血液學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 課件 4.項(xiàng)目四：細(xì)胞化學(xué)染色

單元一：造血細(xì)胞檢驗(yàn)項(xiàng)目四：細(xì)胞化學(xué)染色任務(wù)一細(xì)胞化學(xué)染色基本理論目錄項(xiàng)目四：細(xì)胞化學(xué)染色任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)項(xiàng)目四：細(xì)胞化學(xué)染色1.掌握：細(xì)胞化學(xué)染色的基本步驟；過(guò)氧化物酶染色、過(guò)碘酸-雪夫染色、酯酶染色、酸性磷酸酶染色、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色、鐵染色的檢測(cè)方法、結(jié)果分析和臨床意義。2.熟悉：細(xì)胞化學(xué)染色的概念；各種常用細(xì)胞化學(xué)染色的原理及注意事項(xiàng)。3.了解：細(xì)胞的生理狀態(tài)、功能和細(xì)胞化學(xué)染色的影響因素。4.具備細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)本采集和處理能力，具有過(guò)氧化物酶染色、過(guò)碘酸-雪夫染色、酯酶染色、酸性磷酸酶染色、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色、鐵染色的檢測(cè)能力。5.學(xué)會(huì)依據(jù)細(xì)胞學(xué)異常和臨床要求有選擇性進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色，并能根據(jù)染色結(jié)果輔助分析判斷白血病類型。學(xué)習(xí)目標(biāo)項(xiàng)目四：細(xì)胞化學(xué)染色任務(wù)一細(xì)胞化學(xué)染色基本理論細(xì)胞化學(xué)染色是細(xì)胞學(xué)和化學(xué)相結(jié)合而形成的一門科學(xué)，是以細(xì)胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合運(yùn)用化學(xué)反應(yīng)的原理對(duì)血細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)成分(如酶類、酯類、鐵、蛋白質(zhì)、核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。細(xì)胞化學(xué)染色主要用于：1.輔助判斷急性白血病的細(xì)胞類型。2.輔助血液系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷，如鐵染色。3.觀察疾病的療效和預(yù)后。4.發(fā)病機(jī)制的探討。一、細(xì)胞化學(xué)染色定義與臨床應(yīng)用任務(wù)一細(xì)胞化學(xué)染色基本理論固定顯示復(fù)染固定物理法干燥固定火焰固定化學(xué)法蒸汽固定液體固定顯示聯(lián)苯胺法偶氮偶聯(lián)法雪夫反應(yīng)普魯士藍(lán)反應(yīng)金屬沉淀法復(fù)染目的是使各種細(xì)胞能顯示出來(lái)以便于觀察。選擇復(fù)染液的顏色應(yīng)與有色沉淀的顏色有明顯的對(duì)比度，即能使細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示又能清楚地看出細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果。細(xì)胞化學(xué)染色步驟：二、細(xì)胞化學(xué)染色步驟任務(wù)一細(xì)胞化學(xué)染色基本理論粗略估量以染色反應(yīng)的強(qiáng)弱，受色的深淺，人為地區(qū)別為陰性和各種程度的陽(yáng)性。百分法只能反映細(xì)胞陽(yáng)性率，不能反映受色強(qiáng)弱。積分法是常用的半定量法，將前述的等級(jí)估量與百分率相結(jié)合（計(jì)算方法見(jiàn)堿性磷酸酶染色），它既反映了細(xì)胞陽(yáng)性率的高低，又反映了細(xì)胞受色的強(qiáng)弱。流式細(xì)胞儀最精確的定量方法，測(cè)定單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分含量。以細(xì)胞受色反應(yīng)的強(qiáng)弱比色，常用于RNA、DNA定量測(cè)定和各階段幼紅細(xì)胞胞漿中血紅蛋自定位、定量等。三、細(xì)胞化學(xué)染色定量分析方法任務(wù)一細(xì)胞化學(xué)染色基本理論任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)項(xiàng)目四：細(xì)胞化學(xué)染色原理（二氨基聯(lián)苯胺法）：

操作：胞質(zhì)中POX底物H2O2分解釋放新生態(tài)氧（O）二氨基聯(lián)苯胺氧化金黃色不溶性沉淀，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶所在的活性部位產(chǎn)生固定30秒4℃底物液孵育流水沖洗蘇木素或Giemsa液10～15min復(fù)染30分鐘鏡檢：觀察100個(gè)白血病細(xì)胞的染色結(jié)果，得出陽(yáng)性率和陽(yáng)性指數(shù)，或報(bào)告各種陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。新鮮涂片

