本科論文菘藍(lán)體細(xì)胞染色體加倍的研究

（生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物**********）摘要：利用秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)菘藍(lán)不同外植體（子葉、下胚軸）進(jìn)行了胚狀體誘導(dǎo)和染色體加倍的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1）子葉是胚狀體誘導(dǎo)的最佳材料，且在MS+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L培養(yǎng)基中獲得的胚狀體頻率最高。2）低濃度秋水仙素短期處理不會(huì)影響子葉胚狀體的形成頻率，但隨著秋水仙素濃度的逐漸升高，子葉所形成的胚狀體數(shù)急劇下降。3）200mg/L秋水仙素處理6d獲得的加倍胚狀體植株數(shù)最多，其加倍頻率達(dá)到41.1%。4）當(dāng)秋水仙素濃度高于500mg/L時(shí)將對(duì)子葉產(chǎn)生毒害作用，不利于胚狀體的形成。關(guān)鍵詞：崧藍(lán)秋水仙素胚狀體染色體加倍菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)屬于十字花科菘藍(lán)屬植物,其干燥根醫(yī)學(xué)上稱之為板藍(lán)根,具有清熱解毒、涼血利咽之功效,醫(yī)學(xué)上用板藍(lán)根治療傷風(fēng)感冒、發(fā)熱、頭痛、咽喉腫痛、扁桃體炎、急性腮腺炎、咳嗽痰多等多種上呼吸道感染疾病[1]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)人工誘導(dǎo)多倍體，是獲得新品種的重要途徑之一，方法簡單，實(shí)驗(yàn)條件容易控制，重復(fù)性好，處理植株量大，誘導(dǎo)率高，繁殖快。多倍體藥用植物一般具有根、莖、葉和花果的巨型性，抗逆性強(qiáng)，藥用成分含量高等特性，這正是藥材優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)育種所期望達(dá)到的目標(biāo)[2]。本研究對(duì)菘藍(lán)進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，從秋水仙堿濃度和處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)多倍體的效應(yīng)與多倍體鑒定等方面進(jìn)行了研究。材料、試劑和方法1.1材料以成熟、飽滿、品質(zhì)優(yōu)良的去夾菘藍(lán)種子做實(shí)驗(yàn)的材料。1.2無菌實(shí)生苗的獲得去夾的崧藍(lán)種子用清水沖洗30～40min，先用75%乙醇浸泡種子1min，再用20%“84消毒液”溶液浸泡種子10min，然后再用40%消毒液溶液浸泡種子10min，最后用無菌水沖洗3～5次。接種于不含任何激素的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽。1.3確定最佳培養(yǎng)基和最佳外植體將生長旺盛的崧藍(lán)無菌外植體（子葉、下胚軸）分別剪成約0.3cm2的小塊和0.5cm的小段并分別接種于以下含不同濃度激素的MS培養(yǎng)基中，每種濃度5個(gè)重復(fù)。CK：MS+BAP0.1mg/L+NAA0.1mg/L；1號(hào)：MS+BAP2.0mg/L+NAA0.2mg/L；2號(hào)：MS+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L；3號(hào)：MS+BAP1.0mg/L+NAA1.0mg/L；4號(hào)：MS+BAP1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L；5號(hào)：MS+BAP2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L。在25℃、不間斷光照下進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)。并觀察記錄不同外植體形成愈傷組織頻率以與愈傷組織生長狀態(tài)[3]1.4確定崧藍(lán)子葉加倍的秋水仙素濃度和處理時(shí)間將生長旺盛的崧藍(lán)無菌苗子葉去葉緣剪成0.3cm2小塊分別接種于含不同濃度秋水仙素的最佳（2號(hào)）培養(yǎng)基中，分別以3d、6d、9d、15d、20d為處理時(shí)間變量，每個(gè)濃度10個(gè)重復(fù)，每瓶處理接入10個(gè)外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)分化，秋水仙素處理3d、6d、9d、15d、20d時(shí)將正在培養(yǎng)的生長較好的外植體從培養(yǎng)基中取出，移入不含秋水仙素MS+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。