空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法

ICS07.080

CCSA40

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—XXXX

`

空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法

Identificationmethodofairbornepathogensbasedonmetagenomicssequencing

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（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

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目次

前言......................................................................................................................................................................II

引言....................................................................................................................................................................III

1范圍..................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件..............................................................................................................................................1

3術語和定義......................................................................................................................................................1

4縮略詞..............................................................................................................................................................2

5原理..................................................................................................................................................................2

6實驗室工作條件..............................................................................................................................................3

7試劑..................................................................................................................................................................3

8儀器和設備......................................................................................................................................................3

9試驗步驟..........................................................................................................................................................4

10測序結(jié)果分析................................................................................................................................................5

附錄A（資料性）核酸提取方法及步驟......................................................................................................7

附錄B（資料性）測序方法..........................................................................................................................9

附錄C（資料性）鼠疫桿菌及SARS病毒測序數(shù)據(jù)比對分析示例.........................................................10

附錄D（資料性）數(shù)據(jù)庫中空氣微生物列表.............................................................................................11

參考文獻............................................................................................................................................................13

I

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引言

日常環(huán)境、公共場所、醫(yī)療衛(wèi)生環(huán)境以及生物安全實驗室的空氣中病原微生物的檢測與健康安全、

環(huán)境保護密切相關。病原微生物可通過生物氣溶膠在空氣中傳播從而引起傳染病的流行。空氣中病原微

生物的準確鑒別，對于傳染病預防與控制以及環(huán)境的監(jiān)測與保護具有重要的意義。由于空氣中病原微生

物具有多樣性、種類復雜性、較快的變異性等特點，使得具有高通量、快速、準確等特點的宏基因組大

規(guī)模并行高通量測序（簡稱宏基因組測序）方法在空氣中病原微生物的鑒定中具有技術優(yōu)勢。

目前，國內(nèi)外尚未制定空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法的相關標準。本文件針對當前空氣

中重要病原微生物的檢測及鑒定，對空氣微生物氣溶膠采樣、前處理方法、文庫制備、無偏向測序、數(shù)

據(jù)分析和算法等關鍵環(huán)節(jié)要求進行了規(guī)定，滿足空氣病原微生物宏基因組測序方法的規(guī)范使用，以提升

我國在病原微生物監(jiān)測上的能力。

III

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空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法

1范圍

本文件規(guī)定了空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法的術語、原理、實驗室工作條件、儀器設備、

試劑、試驗步驟及測序結(jié)果分析。

本文件適用于空氣中病原微生物的鑒定及監(jiān)測，病原微生物種類包括細菌、真菌和病毒等。適用于

鳥槍法的宏基因組測序的鑒定，病原微生物的檢出限為500CFU/m3。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB50346生物安全實驗室建筑技術規(guī)范

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T18204.3公共場所衛(wèi)生檢驗方法第3部分：空氣微生物

GB/T29859生物信息學術語

GB/T30989高通量基因測序技術規(guī)程

WS233病原微生物實驗室安全通用準則

WS598病原微生物實驗室生物安全標識

JJF1265生物計量術語及定義

ISO20397-2:2021Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part2:Qualityevaluationof

sequencingdata

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

病原微生物pathogenicmicroorganism

侵入生物體引起感染甚至傳染病的微生物，包括細菌、真菌和病毒等。

宏基因組metagenome

特定環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和，包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因。

[來源：JJF1265，定義]

1

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測序sequencing

測定一個核酸分子中核苷酸堿基（腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶）的順序和含量。

注:序列一般從5'到3'端進行描述。

[來源：ISO20397-2:2021]

大規(guī)模并行高通量測序massivelyparallelhigh-throughputsequencing

一次同時測定數(shù)百萬到數(shù)十億之多的獨立核酸分子序列的測序技術。

鳥槍法測序shotgunsequencing

將基因組打斷為DNA片段并進行測序的方法。

[來源：GB/T29859，定義2.4.15]

文庫libary

通過生物來源的、人工合成的或克隆技術等所得到的一個重建分子群，如基因組文庫、互補DNA

文庫、噬菌體展示肽文庫等。

[來源：GB/T30989，定義3.5]

