pi3kakmor信號通路對兔原代巨噬細胞自體噬中的影響

pi3kakmor信號通路對兔原代巨噬細胞自體噬中的影響

由于體內(nèi)最強大的吞咽細胞，mcg在維護體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性方面發(fā)揮著非常重要的作用。除吞噬作用外,巨噬細胞還有趨化功能、分泌功能以及抗原呈遞功能,因此巨噬細胞成為許多領(lǐng)域的研究對象。在動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)斑塊病理生理進程中,巨噬細胞由于分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)降解細胞外基質(zhì)導致纖維帽變薄以及分泌多種細胞因子促進斑塊向不穩(wěn)定方向發(fā)展而受到人們重視。如何減少As斑塊中的巨噬細胞浸潤進而穩(wěn)定易損斑塊已成為As研究的熱點。自體吞噬是近年來發(fā)現(xiàn)的不同于凋亡和壞死的一種形式,簡稱自噬。自體吞噬參與了As的發(fā)生發(fā)展過程［1］,通過自體吞噬作用能夠減少泡沫細胞的積聚和斑塊中的炎癥反應,起到穩(wěn)定斑塊的作用。如何利用巨噬細胞的自體吞噬作用穩(wěn)定易損斑塊具有十分重要的意義。利用RAW264.7細胞系的研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號通路能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞自體吞噬［2］,然而由于細胞系的腫瘤性,是否在原代巨噬細胞中也有相同結(jié)論尚有待驗證,同時,抑制PI3K分子是否也能促進自噬尚不明確。本研究擬采用兔原代巨噬細胞作為研究對象,分別利用PI3K抑制劑LY294002、Akt抑制劑曲西立濱、mTOR抑制劑雷帕霉素選擇性抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,以觀察其對原代巨噬細胞自體吞噬的影響。1材料和方法1.1實驗動物純種新西蘭大白兔,購自山東省農(nóng)業(yè)科學院。1.2蛋白試劑和試劑盒藥物LY294002(Cat:9901)、抗體p-mTOR(Cat:2974)、mTOR(Cat:2983)、Akt(Cat:9272)、LC3Ⅱ(Cat:3868)購自CellSignaling,抗體p-Akt(Cat:ab23509)購自Abcam,抗體Atg5(Cat:ABC14)購自MerckMillipore,抗體Beclin-1(cat:PL031353R)購自PLlaboratories,抗體β-actin購自中杉金橋,雷帕霉素(Cat:553210)、曲西立濱(Cat:124012)購自Calbiochem,MDC(Cat:D4008)、巰基乙酸鹽肉湯(thioglycollatebroth,Cat:70157)購自Sigma公司,蛋白提取試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。1.3基于lsm210的雙環(huán)境電泳日本JEM-1200透射電子顯微鏡,德國蔡司LSM710共聚焦顯微鏡,通用電氣公司imagequantLAS4000mini超靈敏化學發(fā)光成像儀。1.4培養(yǎng)基離心聯(lián)合pbs新西蘭家兔麻醉后腹腔注射200mL(2.9g/100mL)無菌巰基乙酸肉湯,3~4天后麻醉處死家兔,無菌條件下開腹注入60mL培養(yǎng)基,按摩5min后吸出,重復3次。吸取的培養(yǎng)基離心后按106種入6孔板中,2h后換液,無菌PBS沖洗兩遍,貼壁細胞95%為巨噬細胞。隨即分為4組,加入PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)組、Akt抑制劑曲西立濱(20μmol/L)組、mTOR抑制劑雷帕霉素(10nmol/L)組共培養(yǎng)細胞12h,第4組為空白對照組。1.5細胞觀察方法藥物共培養(yǎng)巨噬細胞12h后,收取各組細胞置于3%戊二醛中固定、PBS洗滌、1%餓酸固定、梯度乙醇丙酮脫水、包埋、聚合、超薄切片、鉛染后觀察。1.6tri能力透入人體內(nèi)24孔板細胞爬片,各組加入相應藥物共培養(yǎng)12h,PBS洗滌,2%多聚甲醛固定細胞,PBS沖洗后,1‰的TritonX-100細胞透入,5%牛血清白蛋白(BSA)封閉,加入LC3Ⅱ后4℃孵育過夜。PBS沖洗后,加入熒光二抗,室溫避光孵育2h,DAPI染細胞核后,防熒光淬滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。1.7tri能力檢測細胞daps染紅細胞24孔板細胞爬片,各組加入相應藥物共培養(yǎng)12h,PBS洗滌后加入終濃度為50μmol/LMDC,37℃、5%CO2孵箱孵育1h,PBS洗滌,2%多聚甲醛固定細胞,PBS沖洗后,1‰的TritonX-100細胞透入,DAPI染細胞核,防熒光淬滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。