《飼料桑青貯干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量快速測(cè)定技術(shù)規(guī)程-近紅外光譜法》征求意見稿

ICS65.020.30B40團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/HXCY-飼料桑青貯干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量快速測(cè)定技術(shù)規(guī)程——近紅外光譜法TechnicalSpecificationforRapidDeterminationofDryMatter,CrudeProtein,NeutralDetergentFiber,andAcidDetergentFiberContentinmulberrysilagebyNearInfraredSpectroscopy（NIRS）（征求意見稿）202X-XX-XX發(fā)布202X-XX-XX實(shí)施北京華夏草業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟發(fā)布T/HXCYxxx—2024I飼料桑青貯干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量快速測(cè)定技術(shù)規(guī)程——近紅外光譜法1范圍本文件規(guī)定了近紅外法測(cè)定飼料桑青貯飼料中干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量的術(shù)語和定義、儀器設(shè)備、測(cè)定、結(jié)果處理和表示、異常樣品的確認(rèn)和處理、準(zhǔn)確性和精密度、測(cè)試報(bào)告等內(nèi)容和技術(shù)。本文件適用于我國(guó)飼料桑青貯飼料中干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本文件。GB/T18868飼料中水分，粗蛋白質(zhì)，粗纖維，粗脂肪，賴氨酸，蛋氨酸快速測(cè)定近紅外光譜法GB/T24895糧油檢驗(yàn)近紅外分析定標(biāo)模型驗(yàn)證和網(wǎng)絡(luò)管理與維護(hù)通用規(guī)則GB/T29858分子光譜多元校正定量分析通則GB/T37969近紅外光譜定性分析通則GB/T20806-2022飼料中中性洗滌纖維（NDF）的測(cè)定NY/T4427-2023飼料近紅外光譜測(cè)定應(yīng)用指南NYT1459-2022飼料中酸性洗滌纖維的測(cè)定DINENISO12099：Animalfeedingstuffs,cerealsandmilledcerealproducts-Guidelinesfortheapplicationofnearinfraredspectrometry(ISO12099:2017)3術(shù)語和定義GB/T18868和GB/T24895確立的術(shù)語和定義適用于本文件。3.1定標(biāo)模型calibration將獲得的近紅外光譜掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)預(yù)處理，通過化學(xué)分析方法結(jié)合濕化學(xué)值來建立飼料桑青貯中干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的近紅外光譜模型。3.2定標(biāo)樣品集calibrationsets樣品干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量數(shù)據(jù)已知，具有代表性，包含所有將要分析樣品含量成分范圍，用來建立校正定標(biāo)模型的樣品。3.3驗(yàn)證模型validation已獲得的數(shù)學(xué)模型需要進(jìn)行驗(yàn)證，以驗(yàn)證定標(biāo)模型性能。3.4驗(yàn)證樣品集validationsets樣品集中定標(biāo)樣品集外的樣品，用來驗(yàn)證定標(biāo)模型，評(píng)估模型的確性和精確度的樣品集。