3.7

每百萬序列數(shù)readspermillion，RPM

每百萬條序列中，比對到目標基因組的序列數(shù)量。

4縮略詞

下列縮略語適用于本文件。

cDNA：互補DNA（complementarydeoxyribonucleicacid）

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

NCBI：美國國家生物信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation）

PCR：聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

RPM:每百萬序列數(shù)（readspermillion）

SARS：嚴重急性呼吸綜合征（severeacuterespiratorysyndrome）

SNP：單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism）

5原理

通過生物氣溶膠采樣器采集空氣樣本，結(jié)合核酸提取、文庫制備及宏基因組無偏向測序得到微生物

的DNA序列、RNA序列等，并進行過程質(zhì)量控制。使用序列比對分析軟件將測序獲得的微生物基因組

序列比對到微生物的參考基因組數(shù)據(jù)庫上，獲得數(shù)據(jù)庫中比對到的微生物的基因組覆蓋率及深度等信息，

根據(jù)設定的閾值進而對樣本中微生物進行鑒定。

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6實驗室工作條件

6.1基本要求

實驗室應做到無菌操作，按照功能劃分為核酸提取區(qū)、文庫制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)及其

他區(qū)域。工作條件應符合GB/T30989。

6.2特殊要求

6.2.1采集的空氣微生物中如可能存在第一類、第二類和第三類病原微生物，實驗室的建筑、設施設備、

個人防護裝置，應具備GB50346中相應的生物安全級別要求的設計、安裝及配置。

6.2.2實驗室人員的要求、樣本的運輸與管理、實驗活動的管理、消毒與滅菌、廢棄物的處置、應急預

案與意外事故的處置應符合WS233。生物安全監(jiān)督檢查應符合GB19489。

6.2.3實驗室應按照WS598的要求，在實驗室相應區(qū)域設置正確的標識。

7試劑

所需試劑主要包括核酸提取試劑、文庫構建試劑、大規(guī)模平行擴增試劑以及測序試劑。除另有規(guī)定

外，試劑應為分析純或生化試劑，實驗用水應符合GB/T6682中一級水的要求。

7.1核酸提取試劑

痕量核酸提取試劑盒，及提取過程中需要的無水乙醇、異丙醇、RNA酶A、DNA酶I和溶壁酶。

7.2文庫構建試劑

建庫試劑盒，及建庫過程中需要的文庫接頭、T4連接酶、DNA聚合酶I和dNTP等。

7.3標準物質(zhì)

采用國家標準物質(zhì)作為質(zhì)量控制標準。

7.4其他試劑

用于文庫制備、擴增、測序的試劑可參考GB/T30989。RNA反轉(zhuǎn)錄使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

