微生物技術(shù)-課件

食源性致病微生物是指以食物為載體，導(dǎo)致人類發(fā)生疾病的一大類微生物（古菌、細(xì)菌、真菌、病毒等）。近年來，全球食品安全事件頻頻發(fā)生，如美國的“李斯特氏桿菌事件”、日本的“大腸桿菌0l57流行事件”等，對(duì)人類健康帶來很大危害，引起各國政府的全力關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法(如分離培養(yǎng)、生化鑒定等)無法對(duì)難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病微生物進(jìn)行檢測(cè)，而且特異性不高、靈敏度低、操作煩瑣耗時(shí)，不能實(shí)現(xiàn)有效的監(jiān)測(cè)、預(yù)防作用。因此，發(fā)展新的快速檢測(cè)與鑒定食源性致病微生物的方法是及時(shí)有效地控制和預(yù)防致病微生物傳播的前提。

I.國內(nèi)外食源性致病微生物檢測(cè)新技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展1ppt課件食源性致病微生物是指以食物為載體，導(dǎo)1國內(nèi)外食源性致病微生物檢測(cè)新技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等技術(shù)生物芯片技術(shù)代謝學(xué)技術(shù)其它技術(shù)2ppt課件國內(nèi)外食源性致病微生物檢測(cè)新技術(shù)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)2ppt課件2精品資料精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結(jié)一節(jié)課的重點(diǎn)的難點(diǎn)，你是否會(huì)認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學(xué)問無顏見爹娘……”“太陽當(dāng)空照，花兒對(duì)我笑，小鳥說早早早……”微生物技術(shù)--ppt課件4一免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫熒光技術(shù)免疫磁性分離技術(shù)免疫膠體金技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)(VIDAS)

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)的相結(jié)合，是一種可以定位、定性和定量的綜合技術(shù)，具高專一性和高敏感度。5ppt課件一免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫熒光技術(shù)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)將抗原51.免疫熒光技術(shù)原理與特點(diǎn)：免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上，與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。此技術(shù)的主要特點(diǎn)有特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。應(yīng)用：此技術(shù)可用來對(duì)沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E·ColiO157和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等進(jìn)行快速檢測(cè)。王軍等建立了養(yǎng)殖大黃魚病原溶藻弧菌的熒光抗體免疫快速檢測(cè)技術(shù)。6ppt課件1.免疫熒光技術(shù)原理與特點(diǎn)：免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗62.免疫磁性分離技術(shù)原理與特點(diǎn)：免疫磁性分離技術(shù)是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病菌發(fā)生特異性的結(jié)合，載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場(chǎng)的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病菌不斷得到分離、濃縮。免疫磁性分離技術(shù)代替了常規(guī)的選擇性增菌培養(yǎng)過程，可特異有效地將目的微生物從樣品中快速的分離出來。應(yīng)用：Skjerve等報(bào)道了采用免疫磁性分離技術(shù)，從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分離沙門氏菌，其檢測(cè)靈敏度為100CFU／g。在英國，此法主要應(yīng)用于牛奶中大腸桿菌O157：H7的監(jiān)測(cè)和食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、小腸結(jié)腸耶爾森氏菌)等的檢測(cè)。在實(shí)際應(yīng)用中，還可以與直接鏡檢技術(shù)、陽抗技術(shù)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、PCR等技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用。此外，以免疫磁性分離技術(shù)為基礎(chǔ)的免疫膠體金技術(shù)已成功應(yīng)用于Ol群霍亂弧菌的檢測(cè)。

7ppt課件2.免疫磁性分離技術(shù)原理與特點(diǎn)：免疫磁性分離技術(shù)是將特異性73.免疫膠體金技術(shù)

原理與特點(diǎn)：免疫膠體金技術(shù)起源于1971年Faulk等應(yīng)用電鏡免疫膠體金染色法(IGS)觀察沙門菌。其基本原理是以微孔濾膜為載體包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結(jié)合，再用膠體金結(jié)合物標(biāo)記而達(dá)到檢測(cè)目的。其特點(diǎn)是單份測(cè)定、簡(jiǎn)單快速、特異敏感，幾分鐘就可用肉眼觀察到顏色鮮明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并可保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。8ppt課件3.免疫膠體金技術(shù)原理與特點(diǎn)：免疫膠體金技術(shù)起源于19784.酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)原理：1971年Engvall建立了ELISA方法，它以酶或者輔酶作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或者抗體，用酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級(jí)免疫學(xué)反應(yīng)，并且利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板(或球)吸附抗原或者抗體，使其固相化，在其中進(jìn)行免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)。根據(jù)酶反應(yīng)底物顯色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。特點(diǎn)：由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定具有極高的靈敏度。ELISA具有選擇性好、結(jié)果判斷客觀準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、樣品處理量大、以及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了經(jīng)典化學(xué)分析方法和其他儀器測(cè)試手段的不足。9ppt課件4.酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)原理：1971年Engva9應(yīng)用：ELISA技術(shù)自二十世紀(jì)70年代出現(xiàn)開始，在臨床和生物疾病診斷與控制等領(lǐng)域中倍受重視。特別是隨著蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，各種高純度抗體、抗原和抗體復(fù)合物得以制備，單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用，使得該診斷檢測(cè)技術(shù)在特異性、靈敏度和客觀性方面都有了大幅度的提高，并且在自動(dòng)化免疫技術(shù)的推進(jìn)之下進(jìn)一步具有了精確的定量分析能力。由于ELISA的技術(shù)條件要求低、適用范圍寬、攜帶方便、且易商品化、操作簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，它已成為一種應(yīng)用最為廣泛和發(fā)展最為成熟的生物檢測(cè)與分析技術(shù)，常以試劑盒的形式出現(xiàn)。10ppt課件應(yīng)用：ELISA技術(shù)自二十世紀(jì)70年代出現(xiàn)開始，在臨床和生物10完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：(1)包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑)；(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體；(3)酶的底物：(4)陰性和陽性對(duì)照品(定性測(cè)定)，參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清(定量測(cè)定)；(5)結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；(6)洗滌液；(7)酶反應(yīng)終止液。結(jié)合物為酶標(biāo)記的抗體(或抗原)，是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗體(或抗原)的免疫活性。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP)和堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AP)。國產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制各結(jié)合物。國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶(AP)作為標(biāo)記酶。11ppt課件完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：(1)包被抗原或抗體的11

