中國藥典無菌檢查法

2005年版《中國藥典》

無菌檢查遼寧省藥品檢驗(yàn)所抗生素室李冰2009.75/7/20241中國藥典無菌檢查法一、2005年版無菌檢查法特點(diǎn)二、無菌檢查法概念三、2005年版增、修訂內(nèi)容四、供試品的無菌檢查法五、菌種5/7/20242中國藥典無菌檢查法

一、2005年版無菌檢查法特點(diǎn)完善檢查方法增加試驗(yàn)的可操作性方法更具科學(xué)性，提高檢出率，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性縮小與先進(jìn)國家藥典的無菌檢查法的差別5/7/20243中國藥典無菌檢查法二、無菌檢查法概念系指用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。

同時(shí)指出：若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)被微生物污染。5/7/20244中國藥典無菌檢查法三、增、修訂內(nèi)容

無菌檢查法的設(shè)施及環(huán)境、培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基種類及用途、培養(yǎng)基制備及裝量、培養(yǎng)基滅菌及貯藏、培養(yǎng)基的適用性檢查、試驗(yàn)用菌株、最小檢驗(yàn)量、方法驗(yàn)證、培養(yǎng)時(shí)間、結(jié)果判斷5/7/20245中國藥典無菌檢查法

1、無菌檢查的設(shè)施及環(huán)境

⑴試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)在潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單項(xiàng)流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行、其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。

規(guī)定應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈級(jí)的檢測(cè)。

隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。

5/7/20246中國藥典無菌檢查法

⑵隔離系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的兩方面：一是保護(hù)產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，保證無菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，實(shí)現(xiàn)一次檢出的要求;二是保護(hù)操作人員免受實(shí)驗(yàn)過程中的有害物質(zhì)帶來的污染。5/7/20247中國藥典無菌檢查法2、培養(yǎng)基的名稱、種類、用途

⑴.硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)好氧菌和厭氧菌）⑵.改良馬丁培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)真菌）⑶.選擇性培養(yǎng)基按硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適量的中和劑或表面活性劑。中和劑和表面活性劑要經(jīng)驗(yàn)證如對(duì)氨基苯甲酸--用于磺胺類供試品聚山梨酯80--用于非水溶性供試品β－內(nèi)酰胺酶（新增加的選擇性培養(yǎng)基）--用于β－內(nèi)酰胺類供試品0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基—用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查5/7/20248中國藥典無菌檢查法

3、培養(yǎng)基的制備、裝量培養(yǎng)基可按處方制備，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度1/2。供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次。5/7/20249中國藥典無菌檢查法4、滅菌所有培養(yǎng)基、稀釋液及沖洗液的滅菌程序均應(yīng)驗(yàn)證，方可采用。防止滅菌不徹底或過渡滅菌5/7/202410中國藥典無菌檢查法

5、培養(yǎng)基的貯存制備好的培養(yǎng)基應(yīng)在2-25℃、避光保存保存在非密閉容器中，應(yīng)在3周內(nèi)使用

(一般指配制的）。保存在密閉容器中，可在1年內(nèi)使用（一般指商品化的）。5/7/202411中國藥典無菌檢查法6、培養(yǎng)基的適用性檢查

⑴無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支，培養(yǎng)14天應(yīng)無菌生長。試驗(yàn)可與供試品無菌試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。5/7/202412中國藥典無菌檢查法⑵靈敏度檢查①菌種金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)「CMCC(B)63501」生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64941]白色念珠菌（Candidasporogenes）[CMCC（B）98001]黑曲霉（Asperjillusniger）[CMCC（F）98003]

5/7/202413中國藥典無菌檢查法

②菌液制備試驗(yàn)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間

（℃）（小時(shí))

金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯30-3518-24

銅綠假單胞菌

枯草芽孢桿菌生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體

白色念珠球菌改良馬丁培養(yǎng)基23-2824-48

黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面5-7天

5/7/202414中國藥典無菌檢查法③培養(yǎng)基接種試驗(yàn)菌培養(yǎng)基每管裝量接種管數(shù)接種量培養(yǎng)時(shí)間(ml)(支)（ml）（天）金黃色葡萄球菌硫乙醇酸鹽12213銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠球菌改良馬丁培養(yǎng)基9215黑曲霉其中硫乙醇酸鹽及改良馬丁培養(yǎng)基均有1支不接種作為空白接種量1ml含菌＜100cfu5/7/202415中國藥典無菌檢查法