甲醛-丙酮緩沖液

流水沖洗任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)一、過(guò)氧化物酶染色（POX或MPO染色）結(jié)果判斷：細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞染色─胞質(zhì)中無(wú)陽(yáng)性顆?！腊|(zhì)中細(xì)小陽(yáng)性顆粒+胞質(zhì)中陽(yáng)性顆粒較粗大++陽(yáng)性顆粒粗大密集，約占胞質(zhì)1/2～2/3+++陽(yáng)性顆粒粗大幾乎布滿胞質(zhì)++++陽(yáng)性顆粒呈團(tuán)塊狀，充滿胞質(zhì)，可覆蓋核上（++）（++）（+）（-）（+++）（+++）（++++）（-）（-）（-）（-）（±）一、過(guò)氧化物酶染色（POX或MPO染色）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)正常細(xì)胞POX染色反應(yīng)細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞染色反應(yīng)粒細(xì)胞系統(tǒng)分化差的原始粒細(xì)胞為陰性，分化好的原始粒細(xì)胞至中性成熟粒細(xì)胞均呈陽(yáng)性，且隨著細(xì)胞的成熟，陽(yáng)性反應(yīng)的程度逐漸增強(qiáng)。中性分葉核粒細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，但衰老的粒細(xì)胞陽(yáng)性程度減弱甚至呈陰性；嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)性最強(qiáng)，嗜堿性粒細(xì)胞陰性單核細(xì)胞系統(tǒng)原始單核細(xì)胞呈陰性，幼稚及成熟單核細(xì)胞多呈弱陽(yáng)性，陽(yáng)性顆粒少而細(xì)小，分布不均。淋巴細(xì)胞系統(tǒng)淋巴細(xì)胞系統(tǒng)呈陰性反應(yīng)其他細(xì)胞成熟型網(wǎng)狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞可呈不同程度的陽(yáng)性反應(yīng)，漿細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞系統(tǒng)等均為陰性反應(yīng)一、過(guò)氧化物酶染色（POX或MPO染色）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)臨床意義：主要用于鑒別急性白血病類型1.急性髓細(xì)胞白血病多呈陽(yáng)性反應(yīng)，以M3和M2型反應(yīng)最強(qiáng)，M1和M5型反應(yīng)較弱，故有助于區(qū)別M3和M5型。2.急性淋巴細(xì)胞白血病呈POX陰性反應(yīng)，或陽(yáng)性原始細(xì)胞＜3%（可能是殘留的原?；蛟缬琢＜?xì)胞），故為急性髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病鑒別的重要指標(biāo)。ALL（POX染色）M5（POX染色）M3（POX染色）M2（POX染色）一、過(guò)氧化物酶染色（POX或MPO染色）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)原理：蘇丹黑是一種脂溶性重氮染料，能溶解于細(xì)胞內(nèi)的含脂結(jié)構(gòu)（如中性脂肪、磷脂、糖脂和類固醇）中，使脂類物質(zhì)呈棕黑色或深黑色而顯示出來(lái)。脂類物質(zhì)在粒細(xì)胞中含量豐富，在單核細(xì)胞中也有少量。結(jié)果判斷及正常細(xì)胞染色反應(yīng)：與POX染色基本一致臨床意義：與POX染色基本相似注：POX染色特異性高，而SBB染色的敏感性高，因SBB染色較繁瑣，臨床上POX染色更常用，但POX染色陰性者可加做SBB染色或直接采用細(xì)胞免疫分型確認(rèn)。

二、蘇丹黑B染色（SBB染色）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)酯酶是分解各種酯類的水解酶，根據(jù)機(jī)制的不同，分為非特異性酯酶和特異性酯酶。特異性酯酶易水解具有長(zhǎng)鏈的酯類。非特異性酯酶易水解具有短鏈的酯類。單核巨噬細(xì)胞類為非特異性酯酶，中性粒細(xì)胞類則為特異性酯酶。區(qū)分單核細(xì)胞類或中性粒細(xì)胞類的重要方法，特別是二重染色法尤為重要。酯酶特異性酯酶(氯乙酸AS-D萘酚酯酶)非特異性酯酶pH值不同酸性酯酶(酸性α-醋酸萘酚酯酶)堿性酯酶(α-丁酸萘酚酯酶)中性酯酶α-醋酸萘酚酯酶醋酸AS-D萘酚酯酶三、酯酶染色任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)（一）特異性酯酶染色—氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）幾乎只出現(xiàn)在粒細(xì)胞中，特異性高，故稱“粒細(xì)胞酯酶”、“特異性酯酶”。原理：氯乙酸AS-D萘酚被細(xì)胞內(nèi)特異性酯酶水解，產(chǎn)生AS-D萘酚，再與穩(wěn)定的重氮鹽（堅(jiān)牢紫醬GBC)偶聯(lián)，生成不溶性紅色沉淀，定位于胞漿中。含萘酚的底物（氯乙酸AS-D萘酚）細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的酶萘酚AS-D重氮鹽（堅(jiān)牢紫醬GBC）生成不溶性紅色沉淀定位于胞質(zhì)相應(yīng)位置三、酯酶染色任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)（一）特異性酯酶染色—氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）操作：結(jié)果判斷：胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色彌漫性或顆粒狀沉淀為陽(yáng)性固定30-60秒基質(zhì)液37℃孵育流水沖洗蘇木素染液30min復(fù)染5min鏡檢：至少要觀察100個(gè)白血病細(xì)胞的染色結(jié)果，計(jì)算陽(yáng)性率和陽(yáng)性指數(shù)新鮮涂片

