PCR擴(kuò)增檢測乙肝病毒課件

實(shí)驗(yàn)三：PCR擴(kuò)增檢測乙肝病毒1精選2021版課件

乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我國發(fā)病率很高，HBV的檢測極其重要。HBVDNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復(fù)制的發(fā)動(dòng)機(jī)。2精選2021版課件PCR技術(shù)可以檢測出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。PCR技術(shù)已成為公認(rèn)的對(duì)病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預(yù)防研究工作最理想的方法之一。3精選2021版課件一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理2.熟悉PCR擴(kuò)增檢測乙肝病毒的基本操作過程。4精選2021版課件二、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)簡稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一對(duì)引物間的特異性DNA片段合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)，它包括三個(gè)基本過程：5精選2021版課件1.變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?.退火：急速降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部形成雜交鏈3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng)6精選2021版課件模板DNA高溫變性低溫退火引物適溫延伸經(jīng)過25-35次循環(huán)后，目的片段擴(kuò)增2n倍兩條子代DNA一次循環(huán)Tap酶5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’7精選2021版課件三、主要器材及試劑1.主要器材：9700型PCR儀電泳槽、電泳儀8精選2021版課件

紫外分析儀臺(tái)式高速離心機(jī)9精選2021版課件2.主要試劑：HBV-PCR定性檢測試劑盒PCR反應(yīng)管HBV陽性標(biāo)本DNA提取液10精選2021版課件四、操作步驟1.標(biāo)本處理：取患者血清40μl，加入DNA提取液40μl，沸水浴10分鐘，10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。11精選2021版課件2.加樣：加入提取好的標(biāo)本4μl，6000轉(zhuǎn)離心10秒。取試劑盒中PCR反應(yīng)管

TapDNA聚合酶10×擴(kuò)增緩沖液

4種dNTP混合物引物(小分子DNA片段）

Mg2+12精選2021版課件三個(gè)擴(kuò)增步驟溫度及時(shí)間溫度時(shí)間變性93℃45″（首次5′）退火55℃45″延伸72℃60″（末次5′）循環(huán)次數(shù)：25次3.PCR儀上擴(kuò)增：13精選2021版課件PCR儀上擴(kuò)增加入標(biāo)本離心6000轉(zhuǎn)離心10秒14精選2021版課件4.電泳檢測：①制備2%瓊脂糖凝膠

2%瓊脂糖的制備：電泳槽的準(zhǔn)備：稱取0.8g瓊脂糖40mlTBE電泳緩沖液（PH8.0)煮沸溶解加入冷卻60℃左右加入溴乙啶EB20μl倒膠15精選2021版課件``②加樣：取擴(kuò)增后的產(chǎn)物10ul點(diǎn)樣于凝膠孔取樣點(diǎn)樣16精選2021版課件③電泳：點(diǎn)樣端接“-”，穩(wěn)壓，50V，電泳30分鐘。五、結(jié)果觀察：紫外分析儀下觀察，出現(xiàn)橙黃色條帶則為HBV陽性HBV陽性HBV陰性HBV陽性對(duì)照HBV陰性對(duì)照正極負(fù)極點(diǎn)樣孔17精選2021版課件五、注意事項(xiàng)1.試劑盒內(nèi)陽性標(biāo)本及DNA提取液使用前需充分融化離心。2.反應(yīng)液的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時(shí)從反