④

結(jié)果判斷空白對(duì)照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。5/7/202416中國藥典無菌檢查法

7、稀釋液、沖洗液

0.1%蛋白胨水溶液

PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

如需要可加入表面活性劑或中和劑應(yīng)經(jīng)方法驗(yàn)證證明其有效性，并對(duì)細(xì)菌存活無影響。修改原因：增加檢出率，使受損的微生物復(fù)蘇5/7/202417中國藥典無菌檢查法

8、方法驗(yàn)證試驗(yàn)

在建立供試品的無菌檢查方法時(shí)，需對(duì)供試品的抑細(xì)菌和抑真菌特性及無菌檢查方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證

供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證，并對(duì)每一株試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行驗(yàn)證。5/7/202418中國藥典無菌檢查法（1）菌種及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)方法（2）方法驗(yàn)證方法培養(yǎng)基接種菌加菌量接種管數(shù)培養(yǎng)天數(shù)（cfu）（支）（天）直接接種法硫乙醇酸鹽金黃色葡萄球菌＜10023-5銅綠假單胞菌2生孢梭菌2枯草芽孢桿菌2改良馬丁白色念珠菌＜10023-5黑曲霉23-5薄膜過濾法同直接接種法

接種2管中其中1管接規(guī)定量的供試品，另1管作為對(duì)照

5/7/202419中國藥典無菌檢查法⑴薄膜過濾法

將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌、過濾。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入等量的試驗(yàn)菌，作為陽性對(duì)照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5天。各試驗(yàn)菌同法操作。5/7/202420中國藥典無菌檢查法⑵直接接種法

取規(guī)定量培養(yǎng)基分別接入小于100cfu的試驗(yàn)菌（6種菌）各2管，其中1管接入規(guī)定量供試品，另1管作為對(duì)照。培養(yǎng)3～5天。5/7/202421中國藥典無菌檢查法

（3）

結(jié)果判斷與對(duì)照管比較如含供試品各管中的試驗(yàn)菌均生長良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用。按此法進(jìn)行供試品的無菌檢查。

如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用。應(yīng)采取措施，消除供試品的抑菌作用。并再重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)

5/7/202422中國藥典無菌檢查法四、供試品的無菌檢查法

無菌檢查方法包括直接接種法和薄膜過濾法。如供試品允許應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法.5/7/202423中國藥典無菌檢查法1.陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)根據(jù)供試品的特性選擇陽性對(duì)照菌。①無抑菌及抗革蘭陽性-金黃色葡萄球菌②抗革蘭陰性-大腸埃希菌③抗厭氧菌-生孢梭菌④抗真菌-白色念珠菌陽性對(duì)照培養(yǎng)48-72h應(yīng)生長良好。2.陰性對(duì)照應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作。陰性對(duì)照不得有菌生長。5/7/202424中國藥典無菌檢查法

3.檢驗(yàn)數(shù)量指一次檢驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量除另有規(guī)定外參照表1、2、3采用薄膜過濾法應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作為陽性對(duì)照；采用直接接種法應(yīng)增加供試品1支（瓶）作為陽性對(duì)照。4.檢驗(yàn)量指一次試驗(yàn)所用供試品總量（g/ml）除另有規(guī)定外參照表2、3。若每支（瓶）供試品裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時(shí)，檢驗(yàn)量不應(yīng)少于直接接種法的總量，只要供試品的特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過濾.5/7/202425中國藥典無菌檢查法

5.薄膜過濾法過濾器應(yīng)優(yōu)先選擇封閉式薄膜過濾也可使用一般薄膜過濾器。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)考慮供試品及其溶劑的特性，水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。5/7/202426中國藥典無菌檢查法沖洗量

應(yīng)通過驗(yàn)證，沖洗量不宜過多，每次100ml，總過濾量不宜太大，避免濾膜上的微生物受損。

5/7/202427中國藥典無菌檢查法

⑴水溶液供試品取規(guī)定量，直接過濾，具抑菌成分或防腐劑沖洗不得少于3次，封閉式濾器加入100ml培養(yǎng)基，一般濾器取出膜剪成3份，加入50ml培養(yǎng)基中。5/7/202428中國藥典無菌檢查法⑵可溶水的固體制劑供試品取規(guī)定量，按標(biāo)簽說明復(fù)溶，根據(jù)其溶解性按水溶液或非水溶性制劑項(xiàng)下方法操作。⑶裝有藥物的注射器供試品按水溶性制劑或非水溶性供試品項(xiàng)下方法操作，針頭直接接種。

