血清學反應試驗

關于血清學反應試驗血清學試驗血清學鑒定：用已知抗體鑒定未知的細菌或標本中的抗原血清學診斷：用已知抗原檢測血清中的特異性抗體第2頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原（antigen）是一類能刺激人或動物機體產生抗體或致敏淋巴細胞（免疫原性），并能與這些產物在體內或體外發(fā)生特異性反應的物質（反應原性）。第3頁,共75頁，星期六，2024年，5月（一）抗原的性質1.異物性異種間的物質同種異體間的物質眼睛水晶體蛋白質、精細胞及甲狀腺球蛋白等自體內隔絕物質：抗原的性質第4頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原的性質3.立體化學結構：一般分子結構和空間構象愈復雜的物質，免疫原性愈強。4.抗原決定族antigenicdeterminant(抗原分子表面上的具有一定化學組成和結構的特殊化學基團)決定其特異性2.分子量足夠大：一般>104道爾頓第5頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原決定族第6頁,共75頁，星期六，2024年，5月人工抗原天然抗原合成抗原異種抗原同種異體抗原自身抗原核酸抗原蛋白質抗原脂抗原多糖抗原抗原種類抗原的種類半抗原（只有反應原性而無免疫原性）完全抗原第7頁,共75頁，星期六，2024年，5月微生物抗原成分細菌抗原成分菌體抗原:革蘭氏陰性菌的菌體抗原稱O抗原脂多糖蛋白質的復合物微生物抗原鞭毛抗原稱為H抗原表面抗原:不同細菌的表抗原名稱不同.大腸桿菌的表面抗原稱為封套抗原或K抗原,肺炎雙球菌的叫莢膜抗原,傷寒沙門氏菌的表面抗原稱為Vi抗原第8頁,共75頁，星期六，2024年，5月細菌抗原細菌的各種抗原第9頁,共75頁，星期六，2024年，5月微生物抗原顆?？乖M分抗原可溶性抗原微生物抗原成分病毒抗原成分第10頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗體是由抗原刺激人體或動物體的B細胞,由B細胞轉化成漿細胞所產生的具有特異性的免疫球蛋白(immunoglobulin,縮寫為Ig)．抗體(antigen)第11頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗體種類IgＧ：存在于血清（占血清免疫球蛋白總量的80%）和組織液中?？贵w的結構和種類IgA：二體IgD：IgE：IgM：五體第12頁,共75頁，星期六，2024年，5月IgG結構第13頁,共75頁，星期六，2024年，5月IgA結構IgＡ：存在于血清（占血清免疫球蛋白總量的13%）和外分泌液中第14頁,共75頁，星期六，2024年，5月IgM等結構IgＭ：血液中IgＤ：血清中，1%IgＥ：血清中，0.002%第15頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗體的產生部位淋巴器官一級淋巴器官二級淋巴器官胸腺骨髓(鳥)法氏囊淋巴結（約500-600個）脾臟第16頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗體在人體中產生部位thymusBonemarrowspleenLymphnode抗體的存在部位:血清、乳汁、體液第17頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗體作用第18頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）第19頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原抗體反應抗原抗體反應（antigen-antibodyreaction）是指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結合反應?？砂l(fā)生于體內（invivo），也可發(fā)生于體外(invitro)。體內反應可介導吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應則根據抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應的介質（例如電解質、補體、固相載體等）不同，可出現凝集反應、沉淀反應、補體參與的反應及中和反應等各種不同的反應類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多采用血清作試驗，所以體外抗原抗體反應亦稱為血清反應（erologicreaction）。第20頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原抗體反應條件抗原抗體反應條件抗原抗體3.環(huán)境因素：（1）電介質：0.85%NaCI；（2）溫度：37或56（3）pH值：7.0（4）振蕩：適當的機械振蕩

（5）反應時間第21頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原抗體反應一般規(guī)律特異性和交叉性若兩種抗原之間含有部分共同抗原時，則發(fā)生交叉反應。親緣關系越近，交叉反應的程度也越高。反應的可逆性