近年來，該項(xiàng)技術(shù)在食品安全性檢測(cè)中正逐步得以推廣應(yīng)用，如微生物污染、天然毒性物、人獸共患疾病病原體檢測(cè)等方面的檢測(cè)分析。微生物污染：KryinskiandHeimsch等(1977)首次將ELISA用于食品沙門氏菌(Salmonellaspp．)的檢測(cè)，并在應(yīng)用中不斷得以發(fā)展。目前有許多種方法，其中通過制備單克隆抗體分析食品中細(xì)菌的ELISA技術(shù)研究最多，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。例如對(duì)沙門氏菌最低檢測(cè)量可達(dá)500CFU／g，僅需22h，比常規(guī)方法縮短了3～4d，與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無交叉反應(yīng)。此外以ELISA技術(shù)為基礎(chǔ)的全自動(dòng)沙門氏菌檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)過程的自動(dòng)化，全程耗時(shí)僅為45min。毒素檢測(cè)：真菌毒素(mycotoxin)是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中的十幾種對(duì)人類危害較大，它們一般同時(shí)具有毒性強(qiáng)和污染頻率高的特點(diǎn)。其中毒性最大、致癌能力最強(qiáng)的是黃曲霉毒素(AFT)。它在自然界中分布十分廣泛，黃曲霉常常和其他多種微生物在一起，生長(zhǎng)在糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料中。自1977年抗黃曲霉素B1的單克隆問世，至今，幾乎所有重要真菌毒素(如伏馬毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉素等)的ELISA檢測(cè)方法均已建立。12ppt課件近年來，該項(xiàng)技術(shù)在食品安全性檢測(cè)中正逐步得以推12

