬腹和拱背的壓力閾值低于正常組(P<0.05),說(shuō)明其腸道敏感性顯著升高。肝郁脾虛證是D-IBS臨床上最為常見(jiàn)的證型之一,臨床上多用疏肝健脾法治療,以痛瀉要方加減治療多見(jiàn)[4～5]?？堤┠z囊是周福生教授根據(jù)D-IBS的發(fā)病機(jī)制及“心胃相關(guān)”理論,根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn),以疏肝健脾、和胃安神法組方的臨床經(jīng)驗(yàn)方。前期臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方對(duì)D-IBS療效高達(dá)90%,能顯著改善患者的臨床癥狀,而且能調(diào)整患者的內(nèi)臟高敏感性,對(duì)患者的T細(xì)胞亞群也有一定的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,康泰膠囊可以提高D-IBS大鼠的內(nèi)臟高敏感性壓力閾值,且中、高劑量組可恢復(fù)到接近正常組水平,提示康泰膠囊對(duì)內(nèi)臟高敏感性大鼠有改善作用。D-IBS的發(fā)病機(jī)制與腸道神經(jīng)系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理或生化異常有關(guān)。目前認(rèn)為,腦腸互動(dòng)是D-IBS主要發(fā)病機(jī)制之一,CRH通路作為主要介導(dǎo)應(yīng)激引起腦腸互動(dòng)的主要通路,在腦腸軸中發(fā)揮重要的作用。CRH通路主要包括上游信號(hào)通路及下游信號(hào)通路,上游信號(hào)通路包括CRH及相關(guān)受體,而下游信號(hào)主要是指CRH與相關(guān)受體結(jié)合后觸發(fā)的一系列信號(hào)反應(yīng)。CRH受體分2種亞型:CRH-R1和CRH-R2。CRH作為重要的應(yīng)激激素,廣泛地分布于中樞及外周組織,參與神經(jīng)內(nèi)分泌、自律性、行為學(xué)、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)精神疾病的調(diào)控。在應(yīng)激反應(yīng)中,可以觀(guān)察到CRF的釋放,表明CRF在中樞應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組D-IBS大鼠結(jié)腸CRH及CRH-R1mRNA的表達(dá)閾值較正常組增高,且在腸黏膜CRH-R1mRNA的表達(dá)上,正常組與對(duì)照組存在顯著性差異(P<0.05)。這與OkanoS、VizzardMA等[7～8]在大鼠腦室及靜脈注射CRH模擬出的應(yīng)激條件下出現(xiàn)的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)加快,結(jié)腸傳遞時(shí)間縮短、排便等現(xiàn)象相一致,說(shuō)明腸道CRH及CRH-R1參與了結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)控。但是在腸道CRHmRNA的表達(dá)上,模型組與正常組差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮可能是由于CRH存在于腸道黏膜的表達(dá)不多所致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,康泰膠囊各劑量組CRHmRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但較對(duì)照組均有不同程度的降低趨勢(shì),這是否提示其對(duì)D-IBS的作用機(jī)制可能與影響腸黏膜CRH的表達(dá)相關(guān)。而在CRH-R1mRNA表達(dá)上,康泰膠囊低、中、高劑量組均較對(duì)照組降低(P<0.05),提示康泰膠囊可能通過(guò)抑制腸黏膜CRH-R1起到治療D-IBS的作用。綜上所述,基于“心胃相關(guān)”理論組方的康泰膠囊能降低D-IBS內(nèi)臟高敏感性大鼠腸黏膜CRH及CRH-R1mRNA的表達(dá),其作用機(jī)制可能與影響腦腸軸CRH通路有關(guān)。同時(shí)也從反面論證了CRH通路是影響D-IBS發(fā)病的重要機(jī)制之一。臨床許多D-IBS患者在經(jīng)過(guò)康泰膠囊治療