甲醛-丙酮液

流水沖洗實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞染色─為胞質(zhì)中無(wú)陽(yáng)性顆粒±為胞質(zhì)中細(xì)小陽(yáng)性顆粒+胞質(zhì)顯現(xiàn)均勻淺色陽(yáng)性反應(yīng)，占胞質(zhì)﹤1/4++胞質(zhì)顯現(xiàn)均勻紅色陽(yáng)性反應(yīng)，占胞質(zhì)﹤1/2+++胞質(zhì)充滿紅色陽(yáng)性反應(yīng)++++胞質(zhì)充滿致密紅色陽(yáng)性產(chǎn)物呈團(tuán)塊狀三、酯酶染色任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞染色反應(yīng)粒細(xì)胞系統(tǒng)分化差的原始粒細(xì)胞呈陰性，分化好的呈陽(yáng)性，自早幼粒細(xì)胞至成熟中性粒細(xì)胞均呈陽(yáng)性，但酶活性并不隨細(xì)胞的成熟而增強(qiáng)。嗜酸性粒細(xì)胞呈陰性或弱陽(yáng)性，嗜堿性粒細(xì)胞呈陽(yáng)性單核細(xì)胞系統(tǒng)絕大多數(shù)為陰性其他細(xì)胞淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨核細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、血小板等均呈陰性，但肥大細(xì)胞呈陽(yáng)性。（一）特異性酯酶染色—氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）正常細(xì)胞NAS-DCE染色反應(yīng)：任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色（一）特異性酯酶染色—氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）臨床意義：主要用于鑒別急性白血病類型（1）急性粒細(xì)胞白血病時(shí)，原粒細(xì)胞和幼稚粒細(xì)胞均呈一定程度陽(yáng)性。（2）急性單核細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病，均呈陰性。（3）急性粒-單核細(xì)胞白血病時(shí)部分細(xì)胞陽(yáng)性，部分細(xì)胞呈陰性。AML--M2a氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色1.原始粒細(xì)胞，呈弱陽(yáng)性；2.幼稚粒細(xì)胞，呈強(qiáng)陽(yáng)性；3.中性桿狀核粒細(xì)胞，呈強(qiáng)陽(yáng)性

AML—M1氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色（二）非特異性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）α-NAE存在于單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中，是一種中性非特異性的酯酶，只有單核系細(xì)胞的陽(yáng)性可被氟化鈉抑制，故α-NAE染色+氟化鈉抑制試驗(yàn)，對(duì)鑒別單核細(xì)胞白血病有重要價(jià)值。原理：含萘酚的底物（α-醋酸萘酚）重氮鹽（堅(jiān)牢藍(lán)B）作用液+氟化鈉單核細(xì)胞被抑制其他系不被抑制α-萘酚醋酸細(xì)胞內(nèi)α-NAE生成不溶性棕黑色或灰黑色沉淀定位于胞質(zhì)相應(yīng)位置任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色（二）非特異性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）操作：固定5分鐘1張基質(zhì)液37℃孵育流水沖洗甲基綠染液1小時(shí)復(fù)染5-15min鏡檢：兩種方法染色后用油鏡計(jì)數(shù)100或200個(gè)被檢細(xì)胞，分別計(jì)算出抑制前和抑制后的陽(yáng)性率和積分。按下列公式計(jì)算出抑制率：凡抑制率＞50％者，提示受氟化鈉抑制。新鮮涂片2張