人獸共患疾病病原體檢測(cè)：海綿狀病毒(BSE)是牛的一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，它與人群發(fā)生變異型克雅氏病(VCJD)有關(guān)。對(duì)于該病病原，普遍認(rèn)為是由一種蛋白質(zhì)性的感染顆粒也稱朊蛋白，是一種病理性細(xì)胞朊蛋白(PrPSc)，由正常的細(xì)胞朊蛋白(PrPc)轉(zhuǎn)變而來。蛋白酶核心位點(diǎn)的抗體應(yīng)用于檢測(cè)正常及BSE動(dòng)物腦組織PrPc的含量，對(duì)于天然組織，兩組差異很小，但經(jīng)加熱及異硫氰酸胍處理后，ELISA可將牛腦勻漿物中BSE特異性的PrPSc與PrPc區(qū)分開來，無明顯臨床癥狀的BSE感染動(dòng)物可被檢出，經(jīng)對(duì)朊蛋白Western印跡法檢測(cè)牛及羊朊病毒蛋白的靈敏度、特異性及可靠性進(jìn)行分析，證明該方法是有效的。此外，在禽流感病毒檢測(cè)方面，我國已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用，建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù)，已形成試劑盒生產(chǎn)能力。13ppt課件人獸共患疾病病原體檢測(cè)：海綿狀病毒(BSE)是13ELISA技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)高度免疫原性的重組抗原：通過基因工程技術(shù)可以快速、批量地生產(chǎn)出具有高度免疫原性的重組抗原，用來替代某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)，進(jìn)一步地?cái)U(kuò)大了ELISA檢測(cè)分析范圍。重組抗原在純度上要高于通過裂解病原體所提取的抗原。用于檢測(cè)的重組抗原有可能最終達(dá)到以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：(1)包括所有能引起機(jī)體強(qiáng)免疫應(yīng)答的病原體抗原決定簇：(2)不含或盡可能少含非特異性抗原或共同抗原。多項(xiàng)標(biāo)志物快速測(cè)定：利用酶聯(lián)免疫技術(shù)同時(shí)對(duì)待檢樣本中的多項(xiàng)標(biāo)志物進(jìn)行快速測(cè)定。這對(duì)于某些常需同時(shí)測(cè)定的標(biāo)志物來說，可節(jié)省測(cè)定時(shí)間。可以通過以下兩種方法來達(dá)到這一目標(biāo)：(1)通過基因工程技術(shù)表達(dá)特定的融合蛋白質(zhì)將多種不同蛋白質(zhì)的功能構(gòu)建在一起，可以快速方便地同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)標(biāo)志物；(2)采用幾種能夠催化各自底物產(chǎn)生不同顏色反應(yīng)的酶，分別標(biāo)記具有不同特異性的抗體或抗原，反應(yīng)后用其各自的酶底物顯色，從而達(dá)到了同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)標(biāo)志物的目的。14ppt課件ELISA技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)高度免疫原性的重組抗原：通過基因工14天然酶定向改造和體外分子進(jìn)化：運(yùn)用天然酶定向改造和體外分子進(jìn)化手段，研究開發(fā)的免疫測(cè)定標(biāo)記用酶融合蛋白(一種同時(shí)具有催化底物顯色反應(yīng)酶活性和特異性抗體或抗原性質(zhì)的融合蛋白)可以作為結(jié)合物(酶標(biāo)記的抗原或抗體)直接用于ELIAS試劑盒。這使得ELIAS試劑盒在其生產(chǎn)過程中不但避免了繁瑣且低效率的酶與特異性抗體或抗原的化學(xué)交聯(lián)過程，而且無需得到純化的酶和抗體或抗原，從而大大地提高了ELIAS試劑盒產(chǎn)品的穩(wěn)定性，使其結(jié)果具有更好重復(fù)性。自動(dòng)化的酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù).近年來所出現(xiàn)的全自動(dòng)酶標(biāo)測(cè)定分析儀，不但減輕了實(shí)驗(yàn)室人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，而且大大提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。這樣有利于ELISA技術(shù)在檢測(cè)分析中的進(jìn)一步商品化推廣。15ppt課件天然酶定向改造和體外分子進(jìn)化：運(yùn)用天然酶定向改造和體外分子進(jìn)155．酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)(VIDAS)原理與特點(diǎn)：酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)將酶系統(tǒng)與熒光免疫分析結(jié)合起來，在普通酶免疫分析的基礎(chǔ)上用理想的熒光底物代替生色底物，就可提高分析的靈敏度和增寬測(cè)量范圍，減少試劑的用量。酶放大技術(shù)、固相分離及熒光檢測(cè)三者的聯(lián)合將成為熒光免疫分析中最靈敏的方法。應(yīng)用：陳思強(qiáng)等采用自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)凍肉中沙門氏菌。16ppt課件5．酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)(VIDAS)原理與特點(diǎn)：酶聯(lián)熒光免16二聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)rRNA序列分析法依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)多重PCR檢測(cè)技術(shù)(m-PCR)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是近十多年來應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)方法，在食源性致病微生物的檢測(cè)中均是以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而用凝膠電泳和紫外核酸檢測(cè)儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。

17ppt課件二聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)rRNA序列分析法17PCR原理PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

