無菌檢查法試驗具體操作方法課件

無菌試驗具體

操作方法實際應(yīng)用及注意事項分類具體檢測方法

討論概述試驗物品準(zhǔn)備無菌操作的要求及注意事項一、概述

無菌檢查法系用于確定要求無菌的生物制品、原料、輔料及要求無菌的其他品種是否無菌的一種辦法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。無菌檢查在生產(chǎn)檢定中是很重要的一個檢項，如果出現(xiàn)差錯會有很大的隱患，近年注冊申報資料中無菌檢查法驗證的內(nèi)容確實在日漸完整和規(guī)范。2005年版《中國藥典》無菌檢查法增加了方法驗證的內(nèi)容，增加了試驗的可操作性，方法更具有科學(xué)性，提高檢出率。保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。二、試驗物品準(zhǔn)備1、培養(yǎng)基數(shù)量及選用：首先要確認(rèn)本次試驗供試品所需培養(yǎng)基的數(shù)量。在此基礎(chǔ)，要多加一套相同的培養(yǎng)基做陰性對照。合格的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2-25℃并防止被污染,使用期限不得超過3周.

無菌試驗對培養(yǎng)基的質(zhì)量要求高，應(yīng)選用完全透明無沉淀的培養(yǎng)基，確認(rèn)檢查合格后放入試管架中，置操作間，方可使用。二、試驗物品準(zhǔn)備在選取培養(yǎng)基時，放于眼前細(xì)致觀察（包括PH值，裝量是否一致、試管有無裂痕）因培養(yǎng)基在搬運過程中，容易造成個別試管膠栓松動，從而影響PH值的細(xì)微變化。如不細(xì)致察看，在試驗中會存有很大的隱患，影響結(jié)果的判定。二、試驗物品準(zhǔn)備：2、滅菌物品的確認(rèn)：高壓根據(jù)試驗要求，準(zhǔn)備所需器材和物品。需在滅菌物品盒標(biāo)注名稱，并填寫滅菌日期，清點無誤后將其送至滅菌前間。滅菌是無菌物品生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，根據(jù)物品的性能選擇合適的滅菌方式，是確保試驗質(zhì)量的關(guān)鍵。我們通常把玻璃器皿包括吸管瓶子選擇180℃2小時干熱滅菌，膠栓121℃60分鐘滅菌，取回滅菌物品時，一定要在有效期內(nèi)使用，試驗前確認(rèn)指示劑是否合格及包裝的完整性，干燥性，合格后方可使用。二、試驗物品準(zhǔn)備：物品擺放整齊的準(zhǔn)備間：二、試驗物品準(zhǔn)備：工作人員在控制高壓溫度：三、無菌操作要求及注意事項環(huán)境操作人員三大要素三、無菌操作要求及注意事項環(huán)境：1.無菌操作應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級和局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。2.工作臺面及操作室環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的進行潔凈度驗證。三、無菌操作要求及注意事項

3.無菌操作室每天都要用0.1%的新潔爾滅或來蘇水清潔劑，清潔―次(抹布要專用).紫外線照射消毒30-50min；超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將供試品和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋紫外線，降低消毒效果。三、無菌操作要求及注意事項

人員：無菌試驗操作進入萬級操作間時，操作人員必須著裝整齊，穿好已滅菌的三更服裝。需帶兩層口罩，一層是白紗布，最后一層隨三更服已滅菌的口罩。方可進入無菌室進行操作。三、無菌操作要求及注意事項

操作三、無菌操作要求及注意事項

在操作中為最大可能的保證無菌。每一項工作都必須做到有條不紊。三、無菌操作要求及注意事項

操作1.在開試驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全，往返拿取而增加污染機會。

三、無菌操作要求及注意事項

三、無菌操作要求及注意事項

三、無菌操作要求及注意事項

四、具體檢測方法檢測方法支原體檢測無菌試驗四、具體檢測方法硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)需氧菌/厭氧菌改良馬丁培養(yǎng)基用于培養(yǎng)真菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)需氧菌無菌試驗培養(yǎng)基

四、具體檢測方法無菌試驗樣品取樣標(biāo)準(zhǔn)：1.原液及半成品：抽檢量應(yīng)至少為0.1%，但不得少于10ml，如原液及半成品除菌過濾后，分別于多個容器內(nèi)，則每個容器抽檢量不得少于10ml，原液及半成品每開瓶一次，應(yīng)如上法抽檢。四、具體檢測方法無菌試驗樣品取樣標(biāo)準(zhǔn)：2.成品：每亞批均應(yīng)進行無菌檢查，供試品應(yīng)隨時抽取，包括分裝過程中的前、中、后抽樣。①分裝量在100支（瓶）或100支（瓶）以下者抽驗量不少于5支。②101-500支（瓶）者抽驗量不少于10支（瓶）。③500支（瓶）以上者抽驗量不少于20支（瓶）。四、具體檢測方法123無菌試驗檢測方法