固定液流水沖洗1張基質(zhì)液+氟化鈉任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色（二）非特異性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）結(jié)果判斷：胞質(zhì)內(nèi)有灰黑色或棕黑色彌漫狀或顆粒狀沉淀為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞染色0分（─）胞質(zhì)中無(wú)色素沉淀1分（+）胞質(zhì)呈彌漫淺灰色或含少量陽(yáng)性反應(yīng)顆粒2分（++）胞質(zhì)呈彌漫灰黑著色或含中等量陽(yáng)性反應(yīng)顆粒3分（+++）胞質(zhì)呈彌漫棕黑較深色或含較多陽(yáng)性反應(yīng)顆?；虬|(zhì)呈彌漫棕黑較深色4分（++++）胞質(zhì)呈彌漫深黑色或胞質(zhì)中充滿粗大陽(yáng)性反應(yīng)顆粒1.原始單核細(xì)胞（+）2.幼單核細(xì)胞（++）3.單核細(xì)胞（+++）4.巨核細(xì)胞（++）5.血小板（+++）6.桿狀核粒細(xì)胞（─）7.分葉核粒細(xì)胞（─）8.淋巴細(xì)胞（─）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色（二）非特異性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）正常細(xì)胞NAS-DCE染色反應(yīng)：細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞染色反應(yīng)單核細(xì)胞系統(tǒng)分化差的原始單核細(xì)胞呈陰性，分化好的原始單核細(xì)胞呈陽(yáng)性（常較強(qiáng)），幼稚單核及單核細(xì)胞也呈陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)能被氟化鈉抑制粒細(xì)胞系統(tǒng)各期粒細(xì)胞多數(shù)呈陰性，少數(shù)呈弱陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)不被氟化鈉抑制淋巴細(xì)胞系統(tǒng)各期淋巴細(xì)胞多呈陰性，少數(shù)呈弱陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)不被氟化鈉抑制其他細(xì)胞巨核細(xì)胞和血小板呈陽(yáng)性，少數(shù)有核紅細(xì)胞呈弱陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)不被氟化鈉抑制；漿細(xì)胞呈陰性任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色（1）急性單核細(xì)胞白血病時(shí)，α-NAE染色呈明顯陽(yáng)性反應(yīng)，且其陽(yáng)性反應(yīng)被氟化鈉抑制。（2）急性粒-單核細(xì)胞白血病時(shí)；α-NAE染色呈部分陽(yáng)性，并被氟化鈉抑制。（3）急性粒細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病時(shí)，α-NAE染色呈陰性或（弱）陽(yáng)性，且其陽(yáng)性反應(yīng)不被氟化鈉抑制。M5型--α-NAE染色原、幼單核細(xì)胞多呈強(qiáng)陽(yáng)性M5型--α-NAE+氟化鈉抑制試驗(yàn)原、幼單核細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)被氟化鈉抑制M4型--α-NAE染色部分細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性M4型--α-NAE+氟化鈉抑制試驗(yàn)部分陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞被氟化鈉抑制任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色（二）非特異性酯酶染色—α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）臨床意義：主要用于輔助鑒別急性白血病細(xì)胞的類型（三）非特異性酯酶染色—α-丁酸萘酚酯酶染色（α-NBE）α-NBE在單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中活性最強(qiáng)，能被氟化鈉抑制，而粒系、淋巴系、部分幼紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板等含量很少，被視為單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)所特有的標(biāo)志酶。原理：含萘酚的底物（α-丁酸萘酚）重氮鹽（堅(jiān)牢紫醬GBC）作用液+氟化鈉單核細(xì)胞被抑制其他系不被抑制α-萘酚丁酸細(xì)胞內(nèi)α-NBE生成不溶性紅色沉淀定位于胞質(zhì)相應(yīng)位置任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色（三）非特異性酯酶染色—α-丁酸萘酚酯酶染色（α-NBE）操作與結(jié)果判斷：基本同α-NAE一致正常細(xì)胞α-NBE染色反應(yīng)：臨床意義：臨床應(yīng)用同α-NAE細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞染色反應(yīng)粒細(xì)胞系統(tǒng)各階段粒細(xì)胞均呈陰性單核細(xì)胞系統(tǒng)分化差的原始單核細(xì)胞呈陰性，分化好的原始單核細(xì)胞呈陽(yáng)性，幼稚單核及單核細(xì)胞呈陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)能被氟化鈉抑制淋巴細(xì)胞系統(tǒng)T淋巴細(xì)胞、非T非B淋巴細(xì)胞可呈陽(yáng)性，B淋巴細(xì)胞呈陰性其他細(xì)胞巨核細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、漿細(xì)胞呈陰性或弱陽(yáng)性；組織細(xì)胞也可呈陽(yáng)性，但不被氟化鈉抑制注：1.α-NBE敏感性比α-NAE低，但特異性強(qiáng)用于鑒別急非淋的白血病類型