觀察統(tǒng)計(jì)出不同秋水仙素濃度以與不同處理時(shí)間下愈傷組織生長狀態(tài)[4]。培養(yǎng)基中激素配比與濃度如下：A號(hào)：MS+50mg/L+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L；B號(hào)：MS+100mg/L+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L；C號(hào)：MS+200mg/L+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L；D號(hào)：MS+500mg/L+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L。1.5不定苗的生根、染液配制與染色體倍性確定1.5.1不定苗的生根將長勢(shì)良好的胚狀體分離接入生根培養(yǎng)基（MS+IBA0.4mg/L）中培養(yǎng)，25℃不間斷光照，觀察誘導(dǎo)生根情況，待根長至1cm左右時(shí)進(jìn)行根尖染色體倍性檢查1.5.2染液配制取3g堿性品紅溶于100ml70%酒精中（可長期保存）配制成A液，B液:取10mlA液加入90ml5%的碳酸酚（苯酚）水溶液中，兩周內(nèi)使用。C液：取55mlB液加6ml冰醋酸與6ml福爾馬林。D液：取C液20-30ml加70-80ml45%冰醋酸和1.8g山梨醇，兩周后使用。1.5.3染色體倍性確定撕取不定芽葉片下表皮檢查氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體個(gè)數(shù)。切取根尖于卡諾固定液中固定1d，棄固定液后用水沖洗，然后加1NHCl并于60℃水浴鍋中水浴8～10min，切取根尖放于載玻片上，滴加染液后壓片觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂中期染色體數(shù)目[5]結(jié)果與分析2.1崧藍(lán)胚狀體的形成培養(yǎng)3～4天后，多數(shù)子葉開始膨大，無愈傷現(xiàn)象，但可觀察到少量胚狀體（圖1）。而下胚軸兩端膨大，并無胚狀體產(chǎn)生。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，子葉產(chǎn)生更多胚狀體，但在4號(hào)（MS+BAP1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L）和5號(hào)（MS+BAP2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L）中始終沒有胚狀體，只有愈傷組織。十天后下胚軸才出現(xiàn)少量胚狀體，生長勢(shì)不強(qiáng)。子葉和下胚軸均無根出現(xiàn)。30d后在CK中出現(xiàn)幾條根（表1），表明低濃度的NAA可誘導(dǎo)生長旺盛的胚狀體并產(chǎn)生少量的根。表1不同處理下外植體生長情況天數(shù)1號(hào)2號(hào)3號(hào)4號(hào)5號(hào)CK4d葉片膨大葉片膨大較明顯葉片膨大較明顯葉片膨大葉片膨大葉片膨大10d少量叢生芽大量叢生芽大量叢生芽邊緣黃綠色顆粒狀同4號(hào)少量叢生芽18d部分芽褐化極少數(shù)芽褐化大量芽褐化大量褐化、死亡同4號(hào)少量褐化30d后大量褐化生長較好褐化嚴(yán)重幾乎全部死亡幾乎全部死亡出現(xiàn)須根BABA圖1.二號(hào)和四號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的胚狀體和愈傷組織A：2號(hào)MS+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L誘導(dǎo)的胚狀體；B：4號(hào)MS+BAP1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L誘導(dǎo)的愈傷組織2.2不同激素對(duì)菘藍(lán)子葉與下胚軸胚狀體誘導(dǎo)頻率的影響不同外植體的胚狀體與根的產(chǎn)生時(shí)間不同，子葉一般3d左右就會(huì)膨大，10d左右已經(jīng)有大量胚狀體分化，30d左右有少量根分化；下胚軸10d左右才有膨大組織出現(xiàn)（圖2）。不同激素配比與激素的不同濃度對(duì)菘藍(lán)子葉與下胚軸胚狀體誘導(dǎo)的頻率具有顯著的效應(yīng),NAA與BAP組合能夠有效誘導(dǎo)菘藍(lán)子葉胚狀體的形成，并隨著兩者濃度的升高胚狀體頻率有逐漸增加的趨勢(shì)，并于NAA、BAP均為2.0mg/L時(shí)胚狀體頻率最高（58.57%）。而2,4-D，BAP的組合能夠誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生,最終沒有分化出胚狀體。另外，在含有2，4-D的培養(yǎng)基中，菘藍(lán)外植體更易褐化，并在2，4-D、BAP均為1mg/L時(shí)褐化頻率最高，達(dá)到63.71%（表2）。表2.