抗原與抗體的結合為分子表面的結合，結合的適宜溫度為0～40℃、pH在4.0～9.0范圍內。如溫度超過60℃或pH降到3.0以下，或加入解離劑臺硫氰化鉀、尿素等，則抗原抗體復合物又可重新解離，解離后的抗原或抗體性質不改變。第22頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原抗體反應一般規(guī)律最適比和帶現象只有抗原與抗體呈適當比例時，才可出現可見的結合反應。當抗原過多或抗體過多，則抗原抗體的結合不能形成大的復合物，因而抑制可見反應的出現，這一現象稱為帶現象?？贵w過多出現的抑制現象稱前帶現象，而抗原過多出現的抑制現象稱后帶現象。為了克服帶現象，在進行血清學試驗時，需將抗原或抗體作適當稀釋。第23頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原抗體反應一般規(guī)律反應的二階段性結合階段反應發(fā)生快，幾秒鐘至幾分鐘。反應階段較慢，需幾分鐘、幾十分鐘或更長時間。第24頁,共75頁，星期六，2024年，5月凝集反應顆粒性抗原（如細菌、紅血球等）或吸附在乳膠、白陶土、離子交換樹脂和紅細胞的抗原與其特異性抗體結合后，在有電介質存在時，凝聚成肉眼可見的凝集小塊。凝集原——凝集素直接凝集反應玻片法試管法抗原抗體反應類型凝集反應第25頁,共75頁，星期六，2024年，5月血清凝集試驗第26頁,共75頁，星期六，2024年，5月間接凝集反應將可溶性抗原（或抗體）吸附于與免疫無關的小顆粒（載體）表面，加入相應的抗體（或抗原），在適宜條件下，發(fā)生凝集反應。載體：動物的紅血球；聚苯乙烯乳膠；矽酸鋁；活性炭等?？乖贵w反應類型間接凝集反應第27頁,共75頁，星期六，2024年，5月間接血凝試驗間接血凝試驗吸附抗原的紅細胞就稱為致敏紅細胞。致敏紅細胞與相應抗體結合后，能出現紅細胞凝集現象。

用已知抗原吸附于紅細胞上檢測未知抗體稱為正向間接血凝試驗，用已知抗體吸附于紅細胞上鑒定未知抗原稱為反向間接血凝試驗。

常用的紅細胞有綿羊、家兔、雞及人的O型紅細胞。

抗原抗體反應類型間接凝集反應第28頁,共75頁，星期六，2024年，5月間接血凝抑制試驗間接血凝抑制試驗

抗體與游離抗原結合后就不能凝集抗原致敏的紅細胞，從而使紅細胞凝集現象受到抑制，這一試驗被稱為間接血凝抑制試驗。抗原抗體反應類型間接凝集反應第29頁,共75頁，星期六，2024年，5月乳膠凝集試驗乳膠凝集試驗

以乳膠顆粒作為載體的間接凝集試驗，稱為乳膠凝集試驗。該試驗既可檢測相應的抗體也可鑒定未知的抗原，而且方法簡便、快速，在臨床診斷中廣泛應用于偽狂犬病、流行性乙型腦炎、鉤端螺旋體病、豬細小病毒病、豬傳染性萎縮性鼻炎、禽衣原體病、山羊傳染性胸膜肺炎、囊蟲病等的診斷。

抗原抗體反應類型間接凝集反應第30頁,共75頁，星期六，2024年，5月協(xié)同凝集試驗協(xié)同凝集試驗

葡萄球菌A蛋白是大多數金黃色葡萄球菌的特異性表面抗原，能與多種哺乳動物血清中的IgG分子的Fc片段相結合，結合后的IgG仍保持其抗體活性。當這種覆蓋著特異性抗體的葡萄球菌與相應抗原結合時，可以相互連接引起協(xié)同凝集反應，在玻板上數分鐘內即可判定結果(加圖圖八)。目前已廣泛應用于快速鑒定細菌、霉形體和病毒等抗原抗體反應類型間接凝集反應第31頁,共75頁，星期六，2024年，5月碳粉凝集試驗炭粉凝集試驗