2.將POX染色與α-NBE染色+氟化鈉抑制聯(lián)合使用，對(duì)AML-M2、M4、M5分型更有價(jià)值任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)三、酯酶染色（四）酯酶雙染在同一張涂片上進(jìn)行兩種酯酶染色的方法稱為酯酶雙染色。正常細(xì)胞α-NBE染色反應(yīng)：酯酶雙染色可鑒別粒系細(xì)胞和單核系細(xì)胞，尤其對(duì)于急性粒-單核細(xì)胞白血病的診斷具有重要價(jià)值。多數(shù)采用一種特異性酯酶加一種非特異性酯酶染色，常用的有α-醋酸萘酚酯酶與氯乙酸AS－D萘酚酯酶雙染色、α-丁酸萘酚酯酶與氯乙酸AS－D萘酚酯酶雙染色等。臨床應(yīng)用：主要用于鑒別急性粒細(xì)胞白血病、急性粒-單核細(xì)胞白血病、急性單核細(xì)胞白血病酸性磷酸酶（ACP）存在于細(xì)胞的溶酶體顆粒中，某些細(xì)胞中的酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的診斷及鑒別診斷。原理：血細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶在酸性（pH5.0）條件下水解基質(zhì)液中的磷酸萘酚AS-BI，釋放出萘酚AS-BI，后者與基質(zhì)液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶所在的部位。pH5.0含萘酚的底物（磷酸萘酚AS-BI）重氮品紅萘酚AS-BI細(xì)胞內(nèi)ACP生成不溶性出現(xiàn)鮮紅色顆粒沉淀定位于胞質(zhì)相應(yīng)位置任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)四、酸性磷酸酶染色（ACP）（偶氮偶聯(lián)法）試劑：操作：1．甲醇-丙酮緩沖液2．基質(zhì)儲(chǔ)備液

：磷酸萘酚AS-BI100mg，N-N二甲基甲酰胺10ml3．0.1mol/L乙酸緩沖液

4．0.05mol/L乙酸-酒石酸緩沖液5．作用液Ⅰ（臨用時(shí)配制）：0.1mol/L乙酸緩沖液50ml，基質(zhì)儲(chǔ)備液1.0ml，重氮品紅25mg。6．作用液Ⅱ（臨用時(shí)配制）：0.05mol/L乙酸-酒石酸緩沖液50ml，基質(zhì)儲(chǔ)備液1.0ml，重氮品紅25mg。固定30秒1張作用液Ⅰ37℃避光浸染蒸餾水洗甲基綠染液30分鐘復(fù)染3-5min鏡檢新鮮涂片2張

固定液蒸餾水洗1張作用液Ⅱ稍干燥任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)四、酸性磷酸酶染色（ACP）（偶氮偶聯(lián)法）結(jié)果判斷：胞質(zhì)中出現(xiàn)鮮紅色顆粒沉淀為陽(yáng)性正常血細(xì)胞的染色反應(yīng)：粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均呈陽(yáng)性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞染色─胞質(zhì)無(wú)色+胞質(zhì)出現(xiàn)淡紅色顆粒++胞質(zhì)布滿鮮紅色顆粒+++胞質(zhì)充滿深紅色顆粒1（+）2（++）3（+++）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)四、酸性磷酸酶染色（ACP）（偶氮偶聯(lián)法）臨床意義：臨床ACP染色應(yīng)用較少，主要用于多毛細(xì)胞白血病的診斷及脂質(zhì)代謝障礙性疾病的鑒別。1.診斷多毛細(xì)胞白血?。憾嗝?xì)胞呈陽(yáng)性（常呈強(qiáng)陽(yáng)性），陽(yáng)性反應(yīng)不被L-酒石酸抑制。慢性淋巴細(xì)胞白血病的淋巴細(xì)胞和惡性淋巴瘤細(xì)胞ACP染色也可呈陽(yáng)性，但可被L-酒石酸抑制。2.鑒別戈謝細(xì)胞和尼曼-匹克細(xì)胞：前者陽(yáng)性，并具有抗酒石酸功能；后者陰性。多毛細(xì)胞白血病ACP染色陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性不被酒石酸抑制ALL-ACP染色陽(yáng)性反應(yīng)陽(yáng)性被酒石酸抑制戈謝細(xì)胞（1）-ACP染色陽(yáng)性反應(yīng)陽(yáng)性不被酒石酸抑制任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)四、酸性磷酸酶染色（ACP）（偶氮偶聯(lián)法）原理：過(guò)碘酸是氧化劑，能使含有乙二醇基（CHOH-CHOH）的多糖類物質(zhì)（糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白及糖酯等）氧化，形成雙醛基（CHO-CHO），醛基與雪夫試劑中的無(wú)色品紅結(jié)合，使無(wú)色的品紅變成紫紅色化合物，定位于含有多糖類的細(xì)胞內(nèi)。試劑：1.固定劑：95%乙醇2.10g/L過(guò)碘酸溶液3.雪夫染液4.偏重亞硫酸液(新鮮配制)5.復(fù)染液：20g/L甲基綠水溶液氧化結(jié)合含乙二醇基的糖類（CHOH-CHOH）無(wú)色品紅雙醛基（CHO-CHO）過(guò)碘酸變成紫紅色品紅定位于胞質(zhì)中任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)五、糖原染色（PAS）（過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)）操作：結(jié)果判斷：胞質(zhì)內(nèi)有紅色或紫紅色，呈彌散狀、顆粒狀或塊狀的物質(zhì)為陽(yáng)性固定氧化蒸餾水洗雪夫染液10分鐘10分鐘鏡檢：油鏡下各類細(xì)胞觀察100個(gè)，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算陽(yáng)性率及積分新鮮涂片95%乙醇流水沖洗10g/L過(guò)碘酸10分鐘30-60分鐘蒸餾水洗偏重亞硫酸溶液洗3次甲基綠復(fù)染

