理論課21第二十一章 免疫學(xué)檢測原理

第二十一章免疫學(xué)檢測原理第一節(jié)免疫細胞的檢測

一、免疫細胞的分離和純化二、淋巴細胞及亞群的檢測三、免疫細胞的功能測定第二節(jié)免疫分子的檢測

一、免疫球蛋白的測定二、補體測定三、細胞因子及其受體的檢測四、黏附分子的檢測第三節(jié)免疫學(xué)檢測常用的標(biāo)記技術(shù)一、免疫熒光技術(shù)二、放射免疫測定三、免疫酶標(biāo)技術(shù)1免疫學(xué)檢測技術(shù)：包括細胞、分子、相關(guān)基因三個水平細胞水平檢測：根據(jù)免疫細胞膜表面表達的獨特標(biāo)志及特殊功能，測定各類細胞及其亞群數(shù)量及效應(yīng)，籍以了解細胞免疫水平分子水平檢測：測定各類Ig、補體、CK及受體、黏附分子水平及生物學(xué)活性，籍以了解各類免疫因子間的相互關(guān)系基因水平檢測：測定免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達與調(diào)控，免疫分子的遺傳多態(tài)性及基因型別分析2

第一節(jié)免疫細胞的檢測

一、免疫細胞的分離和純化依據(jù)細胞獨特的表面標(biāo)志、理化性質(zhì)及黏附吞噬能力等差異設(shè)計不同方法，按不同實驗?zāi)康?、擬分離細胞的種類、純度和數(shù)量等，選擇方法（一）白細胞的分離根據(jù)紅、白細胞比重、沉降速度不同分離1、自然沉降法：肝素抗凝外周血放置，紅細胞沉降速度快，自然分離2、高分子聚合物加速沉降法：明膠、右旋糖酐、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮可使紅細胞成錢串狀凝集，加速沉降3（二）外周血單個核細胞（PBMC）的分離

PBMC包括淋巴細胞和單核細胞，人PBMC來源于外周血，動物大、小鼠單個核細胞來源于脾臟、淋巴結(jié)（MNC）。

標(biāo)本：人肝素防凝外周血；鼠脾臟、淋巴結(jié),機械研磨過100目網(wǎng)單個細胞懸液。密度梯度離心法：紅細胞和多核細胞密度為1.092，PBMC為1.075-1.090，血小板為1.030-1.035；聚蔗糖-泛影葡胺（F-H）分層液法：原理：F-H分層液密度為1.077，將PBMC層加于分層液上離心不同層次液體和細胞區(qū)帶4（三）淋巴細胞的純化與亞群分離1、去除紅細胞：低滲溶解；0.89%氯化銨處理法2、去除單核、粒細胞：PBMC玻璃、塑料平皿黏附去除3、尼龍毛柱分離法：B細胞易黏附尼龍毛，過尼龍毛柱可分離

T、B細胞4、流式細胞術(shù)分選法：基本原理：流式細胞儀可快速、靈敏和高度自動化地對單個細胞進行多參數(shù)定量測定分析，從而分選特異性熒光抗體標(biāo)記的陽性細胞（四）單核/巨噬細胞的分離和收集1、平皿黏附分離法2、斑蝥敷貼法：原理：用斑蝥酒精浸出液貼敷前臂內(nèi)側(cè)皮膚，誘發(fā)無菌皮炎，收集皮泡滲出液中來自皮下組織的3、硫基乙醇酸鹽肉湯培養(yǎng)基小鼠腹腔收集腹腔滲出5二、淋巴細胞及亞群的檢測根據(jù)細胞表面標(biāo)志鑒定淋巴細胞亞群及檢測計數(shù)1、T細胞檢測1）間接免疫熒光法：原理：抗CD抗體與PBMC結(jié)合加入熒光素標(biāo)記的羊/兔抗小鼠IgG抗體(熒光標(biāo)記二抗)熒光顯微鏡計數(shù)2）免疫組織化學(xué)法：原理：酶標(biāo)記抗體與組織切片或細胞涂片反應(yīng),結(jié)合加入底物酶催化底物顯色普通光學(xué)顯微鏡檢測表面標(biāo)志鑒定細胞種類、亞群2、B細胞檢測1）膜表面免疫球蛋白（SmIg）檢測：應(yīng)用抗Ig抗體借助直接免疫熒光法或免疫組織化學(xué)法檢測2）間接免疫熒光法,同T細胞6三、免疫細胞的功能測定（一）吞噬細胞功能測定：1、中性粒細胞趨化功能測定濾膜滲透法（Boyden小室法）：上室加待測細胞，下室加趨化成分，中間用微孔濾膜隔開反應(yīng)濾膜清洗、固定、染色透明普通光學(xué)顯微鏡觀察細胞穿膜移動距離判斷趨化功能2、中性粒細胞吞噬殺菌功能測定

