不同波形電針對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響

不同波形電針對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響

脊柱損傷（西醫(yī)）是最嚴(yán)重的損傷之一。嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量,并給家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)有關(guān)資料顯示,全世界范圍內(nèi)SCI的發(fā)病率大約20—40例/100萬(wàn)人/年。隨著工傷與交通事故的增加,臨床上脊柱外傷合并SCI的病例有逐年增多的趨勢(shì)。因此,SCI的病理生理的實(shí)驗(yàn)研究及治療方法的探索受到了更廣泛的關(guān)注。有研究表明,繼發(fā)損傷是造成脊髓損傷嚴(yán)重程度的重要因素之一,氧自由基與脊髓損傷后的繼發(fā)損傷關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn),氧自由基是含有豐富脂質(zhì)的脊髓組織膜損傷后產(chǎn)生和釋放的,它可作用于細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸,造成細(xì)胞膜通透性改變,致使溶酶體崩解、溶酶外溢而導(dǎo)致細(xì)胞壞死,從而造成脊髓損傷的繼發(fā)性損害。丙二醛(malondialdehyde,MDA)作為氧自由基生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物,可間接反映脊髓組織中氧自由基含量。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶和自由基清除劑,通過(guò)抗氧化及清除自由基,對(duì)損傷的組織細(xì)胞起到保護(hù)作用。大量的臨床實(shí)驗(yàn)表明,電針對(duì)于脊髓損傷有一定的療效。但并沒(méi)有針對(duì)不同波形電針對(duì)脊髓損傷療效的研究,也不清楚在相同條件下,各不同波形電針對(duì)于脊髓損傷療效的差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同波形電針對(duì)于脊髓損傷的治療,觀察不同波形電針對(duì)脊髓損傷療效的差異,為臨床上脊髓損傷的治療提供新的理論依據(jù)。1材料和方法1.1大鼠分組及分組選用體重(200±20)g的清潔健康成年SD大鼠48只,不計(jì)雌雄,由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(川)-10-2006。將48只大鼠按隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為疏密波電針組(A組)、連續(xù)波電針組(B組)、斷續(xù)波電針組(C組)、造模組(D組),每組12只。每組按術(shù)后第1天、術(shù)后第3天、術(shù)后第7天分成三個(gè)亞組,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只。1.2試劑和設(shè)備1.2.1試劑與藥品丙二醛(MDA)試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號(hào):20100719;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號(hào):20100719;戊巴比妥鈉(德國(guó)進(jìn)口分裝):北京化學(xué)試劑公司,批號(hào):090205;注射用青霉素鈉:石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司產(chǎn)品,批號(hào):09119209;氯化鈉注射液:安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):1001021E。1.2.2光譜儀器設(shè)備SDZ-IV型電針治療儀:蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;721E型可見(jiàn)分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司;臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;自制數(shù)字式脊髓損傷動(dòng)物模型制備儀。1.3腰椎胞菌群的制備實(shí)驗(yàn)前選取正常SD大鼠,術(shù)前對(duì)所選大鼠進(jìn)行常規(guī)行為能力測(cè)試,以確定在脊髓損傷造模前大鼠的運(yùn)動(dòng)功能正常。用1.5%戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)經(jīng)腹腔麻醉,麻醉后將大鼠俯臥(采用五點(diǎn)法)固定于自制手術(shù)臺(tái)上,背部去毛,碘伏常規(guī)消毒,鋪上紗布。在無(wú)菌條件下,初步定位T9,再沿正中線切開(kāi)大鼠背部皮膚(切口約1.5cm)。根據(jù)大鼠解剖圖譜,先找出最突出的T11、T12的棘突,明確T9的具體位置后,用手術(shù)刀沿緊靠棘突的兩邊切開(kāi)背部肌肉,然后小心切開(kāi)并去除T9椎骨上的肌肉。隨后行椎板切除術(shù),用有齒鑷剝離T9棘突和椎間軟組織,然后用無(wú)齒鑷慢慢剝開(kāi)錐板(切勿損傷硬脊膜),暴露脊髓,并適當(dāng)修剪兩側(cè)錐板以獲得良好顯露,用自制數(shù)字式脊髓損傷動(dòng)物模型制備儀打擊器打擊T9段脊髓制成脊髓損傷模型(Allen法),打擊強(qiáng)度為10g×25mm,打擊后即刻見(jiàn)大鼠雙后肢發(fā)生不同程度抽動(dòng)、擺尾,隨后完全松弛,標(biāo)志模型制備成功。造模成功后,常規(guī)消毒,并逐層縫合切口。