18ppt課件PCR原理PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依182．依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)1)隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)。隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性主要用于不考慮微生物核酸精確序列的情況下，比較微生物間的DNA指紋圖譜差異，用于細(xì)菌種問的鑒定，Black等將毛細(xì)管熱循環(huán)儀及RAPD技術(shù)用于李斯特氏菌(ListeriaPirie)的鑒定，3h即可出結(jié)果。依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)是通過各種改進(jìn)的PCR技術(shù)，使目標(biāo)微生物的核酸經(jīng)擴(kuò)增后，產(chǎn)生多條DNA擴(kuò)增片段(特異性和非特異性的)，通過統(tǒng)計(jì)分析，找出某種微生物的特有條帶，進(jìn)行區(qū)別鑒定。19ppt課件2．依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)依賴PCR的192)基因內(nèi)重復(fù)性一致序列(ERIC)的擴(kuò)增.ERIC片段是存在于腸道細(xì)菌核酸中的重復(fù)DNA序列，含有一段高度保守的中心反轉(zhuǎn)重復(fù)序列，分布在細(xì)菌染色體的不同位點(diǎn)上且以不同的距離分隔，因此，以這些重復(fù)的DNA片段作為PCR擴(kuò)增時(shí)引物的結(jié)合位點(diǎn)，使其被分隔的片段大量擴(kuò)增，在凝膠電泳上形成一系列的條帶，從而區(qū)分不同的腸道細(xì)菌。Versalovio等曾用與ERIC重復(fù)序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段作為引物及斑點(diǎn)雜交DNA探針來檢測(cè)包括大腸桿菌(E．coli)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)等不同菌種間存在的特異DNA指紋圖譜。與RAPD相比，此法引用的引物序列固定，結(jié)果的重復(fù)性更好。20ppt課件2)基因內(nèi)重復(fù)性一致序列(ERIC)的擴(kuò)增.20ppt課件203）食品中致病菌靶基因的PCR檢測(cè)21ppt課件3）食品中致病菌靶基因的PCR檢測(cè)21ppt課件21沙門菌可致多種感染．輕者為自愈性胃腸炎，重可引起致死性傷寒。沙門菌主要含有3種抗原結(jié)構(gòu)，即菌體(0)抗原，鞭毛(H)抗原及表面抗原(Vi抗原等)。沙門菌有較強(qiáng)的內(nèi)毒素，引起發(fā)熱，白細(xì)胞改變，中毒性休克，并能激活補(bǔ)體系統(tǒng)．某些沙門菌能產(chǎn)生類似大腸埃希菌的腸毒素，有Vi抗原的沙門菌具有侵襲力，而且被細(xì)胞吞噬后，不被破壞。3．1invAgene是編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的基因，是一段只存在于致病性沙門菌中的獨(dú)特的保守基因序列[】]。它是毒力島SP11基因之一。3．2傷寒沙門茵鞭毛抗原基因雖然鞭毛抗原Hd也存在于其他沙門菌中，但其高變區(qū)1072—1089區(qū)域?yàn)閭抽T菌所獨(dú)有[】，還可以用sefA基因(編碼鞭毛的抗原)設(shè)計(jì)引物用PCR方法檢出沙門菌。3．3ViaBgene致病的傷寒沙門菌都具有Vi抗原，vi多糖抗原為N一乙酰半乳糖胺糖醛酸多聚物，Vi抗原產(chǎn)物由染色體中ViaA和ViaB兩組基因所控制，其中ViaB基因被認(rèn)為是Vi抗原表達(dá)的特異結(jié)構(gòu)基因[]。3．4hjlAgene編碼沙門菌侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白，與沙門菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞侵襲力有關(guān)。3．5rfbgene革蘭陰性菌外膜主要成分為脂多糖(Lipopo—lysaccharide，LPS)，其多糖部分(含0一特異性多糖和核心多糖)參與了細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，侵襲和在細(xì)胞間擴(kuò)散的過程，是細(xì)菌的致病因子之一，而LPS的0抗原部分由rfb基因編碼。3．6ompCgene編碼沙門菌外膜蛋白基因。22ppt課件沙門菌可致多種感染．輕者為自愈性胃腸炎，重可引起致死性傷寒。223．多重PCR檢測(cè)技術(shù)(m-PCR)原理與特點(diǎn)：PCR技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用于食品中單一致病菌的檢測(cè)，并得到一定程度的推廣，但食品中往往含有多種致病菌。多重PCR的建立，實(shí)現(xiàn)了多種食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè)。m-PCR是指在同一個(gè)反應(yīng)體系中，加入多對(duì)特異性引物，如果存在與各引物對(duì)特異性互補(bǔ)的模板，即可同時(shí)在同一反應(yīng)管中擴(kuò)增出一條以上的目的DNA片段，實(shí)現(xiàn)了一次性檢測(cè)多種致病菌的目的。M-PCR既保留了常規(guī)PCR的特異性、敏感性，又減少了操作步驟及試劑。但也存在較明顯的不足：擴(kuò)增效率不高、敏感性偏低；擴(kuò)增條件需摸索與協(xié)調(diào)；可能出現(xiàn)引物間干擾等。應(yīng)用：1999年，R．Y．C．Kong等運(yùn)用m-PCR技術(shù)，用六對(duì)引物分別對(duì)產(chǎn)毒素性大腸桿菌(ETEC)的不耐熱腸毒素LT1、LT2和ST1基因、腸道出血性大腸桿菌(EHEC)的VT1、VT2基因及腸道致病性大腸桿菌(EPEC)的EAE毒素基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)88株從水環(huán)境中分離的菌株進(jìn)行篩查，監(jiān)測(cè)了水樣受糞便污染的程度，檢測(cè)靈敏度達(dá)到100CFU，100u1。2002年又通過多重PCR實(shí)現(xiàn)了海水中氣單胞菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、沙門氏菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌六種病原細(xì)菌的同時(shí)快速檢測(cè)。我國學(xué)者嚴(yán)笠等應(yīng)用m-PCR，在同一擴(kuò)增體系中同時(shí)擴(kuò)增了大腸埃希氏菌O157：、沙門氏菌和志賀氏菌特征性基因，最后通過凝膠電泳實(shí)現(xiàn)了這三種致病菌的同時(shí)快速檢測(cè)，取得理想結(jié)果。23ppt課件3．多重PCR檢測(cè)技術(shù)(m-PCR)原理與特點(diǎn)：PCR技術(shù)已234．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