各種血細(xì)胞PAS染色1.原始粒細(xì)胞（-）2.早幼粒細(xì)胞（+）3.中性中幼粒細(xì)胞（++）4.中性晚幼粒細(xì)胞（+++）5.中性桿狀核粒細(xì)胞（++++）6.中性分葉核粒細(xì)胞（++++）7.嗜酸性粒細(xì)胞（+++）8.嗜堿性粒細(xì)胞（+++）9.單核細(xì)胞（±）10.淋巴細(xì)胞（-）11.淋巴細(xì)胞（+）12.淋巴細(xì)胞（++）13.淋巴細(xì)胞（+++）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)五、糖原染色（PAS）（過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)）正常細(xì)胞PAS染色反應(yīng)：細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞染色反應(yīng)粒細(xì)胞系統(tǒng)分化差的原始粒細(xì)胞呈陰性，分化好的原始粒細(xì)胞至中性分葉核粒細(xì)胞均呈陽(yáng)性，并隨著細(xì)胞的成熟逐漸增強(qiáng)；嗜酸性粒細(xì)胞中顆粒之間的胞質(zhì)呈紅色；嗜堿性粒細(xì)胞中的嗜堿性顆粒呈陽(yáng)性，而顆粒之間的胞質(zhì)不著色。紅細(xì)胞系統(tǒng)有核紅細(xì)胞及紅細(xì)胞均呈陰性單核細(xì)胞系統(tǒng)分化差的原始單核細(xì)胞呈陰性，其他為陽(yáng)性，絕大多數(shù)陽(yáng)性反應(yīng)物呈粗顆粒狀，有時(shí)分布于細(xì)胞邊緣的陽(yáng)性反應(yīng)物顆粒較粗大淋巴細(xì)胞系統(tǒng)大多數(shù)呈陰性，少數(shù)呈陽(yáng)性（陽(yáng)性率常＜20%），陽(yáng)性反應(yīng)物呈粗顆粒狀或塊狀巨核細(xì)胞系統(tǒng)巨核細(xì)胞和血小板呈陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)的程度隨細(xì)胞的發(fā)育成熟而增強(qiáng)，成熟巨核細(xì)胞多呈強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)物呈顆粒狀或塊狀其他細(xì)胞漿細(xì)胞一般呈陰性，少數(shù)呈陽(yáng)性，巨噬細(xì)胞可為陽(yáng)性，兩者陽(yáng)性反應(yīng)物均呈細(xì)顆粒狀任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)五、糖原染色（PAS）（過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)）臨床意義：（1）紅系統(tǒng)疾病的鑒別M6、MDS幼紅細(xì)胞PAS可呈陽(yáng)性，積分明顯增高，巨貧、再障、溶貧時(shí)PAS反應(yīng)為陰性。（2）急性白血病的類型鑒別急淋：PAS呈大塊狀陽(yáng)性，也可是陰性；急粒：原始、幼稚細(xì)胞常為陰性；急單：原單核細(xì)胞及幼單核細(xì)胞PAS可呈陽(yáng)性，積分增高，陽(yáng)性顆粒小而多，呈彌散分布。AML-M6幼紅細(xì)胞PAS呈陽(yáng)性MA幼紅細(xì)胞PAS呈陰性任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)五、糖原染色（PAS）（過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)）ALL-L1ALL-L1（PAS+）AML-M5AML-M（PAS+）AML-M6AML-M6（PAS+）AML-M7AML-M（PAS+）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)五、糖原染色（PAS）（過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)）臨床意義：NAP主要存在于中性成熟粒細(xì)胞胞質(zhì)中，故中性成熟粒細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，而其他細(xì)胞基本呈陰性。原理：（偶氮偶聯(lián)法）試劑含萘酚的底物（α-磷酸萘酚鈉）細(xì)胞內(nèi)NAP重氮鹽（堅(jiān)牢藍(lán)RR）pH9.6磷酸鈉α-萘酚生成不溶性黑色沉淀定位于胞質(zhì)相應(yīng)位置1．固定劑：10％甲醛甲醇

2．0.2mol/L丙二醇緩沖液貯備3．0.05mol/L丙二醇緩沖液應(yīng)用液(pH9.75)4．基質(zhì)孵育液(pH9.5～9.6)：α-磷酸萘酚鈉20mg溶于0.05mol/L丙二醇緩沖液20ml，再加堅(jiān)牢紫