以極細的活性炭粉作為載體的間接凝集試驗，稱為炭粉凝集試驗。反應在玻板上或塑料反應盤進行，數分鐘后即可判定結果。通常是用抗體致敏炭粉顆粒制成炭素血清，用以檢測抗原，如馬流產沙門氏菌；也可用抗原致敏炭粉，用以檢測抗體，如腺病毒感染、沙門氏菌病、大腸桿菌病、囊蟲病等的診斷。抗原抗體反應類型間接凝集反應第32頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原抗體反應類型沉淀反應（precipitationreaction)可溶性抗原（如細菌的外毒素、內毒素、菌體裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等）與相應的抗體結合，在適量電介質存在下，形成肉眼可見的細微的白色沉淀。第33頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗原抗體反應類型沉淀反應（precipitationreaction)可溶性抗原+相應抗體

肉眼可見的沉淀第34頁,共75頁，星期六，2024年，5月沉淀反應環(huán)狀沉淀反應絮狀沉淀反應抗原沉淀環(huán)抗血清抗原抗血清混合抗原抗體反應類型沉淀反應常用于毒素、類毒素和抗毒素的定量測定主要用于抗原的定性試驗，如炭疽病的診斷（Ascoli氏試驗）、鏈球菌的血清型鑒定和血跡鑒定等第35頁,共75頁，星期六，2024年，5月沉淀反應沉淀反應凝膠擴散試驗：1%瓊脂凝膠的孔徑約85毫微米，可允許各種抗原抗體自由擴散。由近及遠形成濃度梯度。單向單擴散單向雙擴散抗原抗血清+瓊脂抗原瓊脂抗血清+瓊脂第36頁,共75頁，星期六，2024年，5月沉淀反應沉淀反應瓊脂擴散試驗：雙向單擴散雙向雙擴散抗血清+瓊脂抗原沉淀線孔徑3mm抗原待檢血清標準陽性抗血清第37頁,共75頁，星期六，2024年，5月單向免疫擴散第38頁,共75頁，星期六，2024年，5月A：Ag、Ab濃度及擴散率近似；B：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＞Ab；C：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＜Ab；D：擴散率近似，濃度Ag＞Ab；E：濃度Ag＞Ab，擴散率Ag＞Ab；F：濃度Ag＜Ab，擴散率Ag＜Ab沉淀線形狀、位置與抗原抗體擴散率及濃度的關系雙向瓊脂擴散第39頁,共75頁，星期六，2024年，5月(1)沉淀線吻合：待檢抗原與標準抗原完全相同。(2)沉淀線相切：待檢抗原中含有與標準抗原相同的抗原，還含有另外的抗原與抗血清相對應。(3)沉淀線相交：待檢抗原有與抗血清對應的抗原，但和標準抗原不同。(4)沉淀線部分吻合：待測抗原和標準抗原性質相同，但含量較低。A1：待檢抗原；A2：標準抗原雙響瓊脂擴散第40頁,共75頁，星期六，2024年，5月抗體效價滴定用梅花型孔，中間放抗原，周圍孔放下不同稀釋度的相應抗體，以出現沉淀線的最高稀釋倍數為該抗體的效價。第41頁,共75頁，星期六，2024年，5月對流免疫電泳在pH為8.6的瓊脂凝膠板上打孔，兩孔為一組，孔徑3mm，抗原、抗體孔間距為4～5mm。將抗原加入負極端孔內，抗體加入正極端孔內，用2～4mA/cm電流電泳1h左右，觀察結果，在兩孔之間出現沉淀帶的為陽性反應。第42頁,共75頁，星期六，2024年，5月在pH8.6的瓊脂凝膠中，抗體球蛋白因等電點高，只帶有微弱的負電荷，而且分子又較大，因此電泳力小，小于電滲力，泳向負極；而一般抗原蛋白質常帶較強的負電荷，分子較小，電泳力大，大于電滲力，泳向正極，電泳時抗原放負極側，抗體放正極側，抗原抗體相對泳動，一定時間后抗原和抗體將在兩孔之間相遇，在比例適當處形成肉眼可見的沉淀線。對流免疫電泳原理第43頁,共75頁，星期六，2024年，5月對流免疫電泳結果判定