原理與特點(diǎn)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法，有效地解決了內(nèi)標(biāo)定量PCR只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值(每個(gè)反應(yīng)內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Cyclethreshold)計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得定量結(jié)果，定量的根本原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性反比關(guān)系。24ppt課件4．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)原理與特點(diǎn)：實(shí)時(shí)熒光定24Ct值是如何得到的？在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的過程中，靶序列的擴(kuò)增與熒光信號(hào)的檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，定量PCR儀全程采集熒光信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分析軟件自動(dòng)按數(shù)學(xué)算法扣除熒光本底信號(hào)并設(shè)定閾值從而得到每個(gè)樣品的Ct值。25ppt課件Ct值是如何得到的？25ppt課件25Ct值的定義Ct值中的“C”代表Cycle（循環(huán)），“t”代表檢測(cè)threshhold（閾值），其含義是PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)；也可以理解為擴(kuò)增曲線與閾值線交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)。Ct值與樣品中模板的對(duì)應(yīng)關(guān)系Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性反比關(guān)系（y=ax+b，x代表起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，y代表Ct值）。由于Ct值是反映實(shí)際PCR反應(yīng)過程中擴(kuò)增即將進(jìn)入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的影響，因此利用Ct值判斷的起始模板拷貝數(shù)更加精確，重復(fù)性也更好。此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR還能從方法學(xué)上有效的防止PCR實(shí)驗(yàn)中交叉污染的問題。因?yàn)闊晒舛縋CR中模板的擴(kuò)增與檢測(cè)是同時(shí)進(jìn)行的，當(dāng)實(shí)驗(yàn)完成后即可獲得定量結(jié)果，直接丟棄含有大量擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管，徹底避免了傳統(tǒng)方法中取出擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成二次污染的可能性。提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。26ppt課件Ct值的定義26ppt課件26熒光定量PCR的2類方法

1.染料法（SYBRGreen法）染料法即利用SYBRGreen分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)來進(jìn)行樣品定量。該方法與常規(guī)的PCR類似，唯一的區(qū)別是在反應(yīng)體系中加入了SYBRGreen染料分子。該染料分子的激發(fā)波長(zhǎng)為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm。與EB的性能類似，SYBRGreen也是一種扁平狀的分子，處于游離狀態(tài)時(shí)具有很低的熒光本底，當(dāng)反應(yīng)體系中存在dsDNA時(shí)，SYBRGreen能特異性的與之結(jié)合并在497nm激發(fā)下。染料法的優(yōu)點(diǎn)：1，無需設(shè)計(jì)、合成探針，實(shí)驗(yàn)成本低；2，使用方便，與常規(guī)PCR的操作幾乎相同。染料法的缺點(diǎn)：1，由于SYBRGreen與dsDNA的結(jié)合只具有結(jié)構(gòu)特異性而不具有序列特異性，除了與特異性的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合外，還能與在PCR擴(kuò)增過程中形成的引物二聚體、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，從而造成擴(kuò)增效率的降低、結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此采用該方法對(duì)于引物的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化要求很高，確保反應(yīng)過程中沒有非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增；2，由于SYBRGreen的上述特點(diǎn)，該方法不能應(yīng)用于MultiplexQPCR技術(shù)。（在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因的表達(dá)情況）27ppt課件熒光定量PCR的2類方法1.染料法（SYBRGree272.探針法（以TaqMan探針為例）

探針法熒光定量PCR與常規(guī)PCR的不同之處在于：在上、下游引物外還加入了具有序列特異性的探針（探針本身具有熒光標(biāo)記），該探針根據(jù)需要擴(kuò)增的靶序列設(shè)計(jì)因此只能與待檢測(cè)序列結(jié)合，與染料法相比提高了實(shí)驗(yàn)的特異性。目前市場(chǎng)上的探針主要種類有：TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探針應(yīng)用最廣泛。

TaqMan探針的結(jié)構(gòu)：長(zhǎng)度與普通PCR引物類似，大約20bp左右。在5’與3’端各標(biāo)記有一個(gè)熒光基團(tuán)，5’的熒光基團(tuán)稱為報(bào)告基團(tuán)（Report），3’的熒光基團(tuán)稱為淬滅基團(tuán)（Quencher）。