3.5異常樣品outlies馬氏距離(GD值)代表每個(gè)樣品與所有樣品的譜帶與所有樣品平均譜帶的差異，一般將GD值<3的樣品看作取自同一群體，倘使計(jì)算樣品的GD值>3，則被認(rèn)為Outliers，應(yīng)當(dāng)予以剔除。3.6標(biāo)準(zhǔn)分析誤差(SEC或SEP)樣品的近紅外光譜法測(cè)定值與經(jīng)典方法測(cè)定值間殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，表達(dá)為i-1ndi-d24儀器設(shè)備4.1近紅外光譜分析儀近紅外光譜儀掃描范圍包含波段910-2150nm(10989-4651cm-1)；儀器的噪聲應(yīng)控制在20μAU以下；波長(zhǎng)準(zhǔn)確度≤0.015nm，波長(zhǎng)重現(xiàn)性優(yōu)于0.005nm；隨機(jī)軟件具有近紅外光譜數(shù)據(jù)的收集、存儲(chǔ)分析和計(jì)算等功能，能夠建立可靠的定標(biāo)模型。4.2樣品粉碎設(shè)備粉碎后樣品的粒度分布和均勻性應(yīng)符合近紅外光譜分析儀建立定標(biāo)模型時(shí)的要求，使用時(shí)應(yīng)采用和定標(biāo)模型建立與驗(yàn)證時(shí)同樣的制備過程。5測(cè)定5.1樣品集準(zhǔn)備將飼料桑青貯樣品置于65℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，用高速萬能粉碎機(jī)粉碎并過1mm篩，粉碎的樣品要符合近紅外分析儀建立定標(biāo)模型要求，將粉樣裝入封閉潔凈盒中保存，以備光譜掃描和化學(xué)分析檢測(cè)。定標(biāo)樣品集樣品個(gè)數(shù)與驗(yàn)證樣品集樣品個(gè)數(shù)的比例為2:1。5.2分步步驟5.2.1儀器檢測(cè)每次測(cè)定前按照近紅外光譜分析儀（5.1）說明書的要求對(duì)儀器狀態(tài)自檢測(cè)試及維護(hù)。儀器開機(jī)后在正常狀態(tài)下預(yù)熱，夏季15min～20min，冬季30min以上。5.2.2定標(biāo)5.2.2.1定標(biāo)樣品選擇參與定標(biāo)的樣品應(yīng)具有代表性，即需包含所有將要分析樣品的特性。創(chuàng)建一個(gè)新的定標(biāo)模型，對(duì)于工業(yè)研究上需要200個(gè)樣品以上，按照KennardandStone算法確定建模集與驗(yàn)證集樣品，其中1/3作為預(yù)測(cè)集樣品，其余用于定標(biāo)外部檢驗(yàn)。5.2.2.2采用稱重法測(cè)定干物質(zhì)含量（附錄A）；采用杜馬斯燃燒定氮法測(cè)定粗蛋白含量（附錄B）；采用范式法測(cè)定中性洗滌纖維含量（附錄C）采用范式法測(cè)定酸性洗滌纖維含量（附錄D）。5.2.2.3光譜數(shù)據(jù)收集光譜數(shù)據(jù)收集過程中，測(cè)定條件以及樣品和環(huán)境溫度盡量保持一致。將樣品裝入與儀器相配套的托盤上，壓平至俯視呈圓形，保持表面平整以防漏光。樣品重復(fù)掃描2次，完成第一次測(cè)量后，將待測(cè)樣品從光源處挪開，將另一份待測(cè)樣品放置在光源下，數(shù)據(jù)以吸光度（-log相對(duì)漫反射率，log1/R）表示。為防止驗(yàn)證模型時(shí)外推預(yù)測(cè)數(shù)值的情況出現(xiàn)，各項(xiàng)指標(biāo)的最大、最小值劃歸定標(biāo)集。5.2.2.4定標(biāo)模型建立利用儀器建模軟件，優(yōu)化各建模參數(shù)，進(jìn)行光譜預(yù)處理，將近紅外波段光譜信息分別和干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量測(cè)定值一一對(duì)應(yīng)，采用偏最小二乘法（PartialLeastSquares,PLS）利用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件建立飼料桑青貯飼料干物質(zhì)、粗蛋白、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量定標(biāo)模型。