8儀器和設備

8.1生物氣溶膠采樣器：流量不小于300L/min。

8.2離心機：最高轉(zhuǎn)速不小于12000g。

8.3PCR儀：溫度設置范圍0℃~99℃；最大循環(huán)數(shù)為99；升降溫速度3℃/s。

8.4渦旋振蕩儀。

8.5測序儀：測序通量大于1Gb，堿基識別質(zhì)量大于20，堿基識別正確率大于99.9%。

8.6冰箱：冷凍溫度可達-80℃或以下。

3

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8.7水浴鍋或金屬?。簻囟确秶?℃~100℃。

8.8垂直電泳槽及電泳儀。

8.9II級或III級生物安全柜。

9試驗步驟

9.1樣本采集

9.1.1采樣點設置

按照GB/T18204.3中的要求進行布點，具體如下：

a)室內(nèi)面積不足50m3的設置1個采樣點，50m3~200m3的設置2個采樣點，200m3以上的設置3個

~5個采樣點。

b)采樣點按均勻布點原則布置，室內(nèi)1個采樣點的設置在中央，2個采樣點的設置在室內(nèi)對稱點

上，3個采樣點的設置在室內(nèi)對角線四等分的3個等分點上，5個采樣點的按照梅花布點，其他

的按均勻布點原則布置。

c)采樣點距離地面高度1.2m~1.5m，距離墻壁不小于1m。

d)采樣點應避開通風口、通風道等。

9.1.2采樣方法

將生物氣溶膠采樣器（以下簡稱采樣器）放在距離地面1.2m~1.5m的位置，采樣器使用按照說明

書要求進行。在采集前應注意使用無菌水清洗采樣器內(nèi)部3次，并通過連續(xù)按下收集按鈕3次，使用

自動清洗功能3次。使用采樣器以（300~350）L/min流量采集1h，采集過程中注意無菌操作，每個采

樣點重復采樣3次。

將獲得的5mL~7mL采集液直接用于下一步核酸提取或者12000g離心1min后吸凈上清，重新懸

浮于1mL的緩沖液中。如需運輸，-20℃保存時間不超過24h；根據(jù)微生物特性，長期保存可置于

-196℃~-80℃。

9.2核酸提取與質(zhì)量控制

采用痕量核酸提取試劑盒進行空氣微生物核酸的提取，同時使用空氣采集液作為陰性對照同時進行

提取，詳細提取方法及步驟按照試劑盒說明書或參考附錄A。

進行RNA的提取時，應注意盡量在人少時進行，防止空氣中RNA酶的污染，所用設備和耗材應無

RNA酶污染，并在使用前用紫外燈照射。對提取的核酸進行檢測與質(zhì)量控制時，加入標準物質(zhì)后的核

酸總量需達到10ng~1μg。滿足實驗要求的DNA樣本應置于-20℃以下條件保存，一般不超過7天，長期

保存應根據(jù)微生物特性置于-196℃~-80℃；RNA樣本應置于-80℃以下條件保存。取樣一般不得超過3次，

避免標本反復凍融。

9.3RNA反轉(zhuǎn)錄

按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，充分降解RNA后，合成雙

鏈cDNA。

9.4全基因組擴增

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由于部分室內(nèi)空氣中微生物數(shù)量少，提取的DNA或cDNA總量無法達到宏基因組測序的文庫制備要

求時，可考慮采用全基因組擴增的方法。

9.5文庫制備

根據(jù)樣本種類及測序儀要求選擇合適的建庫試劑盒，建庫時加入國家標準物質(zhì)作為質(zhì)量控制標準，

按照建庫試劑盒說明書對符合要求的核酸進行文庫制備。同時為了得到高質(zhì)量的測序結(jié)果，需要對文庫

進行質(zhì)量檢測。可采用熒光染料或微流體等技術檢測文庫濃度及文庫片段長度分布。當文庫濃度大于1

ng/μL，文庫片段在200bp~400bp，滿足測序需要時，文庫質(zhì)量檢測合格。

9.6測序

將待測序的合格文庫選擇合適的測序讀長，并對每個樣本添加標簽，分別進行測序反應，得到測序

序列。同一批次測序樣本應設置一個陰性對照，如有必要，設置陽性樣本。測序方法可參照附錄B。

10測序結(jié)果分析

測序數(shù)據(jù)量需要大于10Mb，之后進入對數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制。

10.1數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

對測序數(shù)據(jù)選擇合適的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制軟件，進行質(zhì)量控制。控制流程包括但不限于去除重復序列、

去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、去除接頭序列等。合格測序數(shù)據(jù)應滿足以下條件：

——堿基質(zhì)量值大于等于20（即Q20：堿基識別錯誤率不大于1%）的占比在80%以上；

——一條序列中不明確的堿基個數(shù)要小于5個；

——接頭序列污染比例不超過1%；

——過濾低質(zhì)量以及接頭序列等后的剩余序列長度大于35bp。

10.2構建空氣病原微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫

構建空氣中病原微生物（包括細菌、病毒及真菌）數(shù)據(jù)庫。從以下公共數(shù)據(jù)庫的參考數(shù)據(jù)庫下載空

氣微生物基因組序列，用于微生物鑒定。

——國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺（CNGB）：/

——國家基因組科學數(shù)據(jù)中心：/

——美國國家生物信息中心（NCBI）：/

——精選宏基因組數(shù)據(jù)庫（curatedMetagenomicData）：

/waldronlab/curatedMetagenomicData

——全球蛋白數(shù)據(jù)庫（UniProt）：/ebi-uniprot

——微生物基因組數(shù)據(jù)庫：

——高精度的病毒數(shù)據(jù)庫：/

——美國食品藥品監(jiān)督局監(jiān)管級微生物序列數(shù)據(jù)庫（BioProject231221）：

/medical-devices/science-and-research-medical-devices/database-reference-grade-microbi

