一項關于豬源產氣莢膜梭菌的研究

摘要/Abstract[目的]探究產氣莢膜梭菌臨床分離株毒素類型、抗生素敏感性及益生菌對產氣莢膜梭菌的抑菌效果，以期為產氣莢膜梭菌的臨床用藥及防控提供理論依據和指導。[方法]通過富集培養(yǎng)、分離純化、16S鑒定獲得產氣莢膜梭菌，毒素基因PCR擴增確定菌株類型，紙片法測定分離菌株對抗生素的敏感性，牛津杯法測定益生菌對產氣莢膜梭菌的抑菌作用。[結果]獲得4株產氣莢膜梭菌，毒素基因PCR擴增確定4株菌分別屬于B型、C型、D型3種不同類型；4株菌對頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢呋辛、氨芐西林、羧芐西林、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、氟苯尼考具有較高的敏感性；對阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、麥迪霉素、阿奇霉素、林可霉素、桿菌肽、多粘菌素B、復方新諾明、甲氧芐啶完全耐藥；檢測了17種39株益生菌對產氣莢膜梭菌的抑菌效果，綜合比較發(fā)現，枯草芽孢桿菌-3抑菌效果較為突出，對4株產氣莢膜梭菌的抑菌圈直徑均在15mm以上。[結論]在減抗限抗大背景下，益生菌有望成為產氣莢膜梭菌防控的綠色、環(huán)保、安全的生物制劑。研究背景產氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）也被稱為魏氏梭菌，是一種重要的人畜共患病原菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，可以通過消化道或呼吸道侵入機體，在腸道大量繁殖并產生多種毒素，導致腸道損傷，從而引起人或動物的魏氏梭菌病。根據產生毒素種類和致病性的不同，主要分為A、B、C、D、E5個型。豬的產氣莢膜梭菌病主要是由A型、C型引起的一種急性、致死性腸道傳染病。產氣莢膜梭菌在生豬養(yǎng)殖中具有較高的發(fā)病率和死亡率，主要侵害1周齡仔豬，俗稱仔豬紅??；但是在育肥豬、母豬上也常有報道，感染后表現為血痢，腹部脹氣，病程短，又稱“猝死癥”。目前，養(yǎng)殖場針對產氣莢膜梭菌的預防和感染主要使用抗生素，然而，隨著抗生素耐藥性的增加和國家減抗限抗的要求，產氣莢膜梭菌防控問題更加突出。益生菌作為一種營養(yǎng)和免疫促進劑，廣泛應用于飼料添加劑中，文獻報道某些益生菌具有抑菌活性，但益生菌對產氣莢膜梭菌的抑制效果是否具有普遍性并不確定。某大型豬場母豬發(fā)生零星、急性死亡的病例，發(fā)病豬出現脹氣、排出氣泡樣紅褐色液狀糞便，根據流行特點、臨床癥狀初步診斷為豬產氣莢膜梭菌病，本研究采集糞便樣品進行細菌的分離鑒定和藥敏試驗，同時檢測了益生菌對產氣莢膜梭菌的抑制作用，為產氣莢膜梭菌的臨床用藥及防控提供理論依據和指導。研究結果1.

產氣莢膜梭菌分離鑒定和培養(yǎng)特性本研究采集肛拭子樣品20份，經過富集培養(yǎng)、平板劃線分離共挑取80個菌株進行鑒定，成功分離到4株產氣莢膜梭菌，編號為2#、17#、22#、25#，樣品陽性檢出率為25%。產氣莢膜梭菌陽性肛拭子在增菌培養(yǎng)過程中會產生大量氣體沖開EP管蓋，導致管內培養(yǎng)液減少，如圖1所示，在TSA瓊脂培養(yǎng)皿內的單菌落直徑1~3mm，邊緣不整齊，菌落乳白色不透明，4株菌菌落形態(tài)有差異。分離菌株進行革蘭氏染色為陽性（圖2），粗短大桿菌，兩端鈍圓，單個或成對排列，在實驗室人工培養(yǎng)中未見芽孢形成，2#和17#菌株可觀察到有莢膜形成，17#和25#菌株在液體培養(yǎng)過程中產氣明顯。分離菌株在牛奶發(fā)酵培養(yǎng)基中呈現產氣莢膜梭菌特有的“爆裂發(fā)酵”現象（圖3）。16srDNA序列經比對和產氣莢膜梭菌同源性最高，因此，確定分離菌株為產氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）。在MEGA6中用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對4株菌的遺傳進化關系進行分析，結果如圖4所示。2.