醬GBC鹽(或堅(jiān)牢藍(lán)RR)20mg混合后用濾紙過(guò)濾，用前臨時(shí)配制。任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)六、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（NAP）操作：結(jié)果判斷：胞質(zhì)出現(xiàn)紫黑色或棕紅色顆粒為陽(yáng)性固定室溫流水沖洗10-15分鐘5-8分鐘鏡檢：油鏡下各類細(xì)胞觀察100個(gè)，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算陽(yáng)性率及積分新鮮涂片甲醛甲醇流水沖洗基質(zhì)孵育液30秒蘇木素染液復(fù)染

流水沖洗實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞染色0分（-）胞質(zhì)中無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)顆粒1分（+）胞質(zhì)中含少量陽(yáng)性反應(yīng)顆粒或胞質(zhì)呈彌漫淺灰色2分（++）胞質(zhì)中含中等量陽(yáng)性反應(yīng)顆粒或胞質(zhì)呈彌漫灰黑色3分（+++）胞質(zhì)中含較多陽(yáng)性反應(yīng)顆?；虬|(zhì)呈彌漫棕黑色4分（++++）胞質(zhì)中充滿粗大陽(yáng)性反應(yīng)顆粒甚至可遮蓋細(xì)胞核或胞質(zhì)呈彌漫深黑色（─）（─）（+）（+）（++）（++）（++）（+++）（+++）（++++）（++++）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)六、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（NAP）NAP積分計(jì)算：計(jì)數(shù)100個(gè)成熟中性粒細(xì)胞，按其反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)，各級(jí)百分率與其級(jí)數(shù)乘積的總和參考值：陽(yáng)性率＜40％；NAP積分值為30～130分正常人血細(xì)胞堿性磷酸酶除成熟中性粒細(xì)胞（桿狀核及分葉核）可見(jiàn)陽(yáng)性外，其他血細(xì)胞均為陰性。積分記錄

—0分+1分++2分+++3分++++4分例如：NAP反應(yīng)結(jié)果（%）積分：（0）（1）（2）（3）（4）細(xì)胞數(shù)：55102060NAP總積分=（0×5）+（1×5）+（2×10）+（3×20）+（4×60）=325任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)六、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（NAP）臨床意義：（1）生理變化：新生兒NAP增高，成人較兒童減低，老人更低；激烈運(yùn)動(dòng)增高；月經(jīng)期經(jīng)前增高，行經(jīng)后降低，經(jīng)后期恢復(fù)正常；妊娠期2-3月輕度增高，以后逐漸增高，分娩時(shí)達(dá)到高峰，產(chǎn)后恢復(fù)正常。（2）病理變化增高：嚴(yán)重化膿性感染、類白血病反應(yīng)、AA、CML加速期、ALL、CLL、惡性淋巴瘤、癌

轉(zhuǎn)移、MM、真紅、骨髓纖維化等。減低：PNH、CML、惡性組織細(xì)胞病、MDS。（3）疾病鑒別診斷慢粒與類白的鑒別：CML減低，類白增高。急性白血病的鑒別：AML減低，ALL增高。PNH與AA（再障）鑒別：PNH減低，AA增高。病原微生物的鑒別：病毒感染減低，細(xì)菌感染增高。任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)六、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（NAP）臨床意義：粒細(xì)胞型類白反應(yīng)NAP染色（++++）CMLNAP染色（-）化膿性感染NAP染色（++++）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)六、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（NAP）骨髓中的貯存鐵以鐵蛋白和含鐵血黃素的形式貯存，主要存在于骨髓小粒（細(xì)胞外鐵）和幼紅細(xì)胞（細(xì)胞內(nèi)鐵）中。原理：正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細(xì)胞中，骨髓中的鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍(lán)反應(yīng)，形成藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位，從而反映骨髓中鐵的儲(chǔ)存量。4Fe3+＋3K4［Fe（CN）6］Fe4〔Fe（CN）6〕3＋12K+（含鐵物質(zhì)）