1.8凝膠電泳測定蛋白表達分別收集藥物共培養(yǎng)4h、12h及空白對照組巨噬細胞,PBS洗滌3次,用試劑盒提取蛋白后,采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。6%~10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳,蛋白分離后200mA轉(zhuǎn)至硝酰膜上。室溫下5%脫脂奶粉封閉2h,用相應的一抗4℃孵育過夜,洗滌后換相應二抗室溫孵育2h。洗滌后采用化學發(fā)光試劑盒用imagequantLAS4000mini超靈敏化學發(fā)光成像儀顯影,使用Photoshop分析條帶灰度值。1.9數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析計量數(shù)據(jù)用ue0af±s表示,應用SPSS17.0軟件處理,采用單因素方差分析,并進行LSD檢驗,方差不齊時運用Dunnett’sT3檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1ly294002對ly294002組自噬標記物自噬的影響藥物與兔原代巨噬細胞共培養(yǎng)12h后,與空白對照組相比,LY294002組自噬標記物如自噬體、自噬空泡、髓磷脂圖像明顯減少,而雷帕霉素組、曲西立濱組明顯增多(圖1)。2.2ly294002對lc3熒光亮點表達的影響藥物與兔原代巨噬細胞共培養(yǎng)12h后,與空白對照組相比(IOD/Area值為0.265±0.089),LY294002組LC3Ⅱ熒光亮點表達明顯減少(IOD/Area值為0.031±0.018),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);雷帕霉素組(IOD/Area值為0.620±0.152)、曲西立濱組(IOD/Area值為0.752±0.086)表達顯著增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01;圖2)。2.3顯著減少iiid/區(qū)域值與空白對照組相比(IOD/Area值為0.317±0.074),LY294002組自噬溶酶體表達顯著減少(IOD/Area值為0.044±0.018),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);雷帕霉素組(IOD/Area值為0.772±0.077)、曲西立濱組(IOD/Area值為0.715±0.065)自噬溶酶體表達明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01;圖3)。2.4ly294002對雷帕素對血清p-amt表達的影響與空白對照組相比,LY294002組自噬蛋白Atg5-Atg12連接體及Beclin-1表達顯著減少(P<0.01),雷帕霉素、曲西立濱組表達均顯著增多(P<0.01,P<0.05;圖4)。與藥物共培養(yǎng)4h后,與空白對照組相比,LY294002組及曲西立濱組p-mTOR表達明顯減少(P<0.01),雷帕霉素組p-mTOR表達顯著增多(P<0.01)。處理12h后,與空白對照組相比,LY294002組、雷帕霉素組和曲西立濱組p-mTOR表達均顯著減少(P<0.01;圖5)。處理4h后,與空白對照組相比,雷帕霉素組、曲西立濱組p-Akt表達顯著增多(P<0.01),LY294002組p-Akt表達顯著減少(P<0.01)。處理12h后,與空白對照組相比,LY294002組、曲西立濱組p-Akt表達均顯著減少(P<0.01),雷帕霉素組p-Akt表達增多(P<0.05;圖6)。3磷酸化是放空ndv的藥物系統(tǒng)巨噬細胞富集是動脈粥樣硬化易損斑塊的重要特征,斑塊纖維帽中侵入的巨噬細胞越多,斑塊就越脆弱,此外,巨噬細胞還可以分泌多種細胞因子例如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ以及細胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素、E-選擇素、NF-κB、CD40L-CD40等,促進斑塊向不穩(wěn)定方向轉(zhuǎn)化。因此選擇性減少As斑塊中的巨噬細胞浸潤能夠促進易損斑塊穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)自體吞噬參與了As的發(fā)生發(fā)展過程,斑塊細胞存在不同程度的自噬現(xiàn)象,巨噬細胞也不例外。自體吞噬是細胞中的一種補救性生命支持進程,通過形成橢圓形的雙層膜結(jié)構(gòu)來隔絕一定的細胞質(zhì)成分,進而利用溶酶體組分降解這些成分［3］。已有研究表明自體吞噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤、心力衰竭中具有重要作用［4］。