1為陽性2為弱陽性3/4為強陽性第44頁,共75頁，星期六，2024年，5月對流電泳方法評價簡便、快速、敏感度較雙向瓊脂擴散試驗高8~10倍，但分辨力低于雙向瓊脂擴散試驗。第45頁,共75頁，星期六，2024年，5月火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis,RIE)第46頁,共75頁，星期六，2024年，5月火箭免疫電泳火箭免疫電泳是單向單擴散和電泳技術相結合的一種血清學試驗。是讓抗原在電場的作用下，在含有抗體的瓊脂中定向泳動，二者比例合適時形成類似火箭樣的沉淀峰。沉淀峰的高度與抗原的濃度成正比。第47頁,共75頁，星期六，2024年，5月火箭免疫操作步驟1.制備抗體瓊脂糖凝膠板將已融化的1.2%巴比妥緩沖瓊脂糖冷卻至55℃左右，加入適量抗血清，混勻后立即澆板，置室溫凝固。2.打孔在瓊脂凝膠板一側打孔，孔徑3mm，孔距2mm。置瓊脂板于電泳槽內，搭橋后用微量注射器準確加樣10μl。3.電泳樣品孔放負極側，電壓8~10V/cm或電流3~5mA/cm，電泳6h。4.觀察沉淀峰電泳完畢后，觀察瓊脂板上沉淀峰，并測量從孔中心到峰尖的高度。5.繪制標準曲線圖以峰高為縱坐標，濃度為橫坐標(對數坐標)，繪制標準曲線，求出待檢樣品內抗原濃度第48頁,共75頁，星期六，2024年，5月火箭免疫結果若抗原與抗體比例合適，則孔前出現頂端完全閉合的火箭狀沉淀峰；抗原大量過剩時或不形成沉淀峰，或沉淀峰不閉合；抗原中等過剩時沉淀峰呈圓形；當二者比例不適當時，常不能形成火箭狀沉淀峰。第49頁,共75頁，星期六，2024年，5月火箭免疫電泳方法評價火箭電泳是一種操作簡便、省時、結果重復性好的定量檢測方法。其敏感度可測0.3mg/L抗原含量，若低于此水平則難以形成可見的沉淀峰。如加入少量125I標記的抗原在含抗體的瓊脂板上電泳，形成的不可見火箭峰，經洗滌干燥后，用X線膠片感光，經顯影和定影，可呈現同位素顯影，這就是放射自顯影技術，可用于微量抗原含量測定，如測定血清AFP或IgE含量，可測至μg/L水平。第50頁,共75頁，星期六，2024年，5月免疫電泳(immunoelectrophoresis,IEP)是將區(qū)帶電泳和雙向瓊脂擴散相結合的一種免疫化學分析技術。第51頁,共75頁，星期六，2024年，5月免疫電泳示意圖第52頁,共75頁，星期六，2024年，5月免疫電泳操作步驟1.取潔凈載玻片，澆注融化的瓊脂凝膠，凝固后打孔挖槽。2.用微量加樣器加待檢標本或正常血清對照于孔內。3.電泳條件以電壓4~6V/cm或電流2~3mA/cm為宜，電泳1.5~2h。4.電泳完畢后，用毛細滴管在槽內加入含相應抗原，孵育，使抗原抗體雙相擴散，形成沉淀線。5.觀察沉淀線的數目、形狀和位置。經漂洗、干燥、染色、脫色等步驟制作染色標本，可長期保存。例如血漿蛋白免疫電泳。第53頁,共75頁，星期六，2024年，5月免疫電泳方法評價免疫電泳分辨率高，可分出人血清中20~30種抗原成分，可鑒定混合抗原中各組分。第54頁,共75頁，星期六，2024年，5月補體結合反應補體特點：補體可與任何抗原抗體復合物結合，但不能單獨與抗原或抗體結合。在有特異抗體存在時可以溶解細胞（溶菌或溶血）。抗原抗體反應類型補體結合反應有補體參加的抗原抗體反應。第55頁,共75頁，星期六，2024年，5月補體結合反應抗原+抗體抗原抗體復合物補體羊紅細胞+溶血素羊紅細胞溶血素復合物（不溶血）抗原+抗體不結合羊紅細胞+溶血素羊紅細胞溶血素復合物（溶血）補體指示系統(tǒng)：反應系統(tǒng)：第56頁,共75頁，星期六，2024年，5月補體結合反應第57頁,共75頁，星期六，2024年，5月標記抗原抗體反應可用放射性同位素、熒光素或酶等標記抗原或抗體?？乖贵w反應類型