TaqMan探針的性能：在探針結(jié)構(gòu)完整的情況下用特定的波長(zhǎng)激發(fā)報(bào)告基團(tuán)，由于報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的空間位置很近，因此報(bào)告基團(tuán)能夠通過FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）將接受的能量轉(zhuǎn)移到淬滅基團(tuán)，使后者以發(fā)射熒光或熱量的方式釋放能量，而報(bào)告基團(tuán)并不發(fā)射特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。與染料法相比TaqMan探針法的優(yōu)點(diǎn)：1，實(shí)驗(yàn)的特異性得到了提高；2，對(duì)探針的5’端采用不同的熒光標(biāo)記就可以進(jìn)行MultiplexQPCR。與染料法相比TaqMan探針法的缺點(diǎn)：1，探針的使用提高了實(shí)驗(yàn)成本；2，探針的使用需要設(shè)計(jì)及優(yōu)化。28ppt課件2.探針法（以TaqMan探針為例）28ppt課件28TaqMan探針法工作原理：1、變性（95°C）：模板dsDNA充分解鏈；2、復(fù)性、延伸、酶切降解（60°C）：1）探針與靶序列結(jié)合；2）上、下游引物與靶序列結(jié)合；3）上、下游引物在Taq酶的作用下合成互補(bǔ)鏈（5’→3’聚合功能）；4）當(dāng)上游引物延伸到TaqMan探針的5’端時(shí)，延伸不能繼續(xù)，此時(shí)Taq酶發(fā)揮5’→3’外切功能將探針逐一水解并繼續(xù)向前延伸直至完成互補(bǔ)鏈的合成；3、熒光信號(hào)的檢測(cè)：由于TaqMan探針被水解，報(bào)告基團(tuán)在受到激發(fā)后不能再通過FRET作用將接受的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)，因此可以檢測(cè)到報(bào)告基團(tuán)特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，起始模板濃度越高熒光信號(hào)越強(qiáng)。29ppt課件TaqMan探針法工作原理：1、變性（95°C）：模板dsD29三、生物芯片技術(shù)近幾年來，人們普遍較為關(guān)注“生物芯片”和“微芯片”在食源性致病菌等微生物的檢測(cè)。在設(shè)計(jì)生物芯片時(shí)，可以在芯片上加上不同種類的抗體或者DNA分子，以便在同一個(gè)片上同時(shí)完成對(duì)沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌、葡萄球菌等的檢測(cè)。據(jù)Heron報(bào)道，生物芯片在本世紀(jì)會(huì)有舉足輕重的作用，其市場(chǎng)價(jià)值可達(dá)50億美元之高。1.基因芯片(genechip)技術(shù)2.免疫芯片技術(shù)30ppt課件三、生物芯片技術(shù)近幾年來，人們普遍較為關(guān)注“生物芯片”和“301.基因芯片(genechip)技術(shù)原理：基因芯片是二十世紀(jì)90年代中期誕生的一項(xiàng)新型生物技術(shù)。將各種基因(16SrDNA、23SrDNA、ERIC等)寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測(cè)樣品是否存在某些特定微生物。該技術(shù)可檢測(cè)各種環(huán)境或媒介中的微生物，研究復(fù)雜微生物群體的基因表達(dá)。特點(diǎn):與傳統(tǒng)方法相比，基因芯片技術(shù)先進(jìn)性主要體現(xiàn)在：(a)基因芯片可以對(duì)環(huán)境中的微生物實(shí)現(xiàn)高通量和并行檢測(cè)，一次實(shí)驗(yàn)即可得出全部結(jié)果；(b)操作簡(jiǎn)便快速，整個(gè)檢測(cè)4h基本可以出結(jié)果，而傳統(tǒng)方法一般需4～7d時(shí)間；(C)特異性強(qiáng)，敏感性高。31ppt課件1.基因芯片(genechip)技術(shù)原理：基因芯片是二十世31具體方法PCR擴(kuò)增引物、芯片探針的設(shè)計(jì)與合成。基因芯片的制備。樣品的采集制備和DNA分離純化。雜交檢測(cè)和結(jié)果分析。32ppt課件具體方法PCR擴(kuò)增引物、芯片探針的設(shè)計(jì)與合成。32ppt課件32應(yīng)用：基因芯片技術(shù)理論上可以在一次實(shí)驗(yàn)中檢出所有潛在的致病原，也可以用同一張芯片檢測(cè)某一致病原的各種遺傳學(xué)指標(biāo)；同時(shí)檢測(cè)的靈敏度、特異性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析檢測(cè)中有很好的發(fā)展前景。近年來許多研究者對(duì)基因芯片分析檢測(cè)食品中常見致病菌進(jìn)行了一系列探討。勒連群等采用合成后點(diǎn)樣的方法，把自行合成的一系列寡核苷酸探針固定在經(jīng)過醛基化修飾的顯微鏡載玻片上，制成用于致病菌檢測(cè)的基因芯片。在相同的條件下，擴(kuò)增了涉及12個(gè)菌屬的151株細(xì)菌的16SrDNA基因片段并與基因芯片雜交，經(jīng)ScanArray3000芯片閱讀儀掃描得到特異性的雜交圖，得到一套屬(種)特異的典型雜交圖譜，然后將待檢的樣品菌與基因芯片進(jìn)行雜交，得到的雜交結(jié)果與典型圖譜比對(duì)即可判斷出樣品的種類，準(zhǔn)確率達(dá)到96．2％。唐曉敏等利用此技術(shù)檢測(cè)水中常見致病菌，與傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果一致性為95％，并且對(duì)于一個(gè)未知菌落，可以在4h之內(nèi)完成菌種判斷，為快速檢測(cè)與鑒定常見致病菌提供了有效的手段。33ppt課件應(yīng)用：基因芯片技術(shù)理論上可以在一次實(shí)驗(yàn)中檢出所有潛在的致病原33FunctionalGeneArrays(FGA)forMicrobialCyclingofC,S,N,andPCalvincycle:500rTCAcycleAcetyl-CoA3-HPProbesavailablefortargetingCO2fixationgenes:Nitrogencycling:5089Sulfurcycling:1006Phosphorusutilization:438Carbondegradation:>1000Probesavailablefortargetingotherfunctionalgenes:}300ABCD34ppt課件FunctionalGeneArrays(FGA)f34Fig.7HierarchicalclusteranalysisofmcrAgenerelationshipsbasedonhybridizationsignalintensity.RepresentativegenesversusdepthwatersamplescollectedfromMC118andGC234ofGOM.ThetreewasgeneratedusingCLUSTERandwasvisualizedwithTREEVIEW.Blackindicatesnodetectablehybridizationabovethebackgroundlevels,whileredindicatespositivehybridizationsignals.Thecolorintensitiesindicatedifferencesinhybridizationsignalintensity.35ppt課件Fig.7Hierarchicalclusteran352.免疫芯片技術(shù)免疫芯片是指包被在固相載體上的高密度抗原或抗體微點(diǎn)陣，是在載體上已設(shè)計(jì)好的微陣列方式同定多種抗體或抗原，用標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原，利用配體間特異的相互作用方式進(jìn)行反應(yīng)、結(jié)合，然后通過特定的掃描裝置進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果由計(jì)算機(jī)分析處理。高志賢等已將該技術(shù)用于檢測(cè)葡萄球菌腸毒素。36ppt課件2.免疫芯片技術(shù)免疫芯片是指包被在固相載體上的高密度抗原或抗36四.代謝學(xué)技術(shù)電阻抗技術(shù)微熱量計(jì)技術(shù)放射測(cè)量技術(shù)接觸酶測(cè)定技術(shù)37ppt課件四.代謝學(xué)技術(shù)電阻抗技術(shù)37ppt課件371.電阻抗技術(shù)電阻抗技術(shù)是指細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的過程中，會(huì)使培養(yǎng)基中的大分子電惰性物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等，代謝為具有電活性的小分子物質(zhì)，如乳酸鹽、醋酸鹽等，這些離子態(tài)物質(zhì)能增加培養(yǎng)基的導(dǎo)電性，使培養(yǎng)基的阻抗發(fā)生變化，通過檢測(cè)培養(yǎng)基的電阻抗變化情況，即可判定細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖特性。該法已用于食品中細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌、沙門氏菌、酵母菌、霉菌和支原體的檢測(cè)，具有高敏感性、特異性、反應(yīng)快和高度重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。李小燕應(yīng)用此法來快速檢測(cè)鮮奶中大腸菌群。38ppt課件1.電阻抗技術(shù)電阻抗技術(shù)是指細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的過程中，382.微熱量計(jì)技術(shù)微熱量計(jì)技術(shù)(Microcalorimetry)是通過測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)熱量的變化進(jìn)行細(xì)菌的檢出和鑒別。微生物在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生熱量，用微量熱計(jì)測(cè)量產(chǎn)熱量等數(shù)據(jù)，均存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)中，經(jīng)過適當(dāng)信號(hào)上的數(shù)字模擬界面，在記錄器上繪制成以產(chǎn)熱量對(duì)比時(shí)間組成的熱曲線圖。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)所得的熱曲線圖，和已知細(xì)菌熱曲線圖直觀比較，即對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒別。劉永軍等采用該技術(shù)研究細(xì)菌的抑制作用。39ppt課件2.微熱量計(jì)技術(shù)微熱量計(jì)技術(shù)(Microcalorimetr393.放射測(cè)量技術(shù)