不同外源激素下菘藍(lán)子葉胚狀體誘導(dǎo)頻率和褐化頻率外源激素NAA2,4-DBAP胚狀體誘導(dǎo)率（%）褐化率（%）4月10號(hào)4月14號(hào)4月17號(hào)4月10號(hào)4月14號(hào)4月17號(hào)0.2-2.012.3626.8730.660002.0-2.023.4647.1458.5701.671.671.0-1.019.6333.2150.71009.52-1.01.000021.1540.3863.71-2.02.000015.6721.9247.770.1-0.1000000時(shí)間/d0時(shí)間/d020406080101520誘導(dǎo)率%子葉下胚軸圖2子葉和下胚軸胚狀體誘導(dǎo)率的比較2.3不同秋水仙素濃度與處理時(shí)間對(duì)菘藍(lán)胚狀體誘導(dǎo)頻率和加倍頻率的影響試驗(yàn)結(jié)果表明，較低的秋水仙素濃度下菘藍(lán)子葉在相同激素配比的培養(yǎng)基中所得的胚狀體數(shù)與頻率更高，尤其在50mg/L秋水仙素濃度處理3d時(shí)胚狀體頻率高達(dá)100%；但是，在低的秋水仙素濃度下所形成的胚狀體均為二倍體。隨著秋水仙素濃度的逐漸升高，子葉所形成的胚狀體數(shù)急劇下降，可胚狀體的染色體加倍率卻有升高的趨勢(shì)，以200mg/L秋水仙素處理6d獲得的加倍胚狀體數(shù)最多，其加倍頻率達(dá)到41.1%。隨著秋水仙素濃度的繼續(xù)升高，子葉的胚狀體頻率與染色體加倍頻率均下降（表3），可見，秋水仙素濃度為200mg/L、處理時(shí)間為6d時(shí)染色體加倍效果最好，秋水仙素的處理濃度過大，處理時(shí)間過長對(duì)外植體有毒害作用。表3不同秋水仙素濃度與不同處理時(shí)間對(duì)崧藍(lán)子葉胚狀體染色體加倍的影響秋水仙素濃度/mg·L-1處理時(shí)間/d處理外植體數(shù)/個(gè)可出苗外植體數(shù)/個(gè)誘導(dǎo)率/%染色體加倍的外植體數(shù)/個(gè)加倍率/%5033030100006302893.3009302996.70015302686.727.720302583.3001003302893.3310.76302686.7519.29302170628.615301860211.120301653.3002003302170523.86301756.7741.19301343.3538.515301136.7327.32030516.71205003301653.3212.56301240325930723.300153026.70020300000注：可出苗外植體數(shù)為可出誘導(dǎo)苗的外植體數(shù)誘導(dǎo)率（%）=（該處理下出誘導(dǎo)苗數(shù)）/（該處理下處理外植體數(shù)總數(shù)）×100%變異率（%）=（染色體加倍的外植體數(shù)）/（可出苗外植體數(shù)）×100%2.4菘藍(lán)染色體加倍植株的獲得2.4.1秋水仙素處理后所獲得胚狀體形狀相差很大，有的胚狀體與對(duì)照組相同，有的胚狀體葉片肥厚寬大，而有的葉片變窄，葉尖下翹，色澤深綠，葉脈粗而明顯，有的葉柄基部膨大，葉的皺褶增多，葉緣齒也增多（圖3）。圖3秋水仙素處理后獲得的變異胚狀體植株2.4.2胚狀體植株葉片保衛(wèi)細(xì)胞的觀察對(duì)外部形態(tài)有變異的幼苗葉片的下表皮氣孔顯微觀察發(fā)現(xiàn)，四倍體植株的氣孔明顯大于二倍體的氣孔（但是有些變異株中也有部分葉綠體較少，可能是嵌合體植株），細(xì)胞中葉綠體的數(shù)量明顯多于二倍體，其葉綠體數(shù)一般為16～27個(gè)，而二倍體植株下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)一般為7～19個(gè)，甚至個(gè)別植株很難觀察到葉綠體（圖4）。圖4變異株與未變異株氣孔比較2.4.3染色體數(shù)目的觀察對(duì)胚狀體植株根尖染色體鑒定結(jié)果表明，未處理無菌苗染色體數(shù)為2n=14，而變異株的染色體數(shù)為14～56條不等（圖5），有的誘導(dǎo)苗含有多種倍性的染色體[4]。這說明用秋水仙堿誘導(dǎo)菘藍(lán)獲得多倍體的方法是有效的，但卻容易產(chǎn)生倍性嵌合體。圖4二倍體與四倍體菘藍(lán)根尖染色體討論用秋水仙素處理外植體,方法簡單,容易成功,且用藥量少。實(shí)驗(yàn)表明，不同的秋水仙素濃度，不同的的處理時(shí)間，產(chǎn)生的誘導(dǎo)效果不同。四倍體產(chǎn)生的頻率在一定濃度范圍內(nèi)隨秋水仙素濃度增大而增加，但當(dāng)?shù)揭欢舛葧r(shí)，加倍率反而會(huì)降低；隨著處理時(shí)間的延長，四倍體變異率也呈現(xiàn)出先增大后減小的變化規(guī)律，這是由于到達(dá)一定濃度和時(shí)間后秋水仙素對(duì)外植體有毒害作用。植物經(jīng)秋水仙素處理后,多倍體需要進(jìn)行鑒定。通過形態(tài)特征(如葉片變大變厚,葉色深綠,花器增大,結(jié)實(shí)率降低等)與葉片氣孔長度或氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長度來鑒定加倍植株,該法直觀簡便,且不影響加倍植株的成活率。