al-sequences-fda-argos

10.3微生物序列比對及鑒定

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10.3.1使用微生物比對分析軟件，將樣本的序列比對到數(shù)據(jù)庫參考序列上，將比對結(jié)果按照序列的數(shù)

量進行排序。比對分析軟件的詳細操作可參考附錄C中的示例。

10.3.2統(tǒng)計比對到空氣微生物的目、科、屬及種的序列數(shù)量，結(jié)合微生物基因組大小的差異，首先將

檢測到的序列以每百萬次序列數(shù)（RPM）為單位進行標準化，并計算相對豐度、絕對豐度及覆蓋度。

當某些微生物（例如結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌、某些真菌）的生長特點和結(jié)構特點導致其核酸提取的難度

較大時，測出的特異性序列數(shù)可能較少，判斷是病原微生物的最低閾值如下：

——細胞內(nèi)細菌（如MTB和軍團菌）的閾值大于1RPM；

——病毒的閾值大于3RPM；

——真菌的閾值大于5RPM；

——逆轉(zhuǎn)錄病毒的閾值大于1000RPM；

當增加大規(guī)模測序的序列數(shù)量達到100RPM以上時，判讀病原微生物的可信度更高。

10.3.3去除病原微生物假陽性。按照公式（1）計算樣本RPMS與陰性對照RPMN的比率RPMr，確定

空氣中病原微生物感染的狀況。

RPMr=RPMs/RPMN·····························································(1)

式中：

RPMr——樣本的每百萬次序列數(shù)與陰性對照的每百萬次序列數(shù)的比率;

