PCR原理完整版本

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

原理及引物設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA；然后以cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下擴(kuò)增特定目的基因通常用于檢測特定基因mRNA在樣本中的表達(dá)水平PCR反應(yīng)分為三步：DNA模板變性(denaturing)在93-95℃之間使模板充分變性單鏈DNA模板與引物退火(annealling)55℃左右，此溫度選擇根據(jù)模板和引物配對結(jié)合強(qiáng)弱而定，是反應(yīng)特異性的決定因素之一引物延伸(extension)70-72℃左右，為Taq酶最適反應(yīng)溫度。PCR法的操作過程Step1:

DNA熱變性Step2:

引物退火Step3:

引物延伸5572經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s50℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃10min4℃foreverPCR反應(yīng)五要素：●模板DNA：50-200ng，高純度，增加反應(yīng)特異性●PCR用引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計。約

20bp左右；Ｇ＋Ｃ含量在45-55％之間；內(nèi)部不能有回文序列；３’端不能互補(bǔ)?！馪CR用DNA聚合酶：嗜熱桿菌、耐熱95℃●PCR用Buffer：Mg2+是輔基（2.0-3.0mM）濃度太低酶活力降低；太高反應(yīng)特異性降低?！馾NTP：100μM～200μM實(shí)時熒光定量PCR

(RealtimeQuantitativePCR)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。

與普通RT-PCR的區(qū)別

普通RT-PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)時定量PCR技術(shù)：實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量。

熒光定量PCR化學(xué)原理

1、非特異性熒光標(biāo)記：SYBRGreen、FAM等熒光基團(tuán)

2、特異性熒光標(biāo)記：TaqMan探針1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲線分析

PCR引物設(shè)計引物的重要性在整個PCR體系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進(jìn)行有效的延伸，可見引物設(shè)計好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。引物設(shè)計原則引物長度堿基分布的均衡性Tm值引物二級結(jié)構(gòu)引物3’端引物5’端引物的內(nèi)部穩(wěn)定性引物的保守性與特異性擴(kuò)增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)引物長度一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時使用較長的引物，但最多不超過70個核苷酸。堿基分布的均衡性同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個GC含量一般40-60%GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。引物Tm值一般要求：55℃-65℃。計算：對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計軟件最常用的計算方式。Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15

引物二級結(jié)構(gòu)引物二聚體盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補(bǔ)發(fā)夾結(jié)構(gòu)尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。引物3’端引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗。引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。5’端的某一位點(diǎn)修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。引物的內(nèi)部穩(wěn)定性過去認(rèn)為，引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3’端最好為G或C。現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，引物的5’端應(yīng)是相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3’端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。僅僅3’端幾個堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3’端幾個堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。引物的保守性與特異性通用引物保守性：檢測同一類病原微生物盡可能多的型別特異性：避免非特異性擴(kuò)增引物濃度與PCR引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L簡單的配算方法：配置貯存濃度為50μM引物需要的體積=（nmol數(shù)×20）μl上下游引物各取20μl+60μl水=10μM的混合引物50μlPCR反應(yīng)體系中加入1μl濃度為10μM的混合引物即可(反應(yīng)濃度為0.2umol/L)引物與PCR退火溫度退火溫度最適退火溫度（TaOpt）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。條件允許的情況下，可以通過梯度PCR摸索最適退火溫度引物設(shè)計軟件NCBIPrimerBLASTPrimer3OligoPrimerPremier5.0ThePrimerGeneratorNetPrimerPrimerPremier5.0使用介紹PreimerPremier啟動界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction引物設(shè)計界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度搜索結(jié)果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAcceptth