脂多糖對(duì)巨噬細(xì)胞il-1、il-6和nf-mrna表達(dá)的影響

脂多糖對(duì)巨噬細(xì)胞il-1、il-6和nf-mrna表達(dá)的影響

隨著中藥及其抗炎免疫機(jī)制的研究和發(fā)展，越來越多的中藥及其療效在臨床上具有保障安全、價(jià)格合理的優(yōu)點(diǎn)，已成為抗炎藥的非體抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素抗炎藥，后者也是使用最廣泛的抗炎藥。然而,中藥抗炎作用的分子機(jī)制十分復(fù)雜,通過多途徑、多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗炎作用,許多中藥的抗炎分子機(jī)理還不是很清楚。目前,中藥抗炎作用的分子機(jī)制研究中,大多數(shù)都從炎癥的不同途徑和環(huán)節(jié)對(duì)抗炎的分子機(jī)制進(jìn)行研究,其中炎性細(xì)胞因子在基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞是一類重要的免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞,能夠啟動(dòng)體內(nèi)的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,并調(diào)控炎癥反應(yīng),釋放炎性細(xì)胞因子等。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要成分,是引起炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞毒性因子,通過LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子以建立體外炎癥模型,可以模擬體內(nèi)炎癥反應(yīng)過程,常用于抗炎藥物作用機(jī)制的研究。研究中藥抗炎作用機(jī)制,首先需要建立一個(gè)穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的體外炎癥模型。目前,中藥抗炎機(jī)制研究的體外炎癥模型主要以巨噬細(xì)胞系(Raw264.7、THP-1等)為主,通過刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),但該細(xì)胞系是一種半腫瘤特性的細(xì)胞系,不能完全模擬體內(nèi)巨噬細(xì)胞的生物學(xué)特性。雖然也有研究者采用原代巨噬細(xì)胞為細(xì)胞來源建立炎癥模型,但模型建立的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,不同研究者選擇的LPS濃度和作用時(shí)間差異很大。因此采用原代巨噬細(xì)胞為細(xì)胞來源,建立穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的炎癥模型,將會(huì)更準(zhǔn)確地反映中藥抗炎的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng),LPS刺激巨噬細(xì)胞來模擬體內(nèi)炎癥反應(yīng),采用熒光定量PCR法檢測(cè)LPS作用后細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-1β,IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)變化,以期建立較合理的、標(biāo)準(zhǔn)的體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型。1材料和方法1.1試劑和引物SPF級(jí)昆明小鼠10只,雌雄不限,6~8周,中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2011-0029;LPS(fromEcoli055:B5)購自Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品;Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRue3ebue4d2PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)kit、引物購自大連Takara公司;FITC-CD14單抗、BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染脫頸處死小鼠,75%(φ)酒精浸泡5min后置于解剖臺(tái)上,無菌條件下打開腹膜,腹腔注射不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液5mL。輕柔小鼠腹部3min,靜置5min,用注射器抽取腹腔液約4mL,放入置于冰盒上的離心管中,重復(fù)操作2次。用TrisNH4Cl溶液溶解腹腔液中的紅細(xì)胞,2000r/min,離心5min,洗滌細(xì)胞后顯微鏡下計(jì)數(shù)。加入含10%(φ)胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,分別以不同的密度(1×105/mL、5×105/mL、1×106/mL、5×106/mL、1×107/mL)接種于50mL培養(yǎng)瓶中,于37℃、飽和濕度、5%(φ)CO2的條件下培養(yǎng),培養(yǎng)6h后換液,以去掉未貼壁細(xì)胞。每2~3天換液1次。1.3大鼠腹腔疾病的形態(tài)觀察細(xì)胞培養(yǎng)后每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況。1.4cd14表達(dá)水平檢測(cè)用0.25%胰酶將培養(yǎng)3d的細(xì)胞消化下來,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,1000r/min,離心5min棄上清,100μLPBS重懸細(xì)胞,然后加入PBS稀釋的50μLCD14單抗標(biāo)記細(xì)胞,避光作用30min,1000r/min,離心5min,棄上清液后PBS洗2遍,0.5mL1%BSA的PBS液終止反應(yīng),流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞表面CD14表達(dá)水平。1.5實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)mrna小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板培養(yǎng)過夜,次日分別加入終質(zhì)量濃度為0、0.1、1、10μg/mL的LPS,于24h收集細(xì)胞。同時(shí),以1×106個(gè)/mL的密度接種于培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng),次日分別加入終質(zhì)量濃度為1μg/mL的LPS,于0、4、8、16、24、48h收集細(xì)胞?？俁NA抽提按Trizol試劑說明書進(jìn)行,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR總反應(yīng)體系為20μL,即RealMasterMix(SYBRgreen)10μL,cDNA1μL,正、反向引物各0.5μL,無菌水8μL,總體積為20μL。擴(kuò)增條件:95℃2min;95℃15s、60℃30s、68℃30s,共40個(gè)循環(huán)。IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct計(jì)算。GAPDHmRNA作為內(nèi)參照。1.6比較方法獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),t采用SPSS軟件,所有數(shù)據(jù)以u(píng)e0af±s表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較用單因素方差分析(one-wayANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1細(xì)胞培養(yǎng)和密度顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況,結(jié)果顯示:細(xì)胞以1×106/mL~5×106/mL密度接種時(shí),細(xì)胞生長最好,6h內(nèi)開始貼壁;培養(yǎng)24h后細(xì)胞體積逐漸增大,有橢圓形、長梭形和不規(guī)則的形態(tài);培養(yǎng)48h后,細(xì)胞周邊或兩極伸展偽足;培養(yǎng)5d左右,細(xì)胞生長依然良好,見圖1。密度過低(低于1×105/mL)貼壁細(xì)胞少,細(xì)胞生長不良,見圖2;過高(高于1×107/mL)細(xì)胞重疊生長,細(xì)胞偽足很少。2.2流式細(xì)胞培養(yǎng)通過流式細(xì)胞儀測(cè)得CD14表面抗體的表達(dá)量為84.55%,結(jié)果表明所分離的細(xì)胞中84.55%細(xì)胞為單核巨噬細(xì)胞。見圖3。2.3種細(xì)胞因子中il-1和tnf-表達(dá)情況的變化不同質(zhì)量濃度的LPS作用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞24h對(duì)IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)均有不同程度的顯著上調(diào),在這3種細(xì)胞因子中IL-1β和TNF-α較IL-6表達(dá)水平更顯著。而且在一定濃度范圍內(nèi)(0.1~1μg/mL),隨LPS濃度增加上調(diào)作用增強(qiáng)(圖4)。當(dāng)LPS濃度為10μg/mL時(shí),LPS的刺激效應(yīng)逐漸降低,但仍高于對(duì)照組。2.4lps對(duì)tnf-mrna表達(dá)的影響1μg/mLLPS作用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞4、12、24、48h對(duì)IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)均有不同程度的上調(diào),而且在一定作用時(shí)間內(nèi)(4~24h),隨LPS作用時(shí)間延長,上調(diào)作用增強(qiáng)(圖5)。LPS刺激4h時(shí),各細(xì)胞因子的表達(dá)量開始顯著上調(diào),24h達(dá)到頂峰;48h時(shí),3種細(xì)胞因子的表達(dá)量顯著下調(diào),但仍高于對(duì)照組。3細(xì)胞密度對(duì)細(xì)胞功能的影響巨噬細(xì)胞廣泛分布于體內(nèi),是一類重要的免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞,在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。同時(shí)巨噬細(xì)胞多游離存在于腹水中,易于獲得,因此許多實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行中藥抗炎機(jī)制研究時(shí),往往選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象。要建立穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的體外炎癥模型,首先要獲得高純度的原代培養(yǎng)巨噬細(xì)胞。目前國內(nèi)外報(bào)道了多種方法分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,較多采用預(yù)先注入巨噬細(xì)胞刺激劑,以誘導(dǎo)大量的巨噬細(xì)胞進(jìn)入腹腔,通過灌洗腹腔獲得大量細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道預(yù)先注入巨噬細(xì)胞刺激劑對(duì)巨噬細(xì)胞功能有一定的影響,獲得的巨噬細(xì)胞已不再具有原體內(nèi)巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)功能。本實(shí)驗(yàn)免去了注射巨噬細(xì)胞刺激劑,通過增加易得而又便宜的小鼠數(shù)量就可解決巨噬細(xì)胞數(shù)量少的問題,避免了注入的大分子抗原物質(zhì)對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響。體外培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞有很大的區(qū)別,體外培養(yǎng)細(xì)胞需要適當(dāng)密度以適應(yīng)外界培養(yǎng)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞密度在1×106/mL~5×106/mL時(shí),細(xì)胞生長良好、長出樹突狀的突起,從而具備巨噬細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞獲得后,要通過形態(tài)學(xué)檢查,生物學(xué)功能檢查和免疫學(xué)標(biāo)志檢查等鑒定,不同文獻(xiàn)鑒定時(shí)選擇的標(biāo)準(zhǔn)也不一樣。目前鑒定巨噬細(xì)胞純度的方法主要是通過免疫學(xué)標(biāo)志檢查巨噬細(xì)胞特異性表面標(biāo)記,如CD14、CD11b等。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD14的表達(dá)水平,結(jié)果顯示CD14細(xì)胞陽性率為84.55%,與文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的純度相當(dāng)(分別為99.2%和79.6%)。炎癥反應(yīng)是多細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)促炎和抗炎系統(tǒng)之間的平衡而參與炎癥發(fā)生、發(fā)展的過程。目前,細(xì)胞的體外炎癥模型制作常以促炎因子為手段,如LPS、TNF-α和IL-1β等,但最主要的、作用最強(qiáng)的、實(shí)驗(yàn)研究使用最多的是LPS。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要成分,能激活炎癥細(xì)胞引起炎癥反應(yīng),在炎癥反應(yīng)過程中,LPS通過其受體TLR4激活巨噬細(xì)胞,從而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)的產(chǎn)生,細(xì)胞因子的分泌可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的進(jìn)一步激活,從而導(dǎo)致過度或失控的炎癥反應(yīng),最終引起宿主組織器官的炎性病理損傷。因此,在炎癥反應(yīng)中選取IL-1β、IL-6和TNF-α這3個(gè)經(jīng)典的急性炎癥早期細(xì)胞因子作為衡量模型成功與否的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)以LPS作為促炎介質(zhì),成功制作了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的體外炎癥模型,表現(xiàn)為脂多糖在0.1~1μg/mL范圍內(nèi)4、12、2