RPMS——樣本的每百萬次序列數(shù)；

RPMN——陰性對照的每百萬次序列數(shù)。

樣本RPMS是陰性對照RPMN的10倍（即RPMr≥10）時可以認定為病原微生物。例如，在醫(yī)院環(huán)境

中對空氣微生物進行采樣和宏基因組測序后，去除假陽性，當計算得到某病原微生物的RPMr≥10時，

可將該病原微生物納入采樣點的病原微生物檢測報告中。

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A

A

附錄A

（資料性）

核酸提取方法及步驟

A.1宏基因組DNA提取

A.1.1概述

采用微生物痕量DNA提取試劑盒（磁珠法）進行微生物基因組的提取，取1mL的空氣微生物提取

液，先離心收集到100μL，然后裂解細菌，使用試劑盒方法提取細菌DNA溶于100μL的PE溶液中，置

于-20℃以下保存。

A.1.2提取步驟

A.1.2.1取1mL空氣微生物的收集液，12,000g離心5min收集細菌，吸棄900μL上層上清液。加入100μL

溶菌酶消化液（20mg/mL）及5μLRNA酶。

A.1.2.2加入20μLProteinaseK（20mg/mL），再加入300μLBufferLB，振蕩混勻后將離心管放置于

恒溫混勻儀上，轉(zhuǎn)速控制在800rpm~1000rpm，溫度控制在65℃孵育15min~30min直至液體變澄清。

A.1.2.3加入350μL異丙醇，振蕩混勻后再加入20μLMagneticBeadsH，振蕩混勻，室溫靜置5min，

中間混勻1~2次。

A.1.2.4將離心管放置磁力架上靜置2min，磁珠完全吸附后，小心吸棄上清液體。

A.1.2.5將離心管從磁力架上取下，加入500μLBufferW1（使用前確保已加入無水乙醇），振蕩混勻，

室溫靜置2min。

A.1.2.6將離心管放置磁力架上靜置1min，磁珠完全吸附后，小心吸棄上清液體。

A.1.2.7將離心管從磁力架上取下，加入600μLBufferW2（使用前確保已加入無水乙醇），室溫靜置1

min。

A.1.2.8將離心管放置磁力架上靜置1min，磁珠完全吸附后，小心吸棄上清液體。

A.1.2.9重復步驟A1.2.7~A1.2.8步驟一次，盡可能吸棄離心管中殘留的液體。

A.1.2.10將離心管放置磁力架上，開蓋室溫干燥10min，確保乙醇揮發(fā)干凈。

A.1.2.11將離心管從磁力架上取下，加入100μLBufferEB，振蕩混勻置于56℃金屬浴中，孵育5min，

期間旋渦振蕩2~3次，取出旋渦振蕩15s。

A.1.2.12將離心管放置磁力架上，靜置1min，待磁珠完全吸附后，小心吸取45μL~95μLDNA溶液轉(zhuǎn)

移至一個新的收集管中，做好標記并于-20℃以下保存。

A.2宏基因組RNA提取

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可采用微生物痕量RNA核酸提取試劑盒進行RNA的提取。詳細操作步驟按照試劑盒說明書。

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B

B

附錄B

（資料性）

測序方法

B.1測序文庫的制備

將待測序的核酸（DNA、cDNA或RNA）片段制備成兩端連有接頭（含有與擴增及測序引物互補的

序列）、中間有短序列標簽結(jié)構的標簽文庫，集合成為基因文庫；然后對基因文庫進行大規(guī)模平行擴增，

得到含有待測核酸樣品的測序文庫。

B.2待測核酸樣品的表面固定

將待測序文庫中的待測核酸樣品固定于測序介質(zhì)中。

B.3堿基循環(huán)測序

B.3.1測序錨引物與待測序標簽序列的結(jié)合

通過待測核酸樣品上攜帶的接頭，將測序所用的測序錨引物與待測核酸序列進行結(jié)合。

B.3.2標記信號的采集

加入底物核苷酸，通過DNA聚合酶的作用，使得結(jié)合在待測核酸序列上的測序錨引物進行單堿基

延伸，并利用信號收集儀器采集延伸過程中的信號或延伸后結(jié)合在測序錨引物上的底物核苷酸上的標記

物被激發(fā)出的信號。

B.3.3循環(huán)測序

信號采集結(jié)束后，重復B.3.2的步驟，直至將所有信號采集完成。

B.3.4分析采集的信號，輸出堿基序列

通過信號分析軟件，對采集得到的信號進行分析，得到物理通量、有效通量、測序讀長、測序深度

和平均覆蓋深度等基因測序儀運行參數(shù)，并最終得出待測標簽序列的堿基序列信息。若所待測核酸樣品

的核苷酸序列已有參考序列（即重測序），還能獲得測序覆蓋率，并通過與參考序列的比對，得到待測

核酸樣品的核苷酸序列的SNP信息。

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附錄C

（資料性）

鼠疫桿菌及SARS病毒測序數(shù)據(jù)比對分析示例

C.1軟件中構建數(shù)據(jù)庫

使用Kraken軟件的“-kraken-build”進行建庫參數(shù)選擇，“-standard”為標準庫，“-special”為自定義庫，

分別進行NCBI標準庫與新型冠狀病毒自定義庫的構建。

注：kraken為基于精確比對的超快速宏基因組序列分類軟件。

C.2將質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫進行比對分析

C.2.1參數(shù)設置

“-db”為選擇上一步構建的數(shù)據(jù)庫，“--unclassified-out”為輸出沒有比對上的序列，“--classified-out”

為輸出比對上的序列，“--confidence”為閾值設置，根據(jù)實際情況選擇0到1之間。

C.2.2完成比對分析后輸出比對結(jié)果。

C.3排序與過濾

排序Kraken輸出文件中的“屬”水平比對數(shù)，過濾低于10條的結(jié)果。

C.4統(tǒng)計

統(tǒng)計比對到界、門、綱、目、科、屬及種的各成分比對數(shù)（見表C.1和表C.2）。

表C.1鼠疫桿菌測序比對統(tǒng)計結(jié)果

生物分類水平名稱比對序列數(shù)量

界細菌Bacteria2000

門變形菌門Proteobacteria150

綱丙型變形菌綱Gammaproteobacteria100

目腸桿菌目Enterobacterales50

科腸桿菌科Yersiniaceae50

屬耶爾森氏菌屬Yersinia40

種鼠疫桿菌Yersiniapestis20

表C.2SARS病毒測序比對統(tǒng)計結(jié)果

生物分類水平名稱比對序列數(shù)量

界病毒Viruses3000

門-

綱-

目網(wǎng)巢病毒目Nidovirales2000

科冠狀病毒科Coronaviridae1000

屬乙型冠狀病毒屬Betacoronavirus500

種SARS相關冠狀病毒SARS-relatedcoronavirus300

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附錄D

（資料性）

數(shù)據(jù)庫中空氣微生物列表

在數(shù)據(jù)比對過程中，如需自行建庫，建議參考傳染病防治法中甲、乙、丙類傳染病能通過空氣傳播

的病原、醫(yī)學微生物學中呼吸系統(tǒng)病原以及臨床檢驗中常見病原。具體可參考附錄D中表D.1所列的

病原微生物。

表D.1數(shù)據(jù)庫中空氣微生物參考列表

病原名稱拉丁名類別傳染類別

庖疹病毒herpesvirus病毒臨檢重要病原

腺病毒Humanadenovirus病毒臨檢重要病原

腮腺炎病毒Mumpsrubulavirus病毒丙類[3]

風疹病毒Rubellavirus病毒丙類[3]

甲型流感病毒Influenzaavirus病毒乙類[3]

麻疹病毒Measlesmorbillivirus病毒乙類[3]

非典型肺炎病毒Severeacuterespiratorysyndrome

病毒乙類[3]

（SARS病毒）coronavirus

SevereAcuteRespiratorySyndrome

新型冠狀病毒病毒重大影響

Coronavirus2

中東呼吸綜合征冠MiddleEastRespiratorySyndrome

病毒重大影響

狀病毒（MERS）Coronavirus

銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa細菌臨檢重要病原

鮑曼不動桿菌Acinetobacterbaumannii細菌臨檢重要病原

金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus細菌臨檢重要病原

肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae細菌臨檢重要病原

臨檢重要病原，醫(yī)學微生

肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae細菌

物學[4]

麻風分枝桿菌Mycobacteriumleprae細菌丙類[3]，醫(yī)學微生物學[4]

鼠疫耶爾森菌Yersiniapestis細菌甲類[3]

嗜肺軍團菌Pseudomonasaeruginosa細菌醫(yī)學微生物學[4]

流感嗜血桿菌Haemophilusinfluenzae細菌醫(yī)學微生物學[4]

炭疽桿菌Bacillusanthracis細菌乙類[3]

腦膜炎球菌Neisseriameningitidis細菌乙類[3]，臨檢重要病原

乙類[3]，臨檢重要病原，

結(jié)核分支桿菌Mycobacteriumtuberculosis細菌

醫(yī)學微生物學[4]

百日咳鮑特菌Bordetellapertussis細菌乙類[3]，醫(yī)學微生物學[4]

白喉棒狀桿菌Corynebacteriumdiphtheriae細菌乙類[3]，醫(yī)學微生物學[4]

布魯氏菌Brucellasubtilis細菌乙類[3]，重大影響

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肺炎衣原體Chlamydiapneumoniae衣原體臨檢重要病原

鸚鵡熱衣原體Chlamydiapsittaci衣原體臨檢重要病原

耶氏肺孢子菌Pneumocystisjirovecii真菌臨檢重要病原

煙曲霉Aspergillusfumigatus真菌臨檢重要病原

白色念珠菌Candidaalbicans真菌臨檢重要病原

肺炎支原體Mycoplasmapneumoniae支原體臨檢重要病原

12

GB/TXXXXX—XXXX

參考文獻

1.Handelsman,J.;Rondon,M.R.;Brady,S.F.;Clardy,J.;Goodman,R.M.(1998)."Molecularbiological

accesstothechemistryofunknownsoilmicrobes:Anewfrontierfornaturalproducts".Chemistry&Biology.