由于手術(shù)過(guò)程中不可避免地會(huì)有一定程度的出血,從而使大鼠血容量發(fā)生改變,因此術(shù)后各組立即按9ml/kg體重的量腹腔注射0.9%氯化鈉注射液補(bǔ)液,并同時(shí)注射青霉素抗感染。待動(dòng)物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng),這段時(shí)間注意保持大鼠體溫。術(shù)后大鼠自由進(jìn)食、飲水,定時(shí)清潔籠具,更換墊料,保持適宜室溫。每天擠壓膀胱排尿3次,到膀胱功能恢復(fù)為止;術(shù)后每天腹腔注射青霉素8×104U,連續(xù)3d。1.4肌肉電針治療電針組大鼠均采用固定狀態(tài)下電針,于術(shù)后6h開(kāi)始治療,將大鼠俯臥,四肢及頭部固定于自制鼠板上,選取損傷段上下2個(gè)椎體的“夾脊穴”作為電針穴位,正極接近頭端,負(fù)極接近尾端,疏密波頻率為10/50Hz,連續(xù)波、斷續(xù)波頻率均為50Hz,其中斷續(xù)波間隔時(shí)間約1.5s。均留針20min,之后每天定時(shí)電針1次。A組給予疏密波電針治療,B組給予連續(xù)波電針治療,C組給予斷續(xù)波電針治療,電流0.5—1mA,以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)或尾巴擺動(dòng)為度。造模組造模成功后,在電針組大鼠接受治療時(shí)與電針組大鼠同時(shí)綁在鼠板上相同時(shí)間,但僅注射青霉素、0.9%氯化鈉注射液1ml和5%葡萄糖注射液1ml,不給予任何治療措施。1.5指標(biāo)檢測(cè)1.5.1大鼠術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)單板試驗(yàn)4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于術(shù)后第1天、第3天和第7天進(jìn)行BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn),采用Basso報(bào)道的BBB評(píng)分法和Rivlin的斜板試驗(yàn)對(duì)大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。為避免評(píng)分者主觀因素的干擾,本研究所有評(píng)分人員均為熟悉本評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)且又不清楚本實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜藛T。1.5.2分光光度計(jì)測(cè)法于術(shù)后第1天、第3天和第7天(每天4只)經(jīng)右心室取血3ml后,立即3000r/min離心15min,取上清液,存于-20℃冰箱,1周內(nèi)分析完畢。測(cè)定儀器為可見(jiàn)光分光光度計(jì)。SOD活性和MDA含量分別用SOD和MDA試劑盒測(cè)定,MDA按硫代巴比妥酸法測(cè)定,SOD采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定,操作方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。1.6統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間兩兩比較采用SNK法(q檢驗(yàn))。2結(jié)果2.1術(shù)后大鼠的生長(zhǎng)情況大鼠蘇醒后,表現(xiàn)為靜臥少動(dòng),氣息微弱而緩慢,雙后肢感覺(jué)遲鈍、肌力明顯下降,運(yùn)動(dòng)功能基本喪失,無(wú)進(jìn)食及進(jìn)水需求,出現(xiàn)尿失禁或下腹部膨隆、尿潴留等不完全脊髓損傷的表現(xiàn)。6h后實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢關(guān)節(jié)可出現(xiàn)輕微活動(dòng),能夠自主飲水;對(duì)照組后肢無(wú)任何運(yùn)動(dòng)表現(xiàn),有進(jìn)水需求。造模后前3d,大鼠活動(dòng)較少,進(jìn)食少,尿潴留現(xiàn)象比較嚴(yán)重,伴血尿及腹部脹氣。術(shù)后1周內(nèi)所有大鼠均需人工排尿。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中A組大鼠死亡1只,B組死亡2只,C組死亡2只,D組無(wú)死亡,總死亡率約10.4%,死亡原因未知,推測(cè)可能與嚴(yán)重的血尿、膀胱破裂、嚴(yán)重的腹水及多臟器衰竭有關(guān)。及時(shí)補(bǔ)充同批次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,使每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量保持一致。2.2大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)估2.2.1sbb評(píng)分術(shù)前所有大鼠評(píng)分均為正常21分。術(shù)后第1天A、C組BBB評(píng)分高于造模組(P<0.05);第3天BBB評(píng)分A、B、C組均高于造模組(P<0.05);第7天BBB評(píng)分A、B、C組與造模組相比,BBB評(píng)分高于造模組(P<0.05)。見(jiàn)表1。2.2.2兩組斜板試驗(yàn)臨界角度術(shù)后第1天斜板試驗(yàn)評(píng)分A組斜板試驗(yàn)臨界角度高于造模組(P<0.05),A組斜板試驗(yàn)臨界角度高于C組(P<0.01);術(shù)后第3天斜板試驗(yàn)評(píng)分A組斜板試驗(yàn)臨界角度高于造模組(P<0.01),其他兩組間相比無(wú)顯著性差異;造模后第7天斜板試驗(yàn)評(píng)分A、B、C組斜板試驗(yàn)臨界角度高于造模組(P<0.01),A組斜板試驗(yàn)臨界角度高于其他治療組(P<0.05)?？