NBT（硝基藍四氮唑還原）試驗：原理：中性粒細胞吞噬殺菌代謝釋放氫攝入的NBT接受胞漿沉積黑色顆粒10%NBT+73、巨噬細胞吞噬功能測定：原理：用斑蝥酒精浸出液貼敷法收集人，用腹腔滲出法收集鼠，體外進行雞紅細胞(有胞核)吞噬實驗，計算吞噬百分率、吞噬指數(shù)4、巨噬細胞細胞毒測定：測定對放射性核素51Cr、

125IUdR

標(biāo)記靶細胞P815的殺傷活性51Cr標(biāo)記靶細胞：51Cr滲透入細胞漿，細胞破壞釋放51Cr

于上清中

125IUdR標(biāo)記靶細胞：125IUdR摻入細胞DNA，細胞破壞酶切DNA釋放125I于細胞沉淀中將效/靶按一定比例混合效/靶相互作用靶細胞破壞釋放核素測定上清/細胞沉淀放射性強度（cpm）按公式計算殺傷百分率8（二）T細胞功能測定1、T細胞增生（轉(zhuǎn)化）實驗：原理：T細胞受到絲裂原刺激增生反應(yīng)形態(tài)變化淋巴母細胞：體積大，染色質(zhì)疏松，核仁明顯等絲裂原：PHA、ConA（鼠）、PWM等1）放射性核素（3HTdR、125IUdR）摻入法：原理:細胞增生攝取3HTdR/125IUdR測放射性強度計算轉(zhuǎn)化率、刺激指數(shù)2）細胞能量代謝測定（MTT四氮唑鹽比色法）：原理：活細胞攝入MTT腺粒體作用胞內(nèi)、胞周藍黑色甲臜溶解甲臜酶標(biāo)儀檢測A值，計算轉(zhuǎn)化率、刺激指數(shù)。甲臜生成量與細胞代謝活躍程度呈正比，間接定量分析細胞增生水平92、T細胞細胞介導(dǎo)的細胞毒實驗原理

①CTL來源：免疫動物的脾臟或腹腔滲出液；將脾細胞與刺激細胞共育，體外誘生CTL②刺激細胞：預(yù)處理后無增殖能力，仍保持免疫源性的細胞③檢測CTL細胞毒活性：形態(tài)學(xué)法；51Cr、125IUdR釋放法；流式細胞術(shù)等。靶細胞為免疫用細胞/不處理的刺激細胞

51Cr、125IUdR釋放法:效/靶按一定比例混合效/靶相互作用靶細胞破壞釋放核素測定上清/細胞沉淀放射性強度（cpm）按公式計算殺傷百分率103、T細胞功能的體內(nèi)檢測法接觸性超敏反應(yīng)：用于研究免疫調(diào)節(jié)藥物對細胞免疫的影響某些半抗原涂小鼠皮膚致敏再次接觸半抗原活化的

CD4+TCK接觸性皮炎11（三）B細胞功能測定1、B細胞增生實驗：方法原理與T細胞同，但絲裂原為PWM，

LPS（鼠），SPA金葡菌，抗IgM抗體等2、溶血空斑形成實驗：原理：SRBC免疫小鼠取脾制成單個細胞與SRBC在瓊脂糖凝膠中混合注入平皿或玻片脾細胞中抗體生成細胞釋放抗SRBC抗體（溶血素）與周圍

SRBC結(jié)合加入補體抗體生成細胞周圍溶血肉眼可見的溶血空斑，每空斑代表1個抗體生成細胞空斑計數(shù)3、酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT）：原理：已知抗原包被于固相載體加入待測抗體生成細胞釋放特異性抗體結(jié)合抗原抗體生成細胞結(jié)合于固相載體加入酶聯(lián)二抗與結(jié)合于固相載體的細胞上抗體結(jié)合加底物顯色反應(yīng)著色的斑點形成細胞鏡檢計數(shù)斑點（計算機軟件計算、統(tǒng)計）12（四）NK細胞活性測定：靶細胞：人K562；鼠YAC-11、放射性核素釋放法：51Cr、125IUdR標(biāo)記靶細胞效/靶相互作用靶細胞破壞釋放核素測定上清/細胞沉淀放射性強度（cpm）公式計算NK殺傷百分率2、酶釋放法：原理：效/靶相互作用靶細胞破壞釋放乳酸脫氫酶（LDH）

加底物顯色取上清比色測LDHA值（光密度值）

公式計算NK殺傷百分率3、流式細胞術(shù)：原理：碘化丙叮（PI）與死亡靶細胞DNA/RNA

結(jié)合

激發(fā)熒光

流式細胞儀檢測靶細胞死亡率13

第二節(jié)免疫分子的檢測一、免疫球蛋白的測定常用方法：單向免疫擴散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法免疫化學(xué)自動分析儀測定二、補體測定血清總補體活性測定CH50