自體吞噬在生物進化中高度保守,能夠產(chǎn)生游離脂肪酸、氨基酸和核苷酸供細胞重新利用。自體吞噬由生物體精細調(diào)節(jié),研究發(fā)現(xiàn)Akt/mTOR信號通路、MAPK/Erk1/2信號通路以及AMPK等信號通路都與之相關(guān)［5］,尤其是Akt/mTOR信號通路起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Akt/mTOR被認為是蛋白質(zhì)合成的主要信號調(diào)節(jié)通路,參與細胞增殖、分化遷移等的調(diào)節(jié),活化時可以抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡以及細胞自我吞噬,促進細胞周期進展。活化的mTOR可以調(diào)節(jié)兩條下游通路:核糖體S6蛋白激酶1(S6kinase1,S6K1)和真核細胞起動因子4E結(jié)合蛋白1(4Ebindingprotein,4EBP1)［6］。mTOR通過磷酸化使S6K1活化,進而磷酸化核糖體蛋白S6(p70S6)來促進mRNA翻譯,同時促使核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的黏附而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脫落形成自噬體膜;mTOR也可以通過磷酸化抑制4EBP1活性,解除其對真核細胞翻譯起始因子eIF4E的抑制。最近研究發(fā)現(xiàn)利用藥物依維莫司、雷帕霉素抑制mTOR,通過促進腫瘤細胞的自體吞噬而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7］,更直接的證據(jù)來自于高脂飼養(yǎng)的家兔斑塊中放置的依維莫司藥物涂層支架,可以看到巨噬細胞顯著減少而血管平滑肌細胞不受影響［8］,甚至口服雷帕霉素也能達到抑制斑塊生長的作用［9］。PI3K是Akt/mTOR信號通路的上游分子,可以分為兩種類型,I型PI3K活化時通過激活Akt/mTOR信號通路,負性調(diào)節(jié)自體吞噬,Ⅲ型PI3K活化時激活Beclin-1,啟動自噬進程［10］。Beclin-1是酵母自噬基因Atg6的哺乳細胞同源基因,大部分觀點認為其表達增多代表自噬水平增強,例如用siRNA沉默Beclin-1基因使得饑餓誘導的細胞自噬并沒有增強［11］。而Wang等［12］研究發(fā)現(xiàn),Beclin-1是Akt的作用靶點之一,對Akt抵抗的Beclin-1突變體能夠增加自噬。由于Beclin-1被Akt磷酸化后能夠增強其與波形蛋白的聯(lián)系,而清除后者能夠增強自噬水平,由此認為Beclin-1被Akt磷酸化后自噬減弱。我們的研究發(fā)現(xiàn)應用PI3K抑制劑LY294002后p-Akt、p-mTOR均有大幅下降,說明LY294002可以抑制Ⅰ型PI3K/Akt/mTOR通路,然而自噬標志物是降低的,可能的機制是LY294002對于Ⅲ型PI3K的抑制作用更為主要,因此更加特異的抑制劑有待開發(fā),對Beclin-1的深入研究也將更加闡明這一現(xiàn)象。我們還發(fā)現(xiàn)應用Akt、mTOR特異性抑制劑曲西立濱、雷帕霉素與兔原代巨噬細胞共培養(yǎng)12h后,p-Akt、p-mTOR表達量下降而總Akt、mTOR表達量不變,說明可以有效阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路,同時透射電鏡、免疫熒光、Westernblot檢測以及MDC染色結(jié)果顯示自噬現(xiàn)象明顯增強,說明抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可以增強兔原代巨噬細胞自體吞噬。我們的實驗還發(fā)現(xiàn)雷帕霉素、曲西立濱與兔原代巨噬細胞共培養(yǎng)4h后p-mTOR、p-Akt表達增多,共培養(yǎng)12h后雷帕霉素組p-Akt表達量進一步上升,可能的原因是受雷帕霉素抑制,雷帕霉素敏感型mTOR表達減少,而雷帕霉素不敏感型mTOR增多,后者可以引起Akt的磷酸化,短時間藥物刺激更為明顯。這與其他研究者的結(jié)論一致［13］,也反向證明抑制Akt可以增強自體吞噬。自噬的檢測有多種方法,電鏡是公認的金標準。電鏡下如果能觀察到雙層的自噬體、髓磷脂圖像以及泛素化夾雜物則可以認為自噬發(fā)生。電鏡的檢測需要有經(jīng)驗的技師進行操作,除操作復雜外,巨噬細胞還由于其吞噬異物的特性不易與自噬空泡區(qū)分,我們的實驗也觀察到了巨噬細胞的吞噬過程(圖1D)。Atg5和Atg8(哺乳動物為LC3)由于各參與自噬體形成過程中兩大泛素系統(tǒng)［1］也可以作為自噬的標志。LC3Ⅱ形成過程中導致LC3的構(gòu)象改變,這對自噬體的形成非常必要,LC3Ⅱ/LC3-I比值增高可以說明自噬增強。Atg5以Atg12-Atg5-Atg16L復合體的形式定位到自噬小體膜上,并廣泛分布于細胞質(zhì)中