5.2.3NIRS模型評(píng)價(jià)通過校正決定系數(shù)（R2）、校正標(biāo)準(zhǔn)差（SECV）、驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差（SEP）、殘差（Bias）、驗(yàn)證決定系數(shù)（r2）等參數(shù)對(duì)模型評(píng)估。R2和RMSE常常應(yīng)用于定量分析真值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性和偏差程度，對(duì)于定性分析而言，可以判別帶分析組分是否屬于干物質(zhì)、粗蛋白、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維。5.2.4模型驗(yàn)證及使用已獲得的數(shù)學(xué)模型需進(jìn)行驗(yàn)證及模型優(yōu)化，掃描待測(cè)樣品獲得光譜數(shù)據(jù)進(jìn)而利用所建立的模型預(yù)測(cè)出待測(cè)樣品的成分含量。按照近紅外分析儀（4.1）說明書的要求，取適量的飼料桑青貯樣品，使用規(guī)定的粉碎設(shè)備（4.2）粉碎，將粉碎好的樣品用近紅外光譜分析儀進(jìn)行測(cè)定，記錄測(cè)定數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品應(yīng)測(cè)定兩次，第一次測(cè)定后的測(cè)定樣品應(yīng)與原待測(cè)樣品混勻后，再次取樣進(jìn)行第二次測(cè)定。6結(jié)果處理和表示6.1試樣結(jié)果為了得到有效的結(jié)果，測(cè)定結(jié)果應(yīng)在儀器使用的定標(biāo)模型所覆蓋的干物質(zhì)、粗蛋白、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量范圍內(nèi)。6.1.1準(zhǔn)確性測(cè)試樣品干物質(zhì)、粗蛋白、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEP)應(yīng)不大于3%。6.1.2重復(fù)性在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作者使用相同的儀器設(shè)備，按相同測(cè)試方法，在短的時(shí)間內(nèi)通過重新分樣和重新裝樣，對(duì)同一被測(cè)樣品相互獨(dú)立測(cè)定，獲得的干物質(zhì)、粗蛋白、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量?jī)纱螠y(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差應(yīng)不大于1.5%。6.1.3再現(xiàn)性在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同操作人員使用同一型號(hào)不同設(shè)備，按相同的測(cè)定方法，對(duì)相同飼料桑樣品測(cè)定獲得的干物質(zhì)、粗蛋白、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量，兩個(gè)獨(dú)立測(cè)定結(jié)果之間的絕對(duì)差應(yīng)不大于2%。6.2結(jié)果處理如果兩個(gè)測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不符合6.1的要求，則應(yīng)再做2次獨(dú)立測(cè)試，獲得4個(gè)獨(dú)立測(cè)試結(jié)果，若4個(gè)獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的極差(Xmax—Xmin)小于或等于絕對(duì)差允許值的1.3倍，則取4個(gè)獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的平均值作為最終測(cè)試結(jié)果；如果4個(gè)獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的極差(Xmax—Xmin)大于允許差的1.3倍，則取4個(gè)獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的中位數(shù)作為最終測(cè)試結(jié)果。