5/7/202429中國藥典無菌檢查法（4）β-內(nèi)酰胺類抗生素供試品取規(guī)定量，按水溶性制劑或無菌粉針劑及無菌粉末原料的供試品處理法處理，薄膜過濾，用沖洗液沖洗數(shù)次。最后一次用適量的β-內(nèi)酰胺酶沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素后接種培養(yǎng)基；或?qū)V膜直接接入含適量β-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基。5/7/202430中國藥典無菌檢查法

（5）非水溶性的供試品取規(guī)定量，直接進(jìn)行過濾或溶于含適量聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾，用0.1%～1%聚山梨酯80蛋白胨溶液沖洗濾膜至少3次，于含或不含聚山梨酯80培養(yǎng)基中培養(yǎng)。5/7/202431中國藥典無菌檢查法

（6）可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品檢查方法

取規(guī)定量供試品加入適量不超過44℃無菌十四烷酸異丙酯內(nèi)，劇烈振搖，使供試品充分溶解，趁熱過濾（脂膜），或加入100ml稀釋液中，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后用適量的沖洗液沖濾膜數(shù)次（水膜）。十四烷酸異丙酯的配制

:

采用薄膜過濾法除菌，選用孔徑為0.22um的脂溶性濾膜，濾膜在140℃干熱滅菌2小時(shí)。5/7/202432中國藥典無菌檢查法

（7）無菌氣（噴）霧劑供試品取規(guī)定量，將樣品容器置冰室冷凍約1小時(shí)。速以無菌手續(xù)在容器上端鉆一小孔，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，按水溶性制劑或非水溶性制劑項(xiàng)下方法檢驗(yàn)。5/7/202433中國藥典無菌檢查法（8）具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）取規(guī)定量，每個(gè)最小包裝用50ml～100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，集中沖洗液于適宜的無菌容器中，薄膜過濾。同時(shí)應(yīng)做包裝中所配帶的針頭的無菌檢查（直接接種法）。5/7/202434中國藥典無菌檢查法

6.直接接種法

供試品按規(guī)定量分別接入含培養(yǎng)細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基的容器中，除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中的培養(yǎng)基量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%。同時(shí)硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基每管裝量不得少于15ml、改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不得少于10ml，培養(yǎng)基用量和高度應(yīng)經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證。5/7/202435中國藥典無菌檢查法①一般水溶性供試品②混懸液等非澄清水溶液供試品取規(guī)定量接種至培養(yǎng)基中。③固體制劑供試品取規(guī)定量直接接種，或加入適宜的溶劑溶解，或按標(biāo)簽說明復(fù)溶后，取規(guī)定量接種至培養(yǎng)基中。④?-內(nèi)酰胺類或磺胺類供試品取規(guī)定量，混合，加入適量的無菌?-內(nèi)酰胺酶溶液或?qū)Π被郊姿崛芤菏怪泻?，接種至培養(yǎng)基中。或接入含?-內(nèi)酰胺酶或?qū)Π被郊姿岬呐囵B(yǎng)基中。5/7/202436中國藥典無菌檢查法⑤非水溶性供試品取規(guī)定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至培養(yǎng)基中?；蛑苯咏臃N至含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的培養(yǎng)基中。⑥敷料供試品取規(guī)定數(shù)量，以無菌操作拆開包裝，于不同部位分別剪取約100mg或1cm×3cm的供試品，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。5/7/202437中國藥典無菌檢查法⑦腸線、縫合線等供試品腸線、縫合線及其它一次性使用的醫(yī)用材料按規(guī)定量取最小包裝，無菌拆開包裝，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。⑧滅菌醫(yī)用器具供試品取規(guī)定量，必要時(shí)應(yīng)將其拆散或切成小碎段，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。⑨放射性藥品取供試品1瓶(支)，接種于裝量為7.5ml的培養(yǎng)基中。每管接種量為0.2ml。5/7/202438中國藥典無菌檢查法

7.培養(yǎng)及觀察

培養(yǎng)14天，如果培養(yǎng)基渾濁或培養(yǎng)14天后從外觀不能判斷是否長菌，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種培養(yǎng)基或斜面上，培養(yǎng)細(xì)菌2天、真菌3天，觀察有無菌生長或鏡檢進(jìn)行判斷。陰性對(duì)照不得有菌生長。

