發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用

1、第八章,發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用,第 一節(jié) 基因工程菌的發(fā)酵,就生產(chǎn)流程而言，從發(fā)酵到分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物，工程菌和常規(guī)微生物并無太多的差異。但工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，以及安全性等問題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點(diǎn)。,（一）工程菌的穩(wěn)定性,1、基因工程菌不穩(wěn)定的表現(xiàn) 生產(chǎn)的目標(biāo)是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成對(duì)宿主細(xì)胞是有損害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的細(xì)胞一般生長(zhǎng)得快得多，從而能替代有生產(chǎn)能力的菌株，這就導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性。 基因的不穩(wěn)定性原因： 質(zhì)粒分離丟失、 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性 表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性（宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)突變）,質(zhì)粒丟失,

2、當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)一個(gè)子細(xì)胞沒有接受質(zhì)粒就出現(xiàn)分離丟失。質(zhì)粒可分為高拷貝質(zhì)粒（20拷貝/細(xì)胞）和低拷貝質(zhì)粒（有時(shí)低到每個(gè)細(xì)胞一至二個(gè)拷貝）。低拷貝質(zhì)粒有專門的機(jī)制保證在子代細(xì)胞中有相等的分配，高拷貝質(zhì)粒通常很少遵循二分法分配到子代細(xì)胞。對(duì)于高拷貝質(zhì)粒，幾乎所有子細(xì)胞接受一些質(zhì)粒，也有可能有的細(xì)胞沒有接受質(zhì)粒，當(dāng)然形成無質(zhì)粒細(xì)胞的可能性是低的（每百萬細(xì)胞分裂中一個(gè)）。,但在大的反應(yīng)器中含有非常多的細(xì)胞，總會(huì)存在無質(zhì)粒細(xì)胞，例如1000l發(fā)酵液，每毫升有109個(gè)細(xì)胞，總共就有1015個(gè)細(xì)胞，那么在這個(gè)反應(yīng)器中就含有109個(gè)無質(zhì)粒細(xì)胞。 質(zhì)粒的分離丟失可能受許多環(huán)境因素影響，如溶氧、溫度、培養(yǎng)基組成和恒化

3、器中的稀釋速率。許多質(zhì)粒也會(huì)形成多聚體，它是相同質(zhì)粒附著在一起形成一個(gè)單位。,質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性,除了分離不穩(wěn)定性問題外，某些細(xì)胞保留質(zhì)粒，但質(zhì)粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而不產(chǎn)生外源蛋白，減少對(duì)細(xì)胞的有害影響，這就是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。如果質(zhì)粒發(fā)生突變，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么這些突變株仍能在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。而且由于不合成外源蛋白，生長(zhǎng)得比原來的工程菌更快，使得在這種培養(yǎng)物中帶有改變了的質(zhì)粒占統(tǒng)治地位的菌，這種培養(yǎng)情況就是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。,表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性,宿主細(xì)胞的突變也會(huì)造成生產(chǎn)能力的減少。這些突變通常改變細(xì)胞調(diào)節(jié)，結(jié)果減少目標(biāo)蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子，利用

4、宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子，如果宿主細(xì)胞啟動(dòng)子的改變，將大大改變質(zhì)粒編碼蛋白的生產(chǎn)水平。乳糖操縱子是常用是操縱子，通過加入乳糖或它的結(jié)構(gòu)類似物（如iptg）來啟動(dòng)表達(dá)，如果乳糖操縱子編碼半乳糖苷透酶的基因發(fā)生突變就會(huì)阻止乳糖或乳糖的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)入細(xì)胞，從而不能啟動(dòng)細(xì)胞的表達(dá)。,2、培養(yǎng)條件對(duì)工程菌穩(wěn)定性的影響, 對(duì)于一個(gè)已經(jīng)組建完成的工程菌來說，選擇最適的培養(yǎng)條件是進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵 步驟。, 在眾多的環(huán)境因素中，培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)溫度、菌體的比生長(zhǎng)速率3個(gè)方面尤其重要。, 環(huán)境因素對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，許多尚屬未知。,1）培養(yǎng)基的組成,2）菌體比生長(zhǎng)速率, 比生長(zhǎng)速率對(duì)重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