放射測(cè)量技術(shù)是根據(jù)細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過程中代謝碳水化合物的CO2的原理，把微量的放射性14C標(biāo)記引入碳水化合物或鹽類等底物分子中進(jìn)行檢測(cè)的。在細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，這些底物被利用并釋放出含放射性的14CO2，然后通過自動(dòng)化放射測(cè)定儀Bactec測(cè)量14CO2的含量，從而根據(jù)。14CO2含量的多少來判斷細(xì)菌的數(shù)量。這一方法已用于測(cè)定食品中的細(xì)菌，具有快速、準(zhǔn)確度高和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。減改華等應(yīng)用放射測(cè)量技術(shù)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行定量檢測(cè)。40ppt課件3.放射測(cè)量技術(shù)放射測(cè)量技術(shù)是根據(jù)細(xì)菌404．接觸酶測(cè)定技術(shù)接觸酶測(cè)定技術(shù)是通過計(jì)算一個(gè)含有接觸酶的紙盤，在盛有H2O2的試管中的漂浮時(shí)間來估計(jì)菌數(shù)。接觸酶與H2O2之間產(chǎn)生生化反應(yīng)，放出氧氣，使紙盤由試管底部浮到表面。當(dāng)樣品中接觸酶含量高時(shí)(表明接觸酶陽性細(xì)菌含量高)，紙盤上浮的時(shí)間短(以秒計(jì))。大多數(shù)腐敗微生物是嗜冷性細(xì)菌。而大多數(shù)嗜冷細(xì)菌接觸酶呈陽性，故可以用接觸酶反應(yīng)來估計(jì)食品中的嗜冷性菌群。41ppt課件4．接觸酶測(cè)定技術(shù)接觸酶測(cè)定技術(shù)是通過計(jì)算一個(gè)含有接觸酶的紙41II.其它微生物研究技術(shù)1、rRNA序列分析法2.DNA堿基比例的測(cè)定（G+Cmol%）3.DNA-DNA分子雜交