標記抗原抗體反應第58頁,共75頁，星期六，2024年，5月免疫熒光技術是用熒光色素對抗體或抗原進行標記，再與相應抗原或抗體結合，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光以分析示蹤相應的抗原或抗體的方法。常用的熒光色素有異硫氰酸熒光素（FITC），此外還有四乙基羅丹明（RB200）、四甲基異硫氰酸羅丹明（TMRITC）和三氯三嗪基氨基熒光素（DTAF）等。

第59頁,共75頁，星期六，2024年，5月免疫熒光法第60頁,共75頁，星期六，2024年，5月熒光標記法抗原抗體抗原抗抗體抗體直接免疫熒光法間接免疫熒光法第61頁,共75頁，星期六，2024年，5月酶標記抗體技術（免疫酶技術）是利用抗原抗體的特異性結合和酶的高效特異的催化作用顯色而建立起來的免疫檢測技術。常用的標記酶是辣根過氧化物酶（HRP），其作用底物為過氧化氫，催化時需要供氫體，常用的供氫體有3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和鄰苯二胺（OPD），前者反應后形成不溶性的棕色物質，適用于免疫酶組化法；后者反應后形成可溶性的橙色產物，敏感性高，易被酸終止反應，呈現的顏色可數小時不變，是ELISA中常用的供氫體。第62頁,共75頁，星期六，2024年，5月酶標記抗體技術（免疫酶技術）直接法用酶標記抗體直接處理含待檢抗原的標本，洗滌后浸于含有過氧化氫和DAB的顯色反應液中作用，然后在普通光學顯微鏡下觀察顏色反應，抗原所在部位呈棕黃色。間接法含待檢抗原的標本先用未標記的抗血清處理，洗滌后再用相應的酶標記抗抗體處理，洗滌，然后浸于含有過氧化氫和DAB的顯色反應液中作用，普通光學顯微鏡下觀察顏色反應，以指示是否有抗原-抗體-抗抗體復合物存在。第63頁,共75頁，星期六，2024年，5月酶聯(lián)免疫吸附試驗（簡稱ELISA）將抗原或抗體吸附于固相載體的表面，酶標記物與相應的抗體或抗原反應后，形成酶標記抗原抗體復合物，在遇到相應底物時，結合物上的酶催化底物產生水解、氧化或還原等反應，從而生成可溶性或不溶性的有色物質，可用肉眼或酶標測定儀判定結果。顏色的深淺與相應的抗體或抗原量成正比，因此，可根據顏色的深淺來定量抗體或抗原。第64頁,共75頁，星期六，2024年，5月直接法將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶標記抗體與樣品(含有抗原)提取液的混合液，競爭溫育后，在固相載體表面形成抗原-抗體-酶復合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解應，產生有色物質。通過酶標檢測儀，測出酶底物的降解量，從而推知被測樣品中的抗原量。

第65頁,共75頁，星期六，2024年，5月間接法將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗體與待測樣品(含有抗原)提取液的混合液，競爭溫育后，在固相載體表面形成抗原-抗體復合物。洗除多余抗體成分，然后加入酶標記的抗抗體，與吸附在固體表面的抗原-抗體復合物相結合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下底物發(fā)生降解反應，產生有色產物，通過酶標檢測儀測出酶底物的降解量，從而推知被測樣品中的抗原量。第66頁,共75頁，星期六，2024年，5月斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗以纖維素薄膜為固相載體，在膜上進行免疫酶反應。先將抗原或抗體吸附在纖維素膜的表面，通過相應的抗體或抗原和酶標記物的一系列反應，形成酶標記抗原抗體復合物，加入底物后，結合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一種帶色物質，沉著于抗原抗體復合物吸附部位，呈現出肉眼可見的顏色斑點，試驗結果可通過顏色斑點的出現與否和色澤深淺進行判定。第67頁,共75頁，星期六，