5、結(jié)果不盡一致，并可能與克隆菌本身和培養(yǎng)條件有關(guān)。 例如: 在酵母系統(tǒng)中，大則質(zhì)粒pjdb248穩(wěn)定性高。, 如果不含重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞不比含有重組質(zhì)粒的工程菌生長(zhǎng)快，則重組質(zhì)粒的丟失也不會(huì)導(dǎo)致非常嚴(yán)重的后果；調(diào)整這兩種菌的比生長(zhǎng)速率可以提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 但很難達(dá)到,3）培養(yǎng)溫度,通常，低溫往往有利于重組質(zhì)粒穩(wěn)定地遺傳。,4） ph和溶解氧,ph對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長(zhǎng)和代謝情況，對(duì)ph進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié) 溶解氧是工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中影響菌體代謝的一個(gè)重要參數(shù)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成影響很大。 外源基因的高效表達(dá)和翻譯需要維持較高水平的do2值。

6、通常采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法，可以改善培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。,4、控制基因過量表達(dá),提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的目的是為了提高克隆菌的發(fā)酵生產(chǎn)率，但外源基因表達(dá)水平越高，重組質(zhì)粒往往越不穩(wěn)定。,可采用兩階段培養(yǎng)法，即在發(fā)酵前期控制外源基因不過量表達(dá)，使重組質(zhì)粒穩(wěn)定地遺傳；到后期通過提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)或轉(zhuǎn)錄、翻譯效率使外源基因高效表達(dá)。,1）可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子, 在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，可使用可誘導(dǎo)性的啟動(dòng)子，如：lac、 trp、 pl等, 在用含有這些啟動(dòng)子的克隆菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，可以選擇培養(yǎng)條件使啟動(dòng)子受阻遏（抑制）到一定時(shí)期；然后去阻遏（誘導(dǎo)）使質(zhì)粒高效表達(dá)。,例如： 利用3-吲哚乙酸可使trp啟動(dòng)子

7、去阻遏,2）溫度敏感型質(zhì)粒,一些溫度敏感型質(zhì)粒在溫度較低時(shí)質(zhì)粒拷貝數(shù)較少，當(dāng)溫度升高到一定值時(shí)質(zhì)粒大量擴(kuò)增 脫韁質(zhì)粒 （runaway plasmid）, 如：pkn410在30時(shí)的拷貝數(shù)為2050/e.coli細(xì)胞；在35時(shí)質(zhì)粒大量復(fù)制。, 將-內(nèi)酰氨酶基因接在其上，經(jīng)熱誘導(dǎo)后，酶活可擴(kuò)增400倍。,5、施加選擇壓力,從遺傳學(xué)來說，選擇意味著利用某些生長(zhǎng)條件使得只有那些具有一定遺傳特性的細(xì)胞才能夠生長(zhǎng)。,1）抗生素添加法,通常在重組質(zhì)粒上含有抗藥性基因,ampr,ampr,tcr, 將含有抗藥性基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不耐藥的宿主細(xì)胞后，克隆菌也獲得了抗藥性。, 在克隆菌發(fā)酵時(shí)，于培養(yǎng)基中加入適量

8、的相應(yīng)抗生素，就可阻止丟失了重組質(zhì)粒的非生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)。,但這種方法在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)并不可取, 因?yàn)椋?成本增加 對(duì)于一些易被酶水解失活的抗生素來說，添加抗生素造成的選擇壓力只能維持一定的時(shí)間 添加抗生素對(duì)結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定無能為力 抗生素的存在可能會(huì)影響目的產(chǎn)物的合成給產(chǎn)物的提取帶來困難,2）抗生素依賴變異法, 通過誘變使宿主細(xì)胞成為某抗生素的依賴型變異株即只有在該抗生素存在時(shí)宿主細(xì)胞才能生長(zhǎng)。, 因此在進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，不需要向培養(yǎng)基中加入抗生素就能達(dá)到消除重組質(zhì)粒分配不穩(wěn)定性 的目的。, 而重組質(zhì)粒上含該抗生素的非依賴性基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。,3