對(duì)于異常測(cè)試結(jié)果，所得數(shù)據(jù)不應(yīng)作為有效測(cè)試數(shù)據(jù)。7異常樣品的確認(rèn)和處理7.1異常樣品的分類異常樣品可為“好”、“壞”兩類，好的異常樣品加入定標(biāo)模型后，可增加該模型的分析能力，而壞的異常樣品加入定標(biāo)模型后，只能降低分析的準(zhǔn)確度。“好”、“壞”甄別標(biāo)準(zhǔn)有二：一是GD值，通常“好”的異常樣品GD值為>0.6或H值≤3，通常“壞”的異常樣品GD值>3；二是SEC，通?！昂谩钡漠惓悠芳尤攵?biāo)模型后，SEC不會(huì)顯著增加，而“壞”的異常樣品加人定標(biāo)模型后，SEC將顯著增加。7.2異常樣品的分析樣品干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量超過了該儀器定標(biāo)模型的范圍；采用了錯(cuò)誤的定標(biāo)模型；樣品雜質(zhì)過多；光譜掃描過程中樣品發(fā)生了位移；樣品溫度超出定標(biāo)模型規(guī)定的溫度范圍。7.3異常樣品的處理近紅外分析中發(fā)現(xiàn)異常樣品后要用經(jīng)典方法對(duì)該樣品進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)該異常樣品類型進(jìn)行確定，屬于“好”異常樣品則保留，并加入到定標(biāo)模型中，對(duì)定標(biāo)模型進(jìn)行升級(jí)；屬于“壞”異常樣品則放棄。8測(cè)試報(bào)告測(cè)試報(bào)告應(yīng)包括(但不限于)：—本文件編號(hào)；—對(duì)試樣的名稱、采樣方法、制備方法、編號(hào)等信息的描述；—儀器型號(hào)和序列號(hào)；—建模波段；—光譜預(yù)處理方法；—定標(biāo)模型名稱；—定標(biāo)模型的適用濃度范圍、溫度范圍；—試樣測(cè)試時(shí)的溫度；—試樣測(cè)定結(jié)果及必要說明；—采用的測(cè)定的方法或標(biāo)準(zhǔn)；—出現(xiàn)異常樣品時(shí)，應(yīng)提供異常樣品類型及處理的有關(guān)信息；—測(cè)試單位、測(cè)試人及測(cè)試時(shí)間；—本文件或引用文件中未規(guī)定的并可影響結(jié)果的任何操作。附錄A稱重法測(cè)定干物質(zhì)含量A1方法原理飼料桑青貯樣品在65℃條件下，將樣品加熱干燥，其失去的重量即為水分的重量，剩余的重量即為干物質(zhì)的量。A2試驗(yàn)材料和試劑電子天平（0.01g）、電熱恒溫干燥箱、樣品盤或紙袋、記號(hào)筆。A3樣品預(yù)處理對(duì)于已經(jīng)為切碎狀態(tài)的飼料桑青貯飼料樣品可直接進(jìn)行烘干處理。A4測(cè)定步驟用電子天平稱樣品盤或紙袋重量，記為m2，裝入樣品200-300g，記為m，隨后置于電熱恒溫干燥箱中65℃烘干6-8小時(shí)，放置在室內(nèi)空氣中4小時(shí)，稱重，記為m1。重復(fù)上述過程，烘干至恒重，直至兩次重量相差小于0.5g，。記錄該過程樣品的減重情況。A5結(jié)果計(jì)算干物質(zhì)(DM)含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以w表示，數(shù)值以％計(jì)，按下式計(jì)算:w=式中：m1——稱量盤(紙袋)和半干試樣的總質(zhì)量，單位為gm2——稱量盤(紙袋)質(zhì)量，單位為gm——青貯試樣質(zhì)量，單位為g附錄B杜馬斯燃燒定氮法測(cè)定粗蛋白含量B1方法原理飼料桑青貯樣品在900-1200℃高溫下燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，其中的干擾成分被一系列適當(dāng)?shù)奈談┧?，混合氣體中的氮氧化物被全部還原成分子氮，隨后氮的含量被熱導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。B2試驗(yàn)材料和試劑燃燒氣、載氣、氧化劑、還原劑、吸附、標(biāo)準(zhǔn)物、杜馬斯燃燒定氮儀、分析天平（0.0001g）、錫箔方片、固定杯模和壓樣器。