產氣莢膜梭菌PCR分型4株產氣莢膜梭菌毒素基因PCR分型鑒定結果如表2和圖5所示，根據α、β、ε、ι4種最主要的致病性毒素，4株菌分為3個不同的類型，2#菌α、ε陽性為D型產氣莢膜梭菌，17#菌α、β陽性為C型產氣莢膜梭菌，22#和25#菌α、β、ε陽性為B型產氣莢膜梭菌。此外，分離獲得的4株菌β2毒素和腸毒素cpe基因均為陽性，NetB毒素陰性。注：1號泳道：DNA2000Maker；2~5號泳道：產氣莢膜梭菌2#、17#、22#、25#；6號泳道：陰性對照。A：α毒素基因cpa；B：β毒素基因cpb；C：β2毒素基因cpb2；D：ι毒素基因iap；E：ε毒素基因etx；F：CPE毒素基因cpe；G：NetB毒素基因netB。圖5產氣莢膜梭菌毒素基因PCR擴增結果3.

產氣莢膜梭菌耐藥性分析本研究中測定4株產氣莢膜梭菌對8類抗生素的敏感性，結果顯示（表3），β-內酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺醇類和呋喃類對分離到的4株產氣莢膜梭菌均有不同程度的抑制作用，其中β-內酰胺中的頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢呋辛、氨芐西林、羧芐西林，四環(huán)素類中的多西環(huán)素、米諾環(huán)素，酰胺醇類中的氟苯尼考抑菌效果好，抑菌圈直徑在20mm以上。4株菌對氨基糖苷類（阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素）、大環(huán)內酯類（紅霉素、麥迪霉素、阿奇霉素）、多肽類（桿菌肽、多粘菌素B）、磺胺類（復方新諾明、甲氧芐啶）及林可霉素完全耐藥。氨基糖苷類中的新霉素、卡那霉素、丁胺卡那對2#和22#有較弱的抑制作用，但對17#沒有抑菌效果。檢測結果表明，抗生素對產氣莢膜梭菌的抑菌效果具有菌株差異性，本研究中環(huán)丙沙星對22#菌株的抑菌直徑為31.20mm，但對25#菌株的抑菌圈直徑只有11.09mm。4.

益生菌對產氣莢膜梭菌抑制作用共檢測17個種屬39株益生菌對產氣莢膜梭菌的抑制作用，結果如圖6所示：干酪乳桿菌-6、動物乳桿菌、植物乳桿菌、敏捷乳桿菌-1、卷曲乳桿菌、枯草芽孢桿菌-1、枯草芽孢桿菌-3、地衣芽孢桿菌對4株產氣莢膜梭菌均有抑制效果。綜合比較，枯草芽孢桿菌-3對產氣莢膜梭菌的抑制效果較為突出，抑菌圈直徑在15mm以上。圖6益生菌對產氣莢膜梭菌的抑制作用討論與結論本研究分離獲得的4株產氣莢膜梭菌在菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和培養(yǎng)特性上具有差異，16srDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現4株菌的遺傳進化關系不同。根據產氣莢膜梭菌毒素基因PCR分型鑒定結果，4株菌分為3個不同的類型，2#菌為D型，17#菌為C型，22#菌和25#菌為B型，分離獲得的4株菌β2毒素和腸毒素cpe基因陽性，NetB毒素陰性。在產氣莢膜梭菌引起豬病的臨床研究中，目前報道的只有A型和C型，還未見B型和D型的報道，B型和D型主要引起羔羊痢疾和羊腸毒血癥。但不同動物源產氣莢膜梭菌的跨物種傳播已有研究報道，最近的一項研究發(fā)現，動物園狼能夠感染雞源產氣莢膜梭菌并導致死亡。本研究首次同時從豬的臨床樣品中分離到B、C、D3種毒素類型的產氣莢膜梭菌，說明B型和D型也會引起豬的產氣莢膜梭菌病，也說明了豬場產氣莢膜梭菌感染的復雜性，給該病的預防和治療帶來了更大的挑戰(zhàn)?？股孛舾行栽囼灠l(fā)現，β-內酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺醇類和呋喃類對4株產氣莢膜梭菌均有一定的抑制作用。董秀梅等從臨床病料中分離到1株產氣莢膜梭菌，藥敏紙片結果顯示，其分離株對氟苯尼考、頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟敏感，與本研究結果類似，但其分離株也對喹諾酮類（諾氟沙星、環(huán)丙沙星）敏感，而本研究中4株菌對諾氟沙星不敏感，對環(huán)丙沙星的敏感性具有極大的菌株差異性。張疏桐等的研究發(fā)現，產氣莢膜梭菌對β-內酰胺類較為敏感，對阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素等氨基糖苷類耐藥，與本研究結果一致。因此，在產氣莢膜梭菌感染中，可優(yōu)先考慮β-內酰胺類和氟苯尼考等藥物。在全球養(yǎng)殖限抗、禁抗的大背景下，益生菌作為抗生素的替代物之一，具有綠色、安全、有效的優(yōu)點，拮抗病原菌的同時能夠調節(jié)腸道菌群、維持和修復腸道物理和化學屏障、提高機體免疫力等。在本研究采集樣品的豬場中，根據臨床癥狀初步確定為產莢膜梭菌感染后，推薦豬場使用益生菌復合制劑，一段時間后，母豬整體的健康狀態(tài)得到改善，出現脹氣的母豬數量明顯減少。因此，在成功分離獲得產