5(10):R245–R249.

2.中華人民共和國衛(wèi)生部，《人間傳染的病原微物名錄》（衛(wèi)科教發(fā)[2006]15號）

3.中華人民共和國傳染病防治法（1989年2月21日第七屆全國人民代表大會常務委員會第六次會議

通過）

4.李文姝.醫(yī)學微生物學.第2版.高等教育出版社，2021。

13

GB/TXXXXX—XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由全國生化檢測標準化技術委員會（SAC/TC387）提出并歸口。

本文件起草單位：

本文件主要起草人：

II

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空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法

1范圍

本文件規(guī)定了空氣中病原微生物宏基因組測序鑒定方法的術語、原理、實驗室工作條件、儀器設備、

試劑、試驗步驟及測序結(jié)果分析。

本文件適用于空氣中病原微生物的鑒定及監(jiān)測，病原微生物種類包括細菌、真菌和病毒等。適用于

鳥槍法的宏基因組測序的鑒定，病原微生物的檢出限為500CFU/m3。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB50346生物安全實驗室建筑技術規(guī)范

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T18204.3公共場所衛(wèi)生檢驗方法第3部分：空氣微生物

GB/T29859生物信息學術語

GB/T30989高通量基因測序技術規(guī)程

WS233病原微生物實驗室安全通用準則

WS598病原微生物實驗室生物安全標識

JJF1265生物計量術語及定義

ISO20397-2:2021Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part2:Qualityevaluationof

sequencingdata

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

病原微生物pathogenicmicroorganism

侵入生物體引起感染甚至傳染病的微生物，包括細菌、真菌和病毒等。

宏基因組metagenome

特定環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和，包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因。

[來源：JJF1265，定義]

1

GB/TXXXXX—XXXX

測序sequencing

測定一個核酸分子中核苷酸堿基（腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶）的順序和含量。

注:序列一般從5'到3'端進行描述。

[來源：ISO20397-2:2021]

大規(guī)模并行高通量測序massivelyparallelhigh-throughputsequencing

一次同時測定數(shù)百萬到數(shù)十億之多的獨立核酸分子序列的測序技術。

鳥槍法測序shotgunsequencing

將基因組打斷為DNA片段并進行測序的方法。

[來源：GB/T29859，定義2.4.15]

文庫libary

通過生物來源的、人工合成的或克隆技術等所得到的一個重建分子群，如基因組文庫、互補DNA

文庫、噬菌體展示肽文庫等。

[來源：GB/T30989，定義3.5]

3.7

每百萬序列數(shù)readspermillion，RPM

每百萬條序列中，比對到目標基因組的序列數(shù)量。

4縮略詞

下列縮略語適用于本文件。

cDNA：互補DNA（complementarydeoxyribonucleicacid）

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

NCBI：美國國家生物信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation）

PCR：聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

RPM:每百萬序列數(shù)（readspermillion）

SARS：嚴重急性呼吸綜合征（severeacuterespiratorysyndrome）

SNP：單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism）

5原理

通過生物氣溶膠采樣器采集空氣樣本，結(jié)合核酸提取、文庫制備及宏基因組無偏向測序得到微生物

的DNA序列、RNA序列等，并進行過程質(zhì)量控制。使用序列比對分析軟件將測序獲得的微生物基因組

序列比對到微生物的參考基因組數(shù)據(jù)庫上，獲得數(shù)據(jù)庫中比對到的微生物的基因組覆蓋率及深度等信息，

根據(jù)設定的閾值進而對樣本中微生物進行鑒定。

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GB/TXXXXX—XXXX

6實驗室工作條件

6.1基本要求

實驗室應做到無菌操作，按照功能劃分為核酸提取區(qū)、文庫制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)及其