原理：應(yīng)用兔抗SRBC抗體-SRBC免疫復(fù)合物激活待測血清中補體經(jīng)典途徑SRBC溶血以50%溶血為判定結(jié)果的終點，稱CH50。診斷總補含量減少或補體成分缺失

14—（三）補體各種成分測定C1q、C3、B、C1INH

單向免疫擴散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法

ELISA（酶免疫吸附檢測）、RIA（放射免疫測定）（四）補體裂解產(chǎn)物測定C3a、C3d、C5a

免疫電泳、交叉免疫電泳、ELISA、RIA

用于某些疾病診斷和病情監(jiān)測（五）補體受體（CR）測定酶\熒光素\膠體金標(biāo)記抗CR抗體等診斷補體受體缺陷15三、細胞因子及其受體的檢測（一）CK生物學(xué)活性檢測法原理：根據(jù)CK特定的生物學(xué)活性，采用相應(yīng)的檢測系統(tǒng)（各種依賴性細胞株/靶細胞），通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對，判定樣品中CK活性，用活性單位（U/ml）表示1、細胞增生或增生抑制法：原理：用對特定CK依賴/抑制的細胞株與待測CK培養(yǎng)，檢測細胞增生或增生抑制，與標(biāo)準(zhǔn)品比對判斷活性單位。如IL-2，TGF-。用3HTdR摻入法，MTT法3、細胞毒活性測定：原理：以結(jié)晶紫染色法、MTT法等測TNF

對特定靶細胞（L929、WEHI164.13）的細胞毒活性4、細胞病變抑制法：原理：以VSV-WISH（人）、VSV-L929（鼠）系統(tǒng)，檢測IFN對VSV易感細胞株的50%病變抑制效應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比對，判定活性單位16（二）CK免疫學(xué)檢測

ELISA、免疫PCR、RIA、免疫印跡法（三）CKR檢測

RIA、標(biāo)記的抗CKR單抗法；

ELISA檢測sCKR四、黏附分子的檢測（一）細胞表面AM檢測間接免疫熒光法、流式細胞術(shù)、

ELISA、RIA法等（二）可溶性AM檢測

ELISA法17

第三節(jié)免疫學(xué)檢測常用的標(biāo)記技術(shù)一、免疫熒光技術(shù)基本原理：以熒光素標(biāo)記的特異性抗體或抗原作為標(biāo)準(zhǔn)試劑用于相應(yīng)抗原或抗體的分析鑒定和定量測定（一）免疫熒光顯微技術(shù)熒光顯微鏡觀察1、直接免疫熒光法：特異性抗體直接檢抗原檢出熒光+細胞2、間接免疫熒光法：二抗標(biāo)熒光檢出熒光陽性細胞（二）流式細胞術(shù)（FCM）

流式細胞儀1、分析單個細胞表面標(biāo)志2、分選收集不同類型細胞3、對同一細胞進行多參數(shù)如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細胞體積等信息分析18二、放射免疫測定（RIA）

放射性檢測儀器以放射性核素為示蹤劑的免疫標(biāo)記技術(shù)，將核素分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合（一）RIA

原理：以放射性核素標(biāo)記的抗原（Ag?）和待測的未標(biāo)記抗原與固定量的特異性抗體競爭結(jié)合，或進行競爭抑制反應(yīng)當(dāng)Ag?和Ab量固定時，Ag?-Ab形成量受Ag含量制約；若Ag量高時Ag-Ab,Ag?-Ab,Ag?-Ab形成量與未標(biāo)記Ag呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,即放射性(cpm)待測Ag含量，cpm

待測Ag含量（二）免疫放射測定（IRMA）

原理：將待測Ag與過量Ab?反應(yīng)

Ag-Ab?

加入固相AgAg-Ab?和固相Ag-Ab

離心沉淀去除固相Ag-Ab

檢測上清Ag-Ab?cpm

推算待測Ag含量19三、免疫酶標(biāo)技術(shù)基本原理：以酶標(biāo)抗體/抗原與細胞/組織中抗原/抗體結(jié)合，通過相應(yīng)酶底物的顯色反應(yīng)，對待檢細胞/組織中抗原-抗體定位、定性分析，亦可據(jù)顯色深淺定量分析（一）酶免疫組織化學(xué)技術(shù)（EIH）

通過底物被酶顯色示蹤組織中抗原-抗體結(jié)合物的存在

普通光鏡、電鏡觀察

ABC法：用生物素(B)標(biāo)記過氧化物酶，可攜帶多個酶分子，可提高酶反應(yīng)敏感性。將親和素(A)與生物素(B)標(biāo)記的過氧化物酶結(jié)合，形成可溶性親和素-生物素化過氧化物酶復(fù)合物(ABC)

檢測時，將生物素(B)標(biāo)記抗體/二抗結(jié)合于標(biāo)本加入ABCABC上的親和素(A)結(jié)合于抗體的生物素(B)ABC結(jié)合于標(biāo)本