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AbMole|類器官與CRISPR技術(shù)揭示脂肪變性機(jī)制,開啟NAFLD治療新篇章由DelilahHendriks,JosFBrouwers,KarienHamer等人在“NatureBiotechnology”上發(fā)表的名為“EngineeredhumanhepatocyteorganoidsenableCRISPR-basedtargetdiscoveryanddrugscreeningforsteatosis”的文章,在該文章中,使用了AbMole的Y-27632(M1817)抑制劑。非酒精性脂肪肝?。∟AFLD)已成為全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,影響著超過25%的全球人口。作為一種多因素疾病,NAFLD不僅與不良的生活方式和飲食習(xí)慣密切相關(guān),還受到遺傳因素的顯著影響。然而,由于缺乏適合人類生理特性的模型系統(tǒng),針對(duì)NAFLD的有效治療藥物開發(fā)進(jìn)展緩慢。近期,一項(xiàng)由DelilahHendriks及其同事在《NatureBiotechnology》上發(fā)表的研究,通過構(gòu)建人類胎兒肝細(xì)胞類器官模型,為揭示NAFLD早期階段——脂肪變性(steatosis)的分子機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)開辟了新的途徑。研究首先構(gòu)建了一個(gè)基于外源性游離脂肪酸(FFA)加載的脂肪變性模型。通過將野生型(WT)類器官暴露于油酸和棕櫚酸的混合溶液中,研究人員成功模擬了西方飲食對(duì)肝臟的影響。隨著FFA濃度的增加,類器官內(nèi)脂質(zhì)滴的積累逐漸增多,最高濃度處理下脂質(zhì)覆蓋率超過40%(圖1b,c)。同時(shí),F(xiàn)FA處理還顯著抑制了類器官的增殖能力,表現(xiàn)為Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量的急劇減少(補(bǔ)充圖2a,b),這可能與某些脂肪酸(特別是棕櫚酸)的脂毒性有關(guān)。為了探究遺傳因素在脂肪變性中的作用,研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR技術(shù)引入了PNPLA3基因的I148M變異,該變異是迄今為止已知的最強(qiáng)NAFLD遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素之一。通過基因編輯,研究人員成功構(gòu)建了PNPLA3WT、PNPLA3WT/I148M雜合子以及PNPLA3I148M/I148M純合子類器官模型。結(jié)果顯示,PNPLA3基因的不同變異形式對(duì)類器官中脂質(zhì)水平的影響存在顯著差異,純合子變異型類器官的脂肪變性程度最高,其次是雜合子變異型,而野生型類器官在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下幾乎不積累脂質(zhì)(圖1d,e,f)。此外,研究人員還觀察到PNPLA3蛋白在純合子變異型類器官的脂質(zhì)滴上顯著富集,這可能與I148M變異增加脂肪變性的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(圖1g)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PNPLA3基因變異不僅影響類器官的脂質(zhì)水平,還改變了它們對(duì)FFA挑戰(zhàn)的反應(yīng)性。與野生型類器官相比,攜帶PNPLA3I148M變異的類器官在輕度FFA挑戰(zhàn)下表現(xiàn)出更嚴(yán)重的脂肪變性(圖1h,i,j)。圖1:人類胎兒肝細(xì)胞類器官中的精確基因編輯評(píng)估了脂肪變性的遺傳易感性為了模擬單基因脂質(zhì)代謝疾病導(dǎo)致的脂肪變性,研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了APOB和MTTP基因敲除的類器官模型。這些基因在極低密度脂蛋白(VLDL)顆粒的組裝和分泌中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其突變會(huì)導(dǎo)致家族性低β脂蛋白血癥和abetalipoproteinemia等疾病。通過CRISPR技術(shù)敲除這些基因后,研究人員觀察到類器官在穩(wěn)態(tài)條件下自發(fā)積累了大量脂質(zhì),達(dá)到約30%的脂肪變性水平(圖2d,e)。脂質(zhì)組學(xué)分析表明,這些類器官中甘油三酯(TAG)的積累主要來源于內(nèi)源性脂質(zhì)合成(DNL),而非外源性脂質(zhì)來源(圖2f,g)。圖2:通過引入APOB或MTTP突變產(chǎn)生的DNL產(chǎn)生的脂質(zhì)積累的類器官模型為了尋找能夠減輕脂肪變性的藥物,研究團(tuán)隊(duì)對(duì)17種候選NAFLD藥物進(jìn)行了篩選。這些藥物包括ACC抑制劑、FAS抑制劑、DGAT2抑制劑等,旨在抑制脂質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶。結(jié)果顯示,多種藥物在不同脂肪變性模型中均表現(xiàn)出顯著的抗脂肪變性效果,特別是ACC抑制劑和FAS抑制劑,它們能夠顯著減少類器官中的脂質(zhì)積累(圖3b,c,d)。此外,F(xiàn)XR激動(dòng)劑和重組人FGF19也顯示出良好的治療效果,能夠減少約50%的脂肪變性水平(圖3c)。圖3:捕捉人肝脂肪變性不同類器官模型中的藥物反應(yīng)通過RNA-seq分析,研究人員進(jìn)一步揭示了不同藥物對(duì)類器官轉(zhuǎn)錄組的影響。ACC和FAS抑制劑不僅下調(diào)了與糖酵解和脂肪酸合成相關(guān)的基因表達(dá),還抑制了與細(xì)胞周期和DNA合成相關(guān)的基因,提示這些藥物可能具有潛在的副作用,如抑制肝細(xì)胞增殖和再生能力(圖4b,c,d,e)。相比之下,F(xiàn)XR激動(dòng)劑和FGF19主要通過誘導(dǎo)FGF19信號(hào)通路和抑制DNL來減少脂肪變性,同時(shí)伴隨著一定程度的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)的誘導(dǎo),這可能解釋了FGF19基因在肝癌中的擴(kuò)增現(xiàn)象(圖4d,e)。圖4:基于轉(zhuǎn)錄組的治療聚類揭示了減少脂肪變性的藥物作用和不良反應(yīng)為了加速基因編輯和靶點(diǎn)篩選過程,研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一個(gè)基于CRISPR敲除的篩選平臺(tái)FatTracer。該平臺(tái)利用APOB?/?和MTTP?/?類器官作為“天然”脂肪變性模型,對(duì)35個(gè)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因進(jìn)行了系統(tǒng)篩選。結(jié)果顯示,F(xiàn)ADS2基因在這一過程中脫穎而出,成為脂肪變性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(圖5c)。FADS2是Δ6去飽和酶,參與多不飽和脂肪酸(PUFA)的生物合成。FADS2敲除加劇了脂肪變性表型,而過表達(dá)FADS2則顯著減輕了脂肪變性(圖6a-h)。圖5:開發(fā)FatTracer作為CRISPR篩選平臺(tái)可識(shí)別脂肪變性介質(zhì)機(jī)制研究表明,F(xiàn)ADS2通過調(diào)節(jié)PUFA與DNL之間的平衡來影響脂肪變性水平。FADS2過表達(dá)增加了PUFA的豐度,進(jìn)而抑制了DNL途徑,減少了TAG的積累(圖6i-m)。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了FADS2在脂肪變性中的作用機(jī)制,還為開發(fā)針對(duì)NAFLD的新藥物提供了潛在靶點(diǎn)。圖6:FADS2是人肝細(xì)胞脂肪變性水平的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子綜上所述,本研究通過構(gòu)建人類胎兒肝細(xì)胞類器官模型并利用CRISPR基因編輯技術(shù)和FatTracer篩選平臺(tái),成功揭示了脂肪變性的分子機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)。未來研究可以進(jìn)一步探索FatTracer平臺(tái)在NAFLD其他階段(如NASH)中的應(yīng)用,并通過引
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