（亞鐵氰化鉀）

（亞鐵氰化鐵）酸性任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)七、鐵染色（偶氮偶聯(lián)法）試劑：操作：1．固定液：95％乙醇2．酸性亞鐵氰化鉀溶液（臨用前配制）：5ml200g/L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中，緩緩滴加1ml濃鹽酸，邊滴邊搖勻，至溶液剛出現(xiàn)均勻白色渾濁，再滴加1滴200g/L亞鐵氰化鉀，使白色沉淀消失澄清，過(guò)濾使用。3．2g/L核固紅-硫酸鋁溶液骨小粒豐富骨髓片酸性亞鐵氰化鉀溶液95%乙醇蒸餾水沖洗10分鐘染30min37℃核固紅液3-5min復(fù)染流水沖洗鏡檢任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)七、鐵染色（偶氮偶聯(lián)法）結(jié)果判斷：細(xì)胞外鐵呈藍(lán)色的顆粒狀、小株?duì)罨驁F(tuán)塊狀。以油鏡觀察定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果染色情況-全片無(wú)細(xì)胞外藍(lán)色顆粒+有少量鐵顆粒，或偶見(jiàn)少量鐵小珠，珠粒似嗜酸性顆粒大小++有較多的鐵顆粒和鐵小珠+++有很多的鐵顆粒、小珠和少數(shù)藍(lán)黑色小塊++++有極多的鐵顆粒和小珠，并有很多密集成堆的小塊細(xì)胞外鐵（-）細(xì)胞外鐵（+）細(xì)胞外鐵（++）細(xì)胞外鐵（+++）細(xì)胞外鐵（++++）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)七、鐵染色（偶氮偶聯(lián)法）結(jié)果判斷：細(xì)胞內(nèi)鐵指有核紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色顆粒。以油鏡觀察定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞染色I(xiàn)型幼紅細(xì)胞內(nèi)含鐵顆粒1～2個(gè)Ⅱ型幼紅細(xì)胞內(nèi)含鐵顆粒3～5個(gè)Ⅲ型幼紅細(xì)胞內(nèi)含鐵顆粒6～10個(gè)，或1～4個(gè)大鐵顆粒Ⅳ型幼紅細(xì)胞內(nèi)含鐵顆粒10個(gè)以上，或5個(gè)以上大鐵顆粒鐵染色（細(xì)胞內(nèi)鐵）1.正常鐵粒幼紅細(xì)胞（鐵顆粒1-5個(gè)）2.環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞（鐵顆粒10個(gè)以上，環(huán)細(xì)胞核2/3圈以上）鐵染色（細(xì)胞內(nèi)鐵）1.環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞；2.鐵粒幼紅細(xì)胞任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)七、鐵染色（偶氮偶聯(lián)法）環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞：指含鐵顆粒>6個(gè)，其中2/3以上鐵顆粒圍繞核周排列成完整環(huán)形或不完整環(huán)形參考值：細(xì)胞外鐵：+～++，“+”占2/3，“++”占1/3細(xì)胞內(nèi)鐵：30%~90%，平均60%，多見(jiàn)Ⅰ型，少見(jiàn)Ⅱ型，無(wú)Ⅲ、Ⅳ型。環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞：正?；蚍氰F粒幼細(xì)貧血無(wú)環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞，鐵粒幼紅細(xì)胞貧血中環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞>6%

。環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)七、鐵染色（偶氮偶聯(lián)法）臨床意義：主要用于缺鐵性貧血和環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞增多性貧血的診斷和鑒別診斷。1.缺鐵貧：外鐵明顯下降，甚至消失；內(nèi)鐵下降。經(jīng)鐵劑治療后，外鐵增加。2.AA：內(nèi)、外鐵明顯增加3.鐵粒幼細(xì)胞性貧血：內(nèi)、外鐵增加，且出現(xiàn)環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞占幼紅細(xì)胞的15%以上，有時(shí)還可見(jiàn)鐵粒RBC。4.MDS：外鐵增加，鐵粒幼細(xì)胞百分比增加，出現(xiàn)環(huán)鐵粒幼細(xì)胞5.非缺鐵性貧血：溶血性貧血、巨幼細(xì)胞貧血、再生障礙性貧血、多次輸血后和白血病等，細(xì)胞外鐵和內(nèi)鐵正?；蛟黾印?.感染、肝硬化、慢性腎炎、尿毒癥、血色病等，細(xì)胞外鐵明顯增加，而鐵粒幼紅細(xì)胞可減少任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)七、鐵染色（偶氮偶聯(lián)法）血細(xì)胞化學(xué)染色在鑒別各類急性白血病中的應(yīng)用類型POX*（SBB）特異性酯酶NAS-DCE

非特異性酯酶**α-NBENaFPASACPM1+(-)/+++(-)/++-/+-/++±/+M2+/+++/++++++/++M3++++++/+++/+++/+++/++M4+(-)/+++++/++-/+++/+++/++M5-/+-/+++/+++-/+-/+-/++M6±/++±/+-/+-/+±/+++/++M7-±/+++/+++/++±/+++±/+++ALL--/+-/+-/++(-)/++++(-)/+++注：POX-過(guò)氧化酶；SBB-蘇丹黑；PAS-過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)；ACP-酸性磷酸酶。*POX：ANLL（+）＞3%；ALL（+）＜3%。**非特異性酯酶染色常用底物有α-NAE（α-醋酸萘酚酯酶），α-NBE（α-丁酸萘酚酯酶）任務(wù)二常用細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)八、細(xì)胞化學(xué)染色綜合分析POX≥3%AML＜3%ALLM6NSE