4.全基因組測(cè)序5.蛋白質(zhì)分析6.雙向電泳（2-DE）技術(shù)7.質(zhì)譜（MS）技術(shù)8.電鏡觀察42ppt課件II.其它微生物研究技術(shù)1、rRNA序列分析法42ppt課421、rRNA序列分析法

rRNA序列分析大大推動(dòng)了微生物分類學(xué)的發(fā)展。微生物含有3個(gè)rRNA分子：23S、16S和5S，它們序列長(zhǎng)度分別約為2900、1540、120bp。其中16SrRNA分子量適中，含有較大信息量，堿基順序保守性強(qiáng)且穩(wěn)定，是鑒別生物間進(jìn)化關(guān)系的重要分子，也是研究生物系統(tǒng)進(jìn)化過程中的分子鐘，一般認(rèn)為，16SrDNA序列同源性小于97%可以認(rèn)為屬于不同的種，同源性小于93-95%可以認(rèn)為屬于不同的屬（崔宗均，2003；Dongetal，1997）。16SrRNA的序列分析表明它在種以上微生物相關(guān)性具有很高的分辨力，但在進(jìn)化關(guān)系密切的微生物種內(nèi)的分辨力還是有限的（Dongetal，1997；Mrabetetal，1992），因此16SrRNA對(duì)于劃分種的界限沒有確切的數(shù)值（Tamaoka，1994）。43ppt課件1、rRNA序列分析法rRNA序列分析大大推動(dòng)了微生物43BL1菌株的鑒定。A：BL1基因組，B：16SrDNAPCR結(jié)果，C：重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證44ppt課件BL1菌株的鑒定。A：BL1基因組，B：16SrDNAP449株菌遺傳進(jìn)化樹45ppt課件9株菌遺傳進(jìn)化樹45ppt課件452.DNA堿基比例的測(cè)定（G+Cmol%）G+C含量是應(yīng)用最普遍的分類指標(biāo)之一，這個(gè)參數(shù)在種和屬的描述中通常是必須的（Tamaoka，1994）。對(duì)其測(cè)定最常用的是熱變性溫度法（Tm法）、高效液相色譜法，其次是浮力密度法（SandmanandReeve，2000）。在微生物中G+C含量介于20-80%之間（Melchior，1982）。兩種生物之間G+C含量的差異越大，它們的進(jìn)化關(guān)系就越遠(yuǎn)，理論上說DNA分子之間G+C含量的差異超過20-30%時(shí)，它們的序列是完全不同的（王順民，2004）。一般地，G+C含量相差在5%以上可以認(rèn)為是兩個(gè)不同的種，若相差超過10%則屬于不同的屬。46ppt課件2.DNA堿基比例的測(cè)定（G+Cmol%）G+C含量是463.DNA-DNA分子雜交

DNA-DNA分子雜交仍然是目前鑒定種屬的標(biāo)準(zhǔn)方法（StackebrandtandGoebel，1994）。根據(jù)DNA分子解鏈的可逆性和堿基配對(duì)的專一性，將不同來源的DNA在體外加熱使其變性，并在合適的條件下使互補(bǔ)的堿基重新配對(duì)，然后測(cè)定雜交的百分率。百分率越高，說明兩者間堿基順序的同源性越高，即其間的親緣關(guān)系越近。從實(shí)驗(yàn)得知，各菌株DNA的同源性在70%以上的屬于種的水平；在20%以上的，則可能屬于屬的水平（Sriprapundhetal，2000）。47ppt課件3.DNA-DNA分子雜交DNA-DNA分子雜交仍然是目474.全基因組測(cè)序基因是生物體遺傳信息的關(guān)鍵載體，決定著生物體的遺傳特征和主要個(gè)體差異。自摩爾根提出這一概念后，一直有所爭(zhēng)論。但在1949年發(fā)現(xiàn)基因序列中單個(gè)堿基的突變即可導(dǎo)致地中海貧血病后，科學(xué)界的觀點(diǎn)趨于一致。在20世紀(jì)下半葉，隨著有關(guān)研究手段的改進(jìn)，對(duì)人類基因及其與疾病的關(guān)系的研究成為生命科學(xué)中最重要的領(lǐng)域之一。1990年10月，國際人類基因組計(jì)劃在美國啟動(dòng)，美、英、日、德、法、中國相繼參加了這一宏偉計(jì)劃。2001年6月26日完成人類基因組工作框架圖（Venteretal，2001）。由于微生物具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，基因組小，多數(shù)為無性繁殖，可人工培養(yǎng)等特點(diǎn)，作為分子生物學(xué)及相關(guān)基礎(chǔ)生物學(xué)研究的材料，是一種良好的模式生物。20世紀(jì)中，共有57名諾貝爾獎(jiǎng)金獲得者進(jìn)行的研究與微生物相關(guān)。有關(guān)研究不僅開辟了對(duì)其致病機(jī)理研究、新型疫苗和藥物研究的新領(lǐng)域，也將為微生物及其產(chǎn)物的利用開辟新天地，并將為揭示一系列諸如生命起源、生物發(fā)育和進(jìn)化等生命活動(dòng)的重大問題提供極大的幫助。全基因組測(cè)序通常采用霰彈法（Shot-gun）和逐步克隆(Clonebyclone)兩種策略。全基因組霰彈法測(cè)序策略是直接將全部基因組DNA打成小片斷進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序，