B3樣品預(yù)處理飼料桑青貯樣品烘干至恒重后用球磨儀粉碎，將粉碎后的樣品置于密閉容器中備用。B4測(cè)定步驟1.校準(zhǔn)：儀器開機(jī)后，將樣品盤復(fù)原，進(jìn)行預(yù)熱，溫度達(dá)到設(shè)定后，編輯列表（2個(gè)runin、和2-3個(gè)blank，方法均選擇blackwithO2，3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，方法選擇250mgstandard-2），在對(duì)應(yīng)的樣品盤中放入標(biāo)準(zhǔn)品（50-70mg）進(jìn)行測(cè)定，得到日校正因子（要求在0.9-1.1）；2.測(cè)定：校準(zhǔn)達(dá)到要求后，開始運(yùn)行樣品，稱取0.10-0.15g樣品，包在錫箔方片中，編輯對(duì)應(yīng)的列表（樣品重量、編號(hào)、方法選擇250mgstandard-2）將包好的樣品依次放到對(duì)應(yīng)的樣品盤中，15-20個(gè)樣品后，插入1-2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，點(diǎn)擊開始測(cè)定。B5結(jié)果儀器顯示的Protein[%]值即為樣品的粗蛋白含量，單位為（%）。附錄C范式法測(cè)定中性洗滌纖維含量C1方法原理植物性飼料經(jīng)中性洗滌劑煮沸處理，不溶解的殘?jiān)鼮橹行韵礈炖w維，主要為細(xì)胞壁成分，其中包括半纖維素、纖維素、木質(zhì)素和硅酸鹽。C2試驗(yàn)材料和試劑中性洗滌劑（3%十二烷基硫酸鈉）：乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2?2H2O）、四硼酸鈉（Na2B4O7?10H2O）、十二烷基硫酸鈉（C12H25NaSO4）、乙二醇乙醚（C4H10O2）、無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）；丙酮、無水亞硫酸鈉、α-淀粉酶（耐熱型）。C3樣品預(yù)處理飼料桑青貯樣品烘干至恒重后用高速粉碎機(jī)粉碎，并過1mm篩，將粉碎后的樣品置于密封盒中備用。C4測(cè)定步驟1.稱重：取纖維袋（安康F57），先用中性筆編號(hào)，稱其質(zhì)量，精確至0.1mg，記為m1，稱取試樣0.5g，精確至0.1mg，記為m，裝入纖維袋內(nèi)，用封口機(jī)封口，并準(zhǔn)確稱量一個(gè)空白濾袋；2.酸性洗滌劑的配置：稱取37.22g乙二胺四乙酸二鈉和13.62g四硼酸鈉，放入200ml燒杯中，加適量蒸餾水溶解（可加熱），再加入60g十二烷基硫酸鈉和20ml乙二醇乙醚；稱取9.12g無水磷酸氫二鈉置于另一燒杯中，加蒸餾水加熱溶解，冷卻后將上述兩溶液轉(zhuǎn)入2000ml容量瓶并用水定容。此溶液pH值6.9~7.1；3.消煮：將裝有試樣的纖維袋放入纖維儀中，一批擺放24個(gè)樣品，所有樣品需朝同一方向擺放（全部逆時(shí)針或全部順時(shí)針），選中NDF。加入20g無水亞硫酸鈉，并倒入2L中性洗滌液至觸發(fā)感應(yīng)器，右側(cè)燒杯內(nèi)加入242ml蒸餾水+8mlα-淀粉酶（耐熱型），倉(cāng)內(nèi)加入4ml淀粉酶，擰蓋，等待結(jié)束；4.丙酮洗：將消煮后的纖維袋洗凈后放在燒杯中，用丙酮浸泡3-5min去除殘留脂肪，用量以浸沒樣品袋為標(biāo)準(zhǔn)，確保剩余物和丙酮充分混合，至濾液無色為止。取出纖維袋放置通風(fēng)櫥中讓溶劑揮發(fā)干凈；5.烘干稱重：纖維袋于干燥箱中（105±2）℃干燥4h，取出于干燥皿中冷卻15min后，準(zhǔn)確稱量，精確至0.1mg，記為m2。C5結(jié)果計(jì)算中性洗滌纖維結(jié)果按下式計(jì)算：ω(NDF%DM)=式中：ω——樣品中性洗滌纖維(NDF)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為干物質(zhì)百分比（%DM）；m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；m1——纖維袋的質(zhì)量，單位為克（g）；（需乘校正系數(shù)：空白濾袋中洗烘干后重/空白濾袋原始重）m2——纖維袋及其袋內(nèi)殘