5/7/202439中國藥典無菌檢查法

8.結(jié)果判斷若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定。若供試品中任何1管顯混濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。

除非能充分證明，生長的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效：5/7/202440中國藥典無菌檢查法

⑴對(duì)無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；⑵回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；⑶陰性對(duì)照管有菌生長。⑷供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證微生物生長是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。5/7/202441中國藥典無菌檢查法試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定，若有菌生長判供試品不符合規(guī)定。5/7/202442中國藥典無菌檢查法

表1

批產(chǎn)品出廠最少檢驗(yàn)數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個(gè)）每種培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量注射劑

≤10010%或4個(gè)（取較多者）

100＜N≤50010個(gè)

＞5002%或20個(gè)（取較少者）大體積注射劑＞100ml

2%或10個(gè)（取較少者）眼用及其他非注射產(chǎn)品

≤2005%或2個(gè)（取較多者）

＞20010個(gè)桶裝固體原料

≤4每個(gè)容器

4＜N≤5020%或4個(gè)容器（取較大者）

＞502%或10個(gè)容器（取較大者）5/7/202443中國藥典無菌檢查法抗生素固體原料藥（≥5克）

6瓶(支)醫(yī)療器具

≤10010%或4件（取較大者）

100＜N≤50010件

＞5002%或20件（取較少者）

注：若每個(gè)容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍5/7/202444中國藥典無菌檢查法

表2.上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品裝量V(ml)每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少量（ml）最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）≤1全量

20①1＜V＜5半量105≤V＜2021020≤V＜5051050≤V＜100101050≤V＜100(靜脈給藥)半量10100≤V≤500半量6V＞50050061.每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。5/7/202445中國藥典無菌檢查法

表3上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品裝量M（/支、瓶或個(gè)）每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少量（mg）最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）M<50mg全量

20①50mg≤M<300

mg半量10300

mg≤M<5g150

mg10M≥5g500

mg

10②外科用敷料棉花及紗布取100mg或1cm×3cm10縫合線、一次性醫(yī)用材料整個(gè)材料③

20①帶導(dǎo)管的一次性醫(yī)療器具（如輸液袋）

10其它醫(yī)療器具整個(gè)器具③（切碎或拆散開）

20①5/7/202446中國藥典無菌檢查法注：①.每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。

②.抗生素粉針劑（≥5克）及抗生素原料藥（≥5克）的最少檢驗(yàn)數(shù)量為6瓶（或支），桶裝固體原料的最少檢驗(yàn)數(shù)量為4個(gè)包裝。③.如果醫(yī)用器械體積過大，培養(yǎng)基用量可在2000ml以上，將其完全浸沒。5/7/202447中國藥典無菌檢查法五、菌種驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。應(yīng)采用適宜的保存技術(shù)，防止試驗(yàn)菌株發(fā)生變異。

5/7/202448中國藥典無菌檢查法菌種的保存

對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)來說菌種是特殊的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)給予相同于化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品的管理（溯源性、質(zhì)量的原始性）外，還有安全性方面的管理。5/7/202449中國藥典無菌檢查法1.

溯源性(菌種的來源)：藥品微生物實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌種應(yīng)來自中國藥品生物檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心（ChinaMedicalCultureCollection——CMCC）系列?；蛎绹幍涫蛰d的美國菌種保藏中心（AmericanTypeCultureCollection——ATCC）系列等國際法定菌種保藏中心。5/7/202450中國藥典無菌檢查法2.菌種的質(zhì)量控制：對(duì)選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)的典型菌落進(jìn)行鑒定。形態(tài)、染色鏡檢、純度、必要時(shí)應(yīng)做生化鑒定試驗(yàn)，一旦出現(xiàn)偏差，應(yīng)做進(jìn)一步的調(diào)查，所有被確認(rèn)受到污染或變異的菌種應(yīng)及時(shí)銷毀，不得用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)用。

5/7/202451中國藥典無菌檢查法3.菌種管的標(biāo)簽要求—名稱、編號(hào)、代數(shù)、有效期、制備日期

菌種記錄：名稱、編號(hào)、來源、菌落形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化與血清學(xué)鑒定、傳代數(shù)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件、保藏方法、貯存條件及保藏庫址。5/7/202452中國藥典無菌檢查法4.菌種保藏方法有多種，但對(duì)不同的微生物應(yīng)通過保藏試驗(yàn)來選擇最適宜保藏方法。一般多用瓊脂斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、干燥沙土保藏方法、冷凍真空保藏法、甘油冷凍管保藏法等。5/7/202453中國藥典無菌檢查法⑴瓊脂斜面低溫保藏方法實(shí)驗(yàn)室多采用此法一般在4℃保存。銅綠假單孢菌在室溫保存。

5/7/202454中國藥典無菌檢查法⑵液體石蠟保藏法本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理、生化水平，延長菌種保藏時(shí)間。

方法：液體石蠟121℃高壓滅菌30min或110-170℃烘箱1-2h干燥去掉水分。

取經(jīng)培養(yǎng)的高層半固體菌管加入石蠟，高出培養(yǎng)基面1cm為宜，在4℃保藏。

5/7/202455中國藥典無菌檢查法⑶冷凍真空保藏法保護(hù)劑有多種，多用脫脂牛奶。將牛奶煮沸、靜止、冷卻除去上面一層脂肪，重復(fù)3次用脫脂棉過濾，113℃高壓滅菌30min，接入菌種，培養(yǎng)后低溫、冷凍、真空干燥置-35℃保存。5/7/202456中國藥典無菌檢查法（4）甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種平板或瓊脂斜面，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間后（細(xì)菌24～48小時(shí)的培養(yǎng)物，白色念珠菌72小時(shí)的培養(yǎng)物。），用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無菌蒸餾水中，調(diào)整菌液濃度，向已制備好的菌懸液中加入等體積20％的無菌甘油，輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混和，分裝于無菌小管，制好的甘油冷凍管最好在－30℃貯存。5/7/202457中國藥典無菌檢查法5、微生物廢棄物的滅活

廢棄的菌種、菌液、帶菌培養(yǎng)基以及帶菌器皿須經(jīng)過高壓（121℃）滅菌后方可處理。5/7/202458中國藥典無菌檢查法無菌室管理制度1無菌室的要求1.1無菌室是專門進(jìn)行藥品無菌、微生物限度檢查的試驗(yàn)室，不得進(jìn)行其他試驗(yàn)，無菌檢查用無菌室與微生物限度檢查用無菌室應(yīng)各自獨(dú)立。1.2無菌室由更衣室、緩沖室及操作間組成。1.3無菌室設(shè)連鎖式傳遞窗口，以保證人流物流分開。1.4操作間應(yīng)達(dá)到潔凈度10，000級(jí)，內(nèi)設(shè)無菌凈化臺(tái)，潔凈度達(dá)到100級(jí)。1.5第二更衣室設(shè)有洗手盆。1.6各房間設(shè)有照明燈，紫外燈。電源開關(guān)應(yīng)設(shè)在室外。1.7無菌室應(yīng)有空氣凈化除菌的層流系統(tǒng)，保證試驗(yàn)時(shí)空氣正壓。1.8無菌試驗(yàn)時(shí)無菌室的溫度應(yīng)控制在18～26℃范圍內(nèi)，相對(duì)濕度應(yīng)控制在60%以下。2無菌室的管理2.1無菌室由專人管理2.2無菌室應(yīng)每半年檢測(cè)一次室內(nèi)的潔凈度（塵埃粒子計(jì)數(shù)儀）并應(yīng)符合要求，同時(shí)做好記錄。每一個(gè)月檢測(cè)一次室內(nèi)的無菌度（平板計(jì)數(shù)法），應(yīng)符合要求，同時(shí)做好記錄。2.3無菌室內(nèi)僅存放最必須的檢驗(yàn)用具，保持固定位置，不隨意移動(dòng)。3無菌室的使用3.1每次試驗(yàn)前應(yīng)用消毒劑擦拭工作臺(tái)面及可能污染的死角，開動(dòng)空氣凈化系統(tǒng)及紫外燈殺菌20～30分鐘。3.2人員進(jìn)入無菌室須經(jīng)更衣并洗手后方可進(jìn)入無菌室。3.3檢驗(yàn)樣品及培養(yǎng)基等試驗(yàn)物品進(jìn)入試驗(yàn)室必須通過傳遞窗，并在傳遞窗內(nèi)經(jīng)紫外燈照射20～30分鐘。在操作間內(nèi)除去物品的外包裝后進(jìn)行試驗(yàn)。3.4根據(jù)檢測(cè)的情況決定是否用丙二醇進(jìn)行空氣消毒，