他區(qū)域。工作條件應符合GB/T30989。

6.2特殊要求

6.2.1采集的空氣微生物中如可能存在第一類、第二類和第三類病原微生物，實驗室的建筑、設施設備、

個人防護裝置，應具備GB50346中相應的生物安全級別要求的設計、安裝及配置。

6.2.2實驗室人員的要求、樣本的運輸與管理、實驗活動的管理、消毒與滅菌、廢棄物的處置、應急預

案與意外事故的處置應符合WS233。生物安全監(jiān)督檢查應符合GB19489。

6.2.3實驗室應按照WS598的要求，在實驗室相應區(qū)域設置正確的標識。

7試劑

所需試劑主要包括核酸提取試劑、文庫構建試劑、大規(guī)模平行擴增試劑以及測序試劑。除另有規(guī)定

外，試劑應為分析純或生化試劑，實驗用水應符合GB/T6682中一級水的要求。

7.1核酸提取試劑

痕量核酸提取試劑盒，及提取過程中需要的無水乙醇、異丙醇、RNA酶A、DNA酶I和溶壁酶。

7.2文庫構建試劑

建庫試劑盒，及建庫過程中需要的文庫接頭、T4連接酶、DNA聚合酶I和dNTP等。

7.3標準物質(zhì)

采用國家標準物質(zhì)作為質(zhì)量控制標準。

7.4其他試劑

用于文庫制備、擴增、測序的試劑可參考GB/T30989。RNA反轉(zhuǎn)錄使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

8儀器和設備

8.1生物氣溶膠采樣器：流量不小于300L/min。

8.2離心機：最高轉(zhuǎn)速不小于12000g。

8.3PCR儀：溫度設置范圍0℃~99℃；最大循環(huán)數(shù)為99；升降溫速度3℃/s。

8.4渦旋振蕩儀。

8.5測序儀：測序通量大于1Gb，堿基識別質(zhì)量大于20，堿基識別正確率大于99.9%。

8.6冰箱：冷凍溫度可達-80℃或以下。

3

GB/TXXXXX—XXXX

8.7水浴鍋或金屬?。簻囟确秶?℃~100℃。

8.8垂直電泳槽及電泳儀。

8.9II級或III級生物安全柜。

9試驗步驟

9.1樣本采集

9.1.1采樣點設置

按照GB/T18204.3中的要求進行布點，具體如下：

a)室內(nèi)面積不足50m3的設置1個采樣點，50m3~200m3的設置2個采樣點，200m3以上的設置3個

~5個采樣點。

b)采樣點按均勻布點原則布置，室內(nèi)1個采樣點的設置在中央，2個采樣點的設置在室內(nèi)對稱點

上，3個采樣點的設置在室內(nèi)對角線四等分的3個等分點上，5個采樣點的按照梅花布點，其他

的按均勻布點原則布置。

c)采樣點距離地面高度1.2m~1.5m，距離墻壁不小于1m。

d)采樣點應避開通風口、通風道等。

9.1.2采樣方法

將生物氣溶膠采樣器（以下簡稱采樣器）放在距離地面1.2m~1.5m的位置，采樣器使用按照說明

書要求進行。在采集前應注意使用無菌水清洗采樣器內(nèi)部3次，并通過連續(xù)按下收集按鈕3次，使用

自動清洗功能3次。使用采樣器以（300~350）L/min流量采集1h，采集過程中注意無菌操作，每個采

樣點重復采樣3次。

將獲得的5mL~7mL采集液直接用于下一步核酸提取或者12000g離心1min后吸凈上清，重新懸

浮于1mL的緩沖液中。如需運輸，-20℃保存時間不超過24h；根據(jù)微生物特性，長期保存可置于

-196℃~-80℃。

9.2核酸提取與質(zhì)量控制

采用痕量核酸提取試劑盒進行空氣微生物核酸的提取，同時使用空氣采集液作為陰性對照同時進行

提取，詳細提取方法及步驟按照試劑盒說明書或參考附錄A。

進行RNA的提取時，應注意盡量在人少時進行，防止空氣中RNA酶的污染，所用設備和耗材應無

RNA酶污染，并在使用前用紫外燈照射。對提取的核酸進行檢測與質(zhì)量控制時，加入標準物質(zhì)后的核

酸總