9、）營(yíng)養(yǎng)缺陷型法, 通過誘變使宿主細(xì)胞染色體缺失生長(zhǎng)所必需的某一基因，而將該基因插入到重組質(zhì)粒中。, 然后選擇適當(dāng)組成的培養(yǎng)基使失去重組質(zhì)粒的細(xì)胞不能存活，而只有含重組質(zhì)粒的細(xì)胞才能生長(zhǎng)。,例如： 構(gòu)建 帶有色氨酸操縱子的重組質(zhì)粒pbr322-trp，并在該質(zhì)粒上插入serb基因；而宿主細(xì)胞是serb缺陷型；這樣質(zhì)粒與宿主形成互補(bǔ)，在培養(yǎng)過程中丟失質(zhì)粒的細(xì)胞因不能合成ser而被淘汰.,（二）、工程菌發(fā)酵工藝,不同發(fā)酵條件下工程菌發(fā)酵結(jié)果 通氣量 攪拌轉(zhuǎn)速 do ph od600 誘導(dǎo)時(shí)間 菌體濕重 蛋白量 1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8% 2 2 250 2.6 7

10、.8 0.77 4 2.08 16.7% 3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2% 4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4% 5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9% *鯉魚生長(zhǎng)激素基因工程菌,1、培養(yǎng)基 培養(yǎng)基給重組菌提供必需的營(yíng)養(yǎng)和適宜的環(huán)境，對(duì)重組菌的生長(zhǎng)、質(zhì)粒的穩(wěn)定及產(chǎn)物的表達(dá)有極其重要的影響，同時(shí)還要考慮到目的產(chǎn)物的提取和純化工藝。 人畜的蛋白質(zhì)發(fā)酵 營(yíng)養(yǎng)豐富容易質(zhì)粒丟失,2、溶氧濃度對(duì)工程菌發(fā)酵的影響,在鯉魚生長(zhǎng)激素基因工程菌的發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng) 發(fā)酵液的溶氧為1.82.6ppm/l時(shí)，菌體濕重為1.92.

11、08g/l外源基因表達(dá)量為13.8%16.7%，而當(dāng)溶氧值提高到4.0ppm/l時(shí)菌體濕重為2.27g/l外源基因表達(dá)量為26.4%。在誘導(dǎo)表達(dá)期間，要維持外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄和翻譯，細(xì)胞需要大量的能量代謝以促進(jìn)呼吸作用。因此通過增大通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速以保證較大的溶氧值，不僅提高工程菌的生長(zhǎng)而且有利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。,3、比生長(zhǎng)速率 基因工程菌在培養(yǎng)過程中的比生長(zhǎng)速率與重組產(chǎn)物的表達(dá)速率存在一定的關(guān)系，過高或過低的比生長(zhǎng)速率均不利,4、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響,誘導(dǎo)時(shí)間：加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時(shí)間 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，外源蛋白的表達(dá)量增加，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，對(duì)重組菌產(chǎn)生毒性，合成

12、速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。,誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶表達(dá)水平和活力的影響 誘導(dǎo)時(shí)間 酶活力 酶表達(dá)水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *l-天冬酰氨酶,5、代謝副產(chǎn)物的影響 當(dāng)葡萄糖加入量超過菌體生長(zhǎng)和二氧化碳產(chǎn)生所需要量或在缺氧的條件下便會(huì)產(chǎn)生大量的乙酸，特別是在培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的高密度發(fā)酵過程中，問題更為嚴(yán)重。 乙酸的產(chǎn)生與細(xì)胞中的電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)有關(guān)。han認(rèn)為細(xì)菌在低比生長(zhǎng)速率下通過氧化代謝的作用產(chǎn)生的能量足以滿足合成和異化的需求，不會(huì)產(chǎn)生乙酸，而在髙比生長(zhǎng)速率時(shí)，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足

13、夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲(chǔ)備atp和nadh。,(三)、安全問題,關(guān)于基因工程的社會(huì)問題，必須提到它的潛在危險(xiǎn)性。經(jīng)過重組的菌和質(zhì)粒一旦用于工業(yè)化生產(chǎn)，就不可避免地進(jìn)入自然界。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環(huán)境等。因此，安全問題是極其重要的。,1974年，提出了dna重組實(shí)驗(yàn)具有潛在生物危險(xiǎn)性的問題。后來，制定了有關(guān)dna重組實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)則，其目的是保證實(shí)驗(yàn)的安全和推動(dòng)重組dna的研究。 這些準(zhǔn)則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)安全度的評(píng)定，采用物理密封(p1p4)和生物學(xué)密封(b1和b2)兩種方法。,物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實(shí)驗(yàn)人員和