直接法增菌法薄膜過濾法

四、具體檢測方法增菌法：

含防腐劑的供試品，應(yīng)先增菌培養(yǎng).按種量與培養(yǎng)基的比例：用苯酚或三氯甲烷作防腐劑者至少為1:20，用汞作防腐劑者或制品內(nèi)含有甲醛，抗生素者至少為1:50.將混合供試品先按此比例接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（不得少于200ml）內(nèi)增菌，于20-25℃培養(yǎng)3天后移種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂斜面，改良馬丁培養(yǎng)基各2管，每管10ml，培養(yǎng)基接種0.5ml。四、具體檢測方法直接法:不含防腐劑供試品，不需增菌培養(yǎng).按成品抽樣量及抽驗瓶數(shù)的要求將每批（或亞批）抽檢的供試品逐瓶（支）取樣混合:裝量在5.0ml或5.0ml以下者每10瓶（安裝）混合，裝量在5.0ml以上者，每7瓶（安裝）混合，應(yīng)接種培養(yǎng)基管數(shù)依供試品混合總量而定?；旌虾蟮墓┰嚻方臃N量按不超過培養(yǎng)基體積10%（ml/ml）直接接種于硫乙醇鹽酸流體培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂斜面及改良馬丁培養(yǎng)基，三種培養(yǎng)基接種支數(shù)之比為1：1：1。四、具體檢測方法薄膜過濾法:采用全封閉式薄膜過濾器，薄膜孔徑不大于0.45um，膜直徑約47mm.取規(guī)定抽驗供試品數(shù)，（如供試品少于10ml，則先加入100ml0.9%,無菌氯化鈉溶液或適宜的無菌溶劑），立即在無菌條件下導(dǎo)入無菌薄膜過濾器內(nèi)，加壓或減壓過濾。含汞類等防腐劑的供試品，在供試品過濾后，用0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜的無菌溶劑沖洗濾膜3次，每次100ml，過濾后，兩個濾器中加硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基各100ml，另一個濾器加改良馬丁培養(yǎng)基100ml。四、具體檢測方法增菌法、直接法

薄膜過濾法30-35℃20-25℃30-35℃20-25℃硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基1111營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

11----------------改良馬丁培養(yǎng)基02O2無菌試驗的培養(yǎng)基加入樣品后，全部采取靜止培養(yǎng)，整個培養(yǎng)過程不許搖晃。同時以0.9%的無菌氯化鈉溶液代替供式品,同法操作做陰性對照.培養(yǎng)時間不得少于14天。四、具體檢測方法無菌試驗結(jié)果判定：

對每一試管逐一進行驗證，PH是否有變化有無菌落生長，應(yīng)完全透明無沉淀。1.硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基均為澄清，營養(yǎng)瓊脂斜面未見菌生長，判供式品符合規(guī)定。2.如硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面中任何一管有菌生長，并證明生長的微生物為供試品含有，判定供式品不符合規(guī)定。四、具體檢測方法四、具體檢測方法供試品復(fù)檢無菌試驗如經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法重試，如無菌生長，判供試品符合規(guī)定，如有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。四、具體檢測方法支原體：支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(最小直徑0．2um)并獨立生活的微生物.多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7．6-8．0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。通常，濾過除菌的方法對支原體是沒有作用的。四、具體檢測方法細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個世界性問題。在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達到63%，國內(nèi)外研究表明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時污染兩種以上的支原體。四、具體檢測方法95％以上是以下四種支原體口腔支原體

精氨酸支原體豬鼻支原體萊氏無膽甾原體為牛源性四、具體檢測方法支原體檢測：支原體因病毒類疫苗類中所用的牛血清可能被感染支原體，所以生產(chǎn)所收獲病毒收獲液都要做支原體檢測。

使用培養(yǎng)基為流體和半流體培養(yǎng)基。四、具體檢測方法工作環(huán)境的污染

被污染細(xì)胞造成的交叉污染

操作者本身的污染某些支原體在人體是正常菌群

制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染培養(yǎng)基的污染

實驗器材的污染支原體污染源四、具體檢測方法圖為GHK細(xì)胞當(dāng)支原體污染后，因為它們不會使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺。實則細(xì)胞受到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，抑制細(xì)胞生長等。最為致命的是，即使存在很嚴(yán)重的支原體污染，細(xì)胞外觀可無明顯變化。如果繼續(xù)使用這種已被支原體污染，而貌似正常的細(xì)胞做實驗，將會嚴(yán)重影響實驗結(jié)果。四、具體檢測方法支原體檢測步驟：供試品如在分裝后，24小時以內(nèi)進行支原體檢查可儲存于2-8℃，超過24小時應(yīng)置-20℃以下儲存。支原體半流體培養(yǎng)基使用前煮沸10-15分鐘，冷卻至56℃左右備用。支原體半流體培養(yǎng)基與支原體肉湯培養(yǎng)基加入滅能小牛血清（培養(yǎng)基：血清為8：2）四、具體檢測方法支原體半流體培養(yǎng)基（4支）支原體肉湯培養(yǎng)基（4支）第7天，取2支第7天，取2支一支一支一支一支半流體2支肉湯2支半流體2支肉湯2支半流體2支半流體2支肉湯2支肉湯2支移種前剩余培養(yǎng)基及移種后的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)21天，（36℃±1）。每隔3天觀察一次四、具體檢測方法一旦支原體污染：㈠一律廢棄重新培養(yǎng)。㈡對于具有重要價值的細(xì)胞株，有必要清除支原體的，常用方法有：①抗生素處理②抗血清處理：③抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理四、具體檢測方法四、具體檢測方法預(yù)防支原體感染嚴(yán)格實驗操作控制環(huán)境污染細(xì)胞培養(yǎng)基器材要保證無菌加入適量的抗生素五、討論

污染是細(xì)胞培養(yǎng)中面臨的主要問題。