梢?jiàn),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)療效顯著,其中A組療效較其他組更為明顯。見(jiàn)表2。2.3測(cè)量sda和sod的結(jié)果2.3.1各組小鼠血清中sod活性的變化術(shù)后第1天電針組SOD活性明顯高于造模組(P<0.05);第3天A、B、C組SOD活性高于造模組(P<0.05),A組SOD活性明顯高于C組(P<0.05),其余兩組間比較無(wú)顯著性差異;第7天A、B、C組SOD活性顯著高于造模組(P<0.05)。說(shuō)明電針組的脊髓損傷的保護(hù)作用明顯優(yōu)于D組,其中A組在第3天相對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)組療效更為顯著。見(jiàn)表3。2.3.2各組mda含量比較術(shù)后第1天電針組與D組相比,MDA含量顯著降低(P<0.01),電針組間無(wú)顯著性差異;第3天A、B、C組與D組相比,MDA含量明顯降低(P<0.05);第7天A、B、C組與D組相比,MDA含量明顯降低(P<0.05),其余各組間兩兩比較無(wú)顯著性差異。說(shuō)明在不同電針波形對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能療效顯著,以A組最為明顯。見(jiàn)表4。3治療髓傷的關(guān)鍵在血液循環(huán)和疏血等方面的作用脊髓損傷患者的康復(fù)治療,首要目標(biāo)是改善和促進(jìn)SCI患者運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。電針具有針刺和電刺激的雙重治療作用,能改善和促進(jìn)SCI患者運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。目前研究認(rèn)為電針促進(jìn)SCI修復(fù)的機(jī)制如下:(1)改善血液循環(huán),抵抗自由基,減少繼發(fā)性損害;(2)降低Ca2+含量,保護(hù)損傷神經(jīng)[10—11];(3)促進(jìn)受損傷神經(jīng)元的軸突再生[12—13];(4)影響神經(jīng)元的發(fā)育和生長(zhǎng),加速軸突再生和功能恢復(fù);(5)維護(hù)神經(jīng)元的自我保護(hù)機(jī)制;(6)抑制細(xì)胞凋亡[16—17];(7)恢復(fù)神經(jīng)元興奮性等。而使用不同電針波形對(duì)脊髓損傷的治療在機(jī)制上也存在差異,有研究報(bào)道,疏密波能通過(guò)提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NT-3)、mRNA在神經(jīng)組織中的表達(dá),加快NT-3與胞體中受體(Trk受體)的結(jié)合速度以促進(jìn)神經(jīng)的再生和修復(fù),同時(shí)能加強(qiáng)血液循環(huán),改善組織營(yíng)養(yǎng),消除炎性水腫,并且疏密波不易被機(jī)體所適應(yīng),能有效的維持刺激量,進(jìn)而提高療效。斷續(xù)波能消除水腫,加快清除局部壞死組織和崩解產(chǎn)物的速度,同時(shí)能改善血液循環(huán),為神經(jīng)細(xì)胞的再生提供充足的氧供,進(jìn)而促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù);此外,斷續(xù)波在保持肌纖維收縮和舒張?zhí)匦浴⒋龠M(jìn)新陳代謝、減緩肌蛋白的變性等方面也有療效,因此可用于防止脊髓損傷時(shí)因運(yùn)動(dòng)減少而致的肌萎縮。故脊髓損傷時(shí)采用適當(dāng)?shù)碾娽槻ㄐ芜M(jìn)行治療至關(guān)重要。長(zhǎng)期的臨床研究表明,電針對(duì)于脊髓損傷的治療具有較好的療效,但并不清楚何種波形療效更佳,本研究旨在比較不同波形對(duì)于脊髓損傷療效的差異并初步探討其相關(guān)機(jī)制。本研究以BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)、SOD活性、MDA含量為指標(biāo),研究結(jié)果表明:在BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)中,電針組脊髓損傷大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能相對(duì)于造模組在整體水平上有明顯提高;電針治療脊髓損傷具有增高SOD活性,降低MDA含量的作用,從而增強(qiáng)對(duì)自由基的抵抗能力,減少脊髓損傷后的繼發(fā)損傷,有助于保護(hù)脊髓組織,進(jìn)而改善和促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。在電針治療過(guò)程中,我們可以看出,不同波形電針對(duì)于脊髓損傷的療效存在較大差異,據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在電針治療過(guò)程的前階段,三種波形對(duì)于脊髓損傷的療效相當(dāng),在治療過(guò)程的中后階段,A組疏密波相對(duì)于其他波形療效更為顯著。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,損傷后第1天和第7天的斜板試驗(yàn)A組斜板試驗(yàn)臨界角度高于C組(P<0.01),第7天斜板試驗(yàn)A組高于B組(P<0.05),其余組兩兩比較無(wú)顯著性差異,表明在脊髓損傷后期疏密波電針組較其他實(shí)驗(yàn)組有較好的療效。損傷后第3天SOD活性A組高于C組(P<0.05),其余組兩兩比較均無(wú)顯著性差異,表明在脊髓損傷中期疏密波電針組相對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)組療效更為顯著。綜上所述,A組疏密波對(duì)脊