14、向外界擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)規(guī)模在20l以下時(shí)，物理密封由密封設(shè)施、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)組成。密封程度分為p1、p2、p3和p4級(jí)，數(shù)字越大，密封水平越高。 生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時(shí)用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴(kuò)散。按密封程度分b1和b2級(jí)，b2級(jí)的密封要求最嚴(yán)格。,第二節(jié) 動(dòng)、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)是指動(dòng)植物細(xì)胞在體外條件下的存活或生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞不再形成組織。,一、細(xì)胞融合技術(shù),細(xì)胞融合技術(shù)（cell fusion technology)，是指兩個(gè)或更多個(gè)親本細(xì)胞經(jīng)酶法出去細(xì)胞壁得到兩個(gè)球狀原生質(zhì)球，通過生物

15、法、化學(xué)法或物理法等誘導(dǎo)融合形成單個(gè)細(xì)胞，獲得新的重組子的過程。,理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這 對(duì)于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。 融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間 的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。 體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分 裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體dna亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新 的核外遺傳系統(tǒng)。 淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。,幾種細(xì)胞融合成功的例子,細(xì)胞的融合過程,植物細(xì)胞融合過程,人造小鼠培育過程示意圖,（一）原生質(zhì)體的制備,影響原生質(zhì)體制備的因素： 1、親本的選擇及預(yù)

16、處理 微生物細(xì)胞取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，培養(yǎng)基中加入細(xì)胞壁合成抑制劑，可以增加菌體對(duì)脫壁酶的敏感性 植物細(xì)胞一般選擇活躍生長(zhǎng)器官和組織細(xì)胞，由此制得的原生質(zhì)體生活力較強(qiáng)，再生分化比例較高。常用的外植體包括：種子根、子葉、下胚軸、胚細(xì)胞、花粉母細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和嫩葉,2、除壁酶的選擇 細(xì)菌放線菌用溶菌酶處理 酵母菌用蝸牛酶處理 霉菌用幾丁質(zhì)酶和纖維素酶配合 植物細(xì)胞一般用混合酶,3、酶濃度 酶濃度增加，原生質(zhì)體的形成率也增大，酶濃度過低不利于原生質(zhì)體形成，酶濃度過高則導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率的降低 4、酶解溫度 2040 5、酶解時(shí)間 酶解時(shí)間過長(zhǎng)，原生質(zhì)體再生率降低 6、滲透壓穩(wěn)定性 原生質(zhì)體對(duì)溶液和培養(yǎng)基

17、的滲透壓很敏感，必須在高滲透壓或等滲透壓下才能維持,（二）原生質(zhì)體融合,融合是把兩個(gè)親本原生質(zhì)體混合在一起，通過誘導(dǎo)融合作用使原生質(zhì)體發(fā)生融合。 1、生物學(xué)法 主要用于動(dòng)物細(xì)胞融合 該法由于病毒的致病性和寄生性，制備比較困難，誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞融合率比較低，重復(fù)性不高，近年 不多用,用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過程示意圖,優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。 應(yīng)用最廣泛的化學(xué)融合劑聚乙二醇(peg) 聚乙二醇(peg)結(jié)構(gòu)為：hoh2c（ch20ch2）nch2oh，分子量大于 200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。 通常用分子量低于1000的peg作融合劑最好，50peg溶液能產(chǎn)生 最多雜交細(xì)胞。 peg溶液在ph6.0時(shí)細(xì)胞融合率最高。,2、化學(xué)融合法,聚乙二醇（peg）法細(xì)胞融合過程,3、物理法,常用的物理法為電擊法，當(dāng)細(xì)胞處于電場(chǎng)中，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。 電融合法的優(yōu)點(diǎn)： 融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害小； 裝置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程； 免去peg誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。,電融合的基本過程： 細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低