MTT原理方法及操作步驟

1、MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法和注意事項MTT原理MTT全部為3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5- di-phennytetrazoliumromide，中文化學(xué)名稱3-(4是黃色染料。MTT比色法是檢測細(xì)胞生存和生長的方法。其檢測原理是，活細(xì)胞線粒體中的丁二酸脫氫酶可以將外源MTT還原為水不溶性的青紫結(jié)晶甲(Formazan)，使細(xì)胞沉積，而死細(xì)胞則不然。二甲基亞砜(DMSO)可以溶解細(xì)胞內(nèi)的金屬，用酶聯(lián)免疫吸附分析儀間接反映活細(xì)胞數(shù)，以測定490nm波長下的光吸收值。在特定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)MTT結(jié)晶形成的數(shù)量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法廣泛用于部分生物活性因子

2、的活性檢測、大規(guī)?？拱┧幬锖Y選、細(xì)胞毒性測試、腫瘤輻射敏感性測定等。以高靈敏度、經(jīng)濟(jì)性為特點。缺點：由于MTT還原生成的a產(chǎn)品不溶于水，所以溶解后才能檢測到。這不僅會增加工作量，還會影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，溶解甲的有機(jī)溶劑也會對實驗者造成危害。MTT溶液配制方法通常，該方法的MTT濃度為5mg/ml。因此，取0.5克MTT，在100毫升磷酸緩沖液(PBS)或沒有酚紅的培養(yǎng)基中使用0.22m濾膜去除溶液中的細(xì)菌，保存4 的紅光即可。在制造和保存過程中，容器最好用鋁箔包裝。做實驗的時候，我通常認(rèn)為最好關(guān)掉超順臺的熒光燈來避光。要注意，MTT方法只能用于檢測細(xì)胞數(shù)量和相對活性，但不能測量細(xì)胞絕對數(shù)量。

3、用Zymogram測試結(jié)果時，為了確保實驗結(jié)果的線性性，MTT吸光度最好在0-0.7范圍內(nèi)。MTT通常最好是在活動狀態(tài)下發(fā)貨。4C被光在2周內(nèi)保管或制成5mg/ml，長期保存在-20度，為了避免重復(fù)的凍融，避免小容量化妝，用光包或黑紙或箔紙包在被光上，進(jìn)行分解。我一般在EP管上裝入MTT粉，使用時配合，直接加到培養(yǎng)板上，不必一次配合那么多。特別是MTT變成灰綠色后，絕對不能再使用了。MTT有致癌性，使用時要小心，有條件地戴上那個透明的副膜手套比較好。配制的MTT需要無菌，MTT對細(xì)菌很敏感。即使去96鴨子版，也最好不要發(fā)光。時間短或不能放心的時候，關(guān)掉操作臺燈也可以。MTT溶解為PBS(ph=

4、7.4)。PBS公式：NaCl 8g KCl 0.2g na 2 hpo 4 1.44g kh2po 4 0.24g pH 7.4，固定容量1L。一般MTT方法實驗階段：1:接種細(xì)胞：以10%胎兒小牛血清培養(yǎng)液為單細(xì)胞懸浮液，每孔1000-10000個細(xì)胞接種96孔，每孔200ul。23360培養(yǎng)細(xì)胞：和一般培養(yǎng)條件一樣，培養(yǎng)3-5天(培養(yǎng)時間可以根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定)。3:著色：培養(yǎng)3-5天后，每個孔使用MTT溶液(5mg/ml用PBS制造，pH=7.4)20ul。繼續(xù)孵化4 h，結(jié)束培養(yǎng)，小心吸入孔內(nèi)的上清液，懸浮細(xì)胞需要離心后吸出孔內(nèi)的上清液。在每個孔中加入150ul DMSO，振動1

5、0分鐘，使晶體充分熔化。4:比色：選擇490nm波長，測量酶聯(lián)免疫吸附分析儀的共光吸收值，并記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。藥物MTT法實驗階段附著細(xì)胞：1:收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮液的濃度，在每個孔中添加100ul，使要測量的細(xì)胞密度達(dá)到1000- 10000孔(邊緣孔填充無菌PBS)。在233035% CO2，37 孵化，直到細(xì)胞層復(fù)蓋孔底(96孔平底)，添加濃度梯度的藥物原則上是細(xì)胞貼在墻上，可以使用約2小時，或半天，但我們經(jīng)常在前一天下午鋪板，第二天早晨放藥。通常，5-7個拔模為每個孔100ul制造3-5個開口。建議設(shè)置5個。否則很難反映實際情況3: 5

6、%CO2，37 孵化16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。每4:孔添加20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。如果藥物和MTT能反應(yīng)，離心后放棄培養(yǎng)液，在添加包含MTT的培養(yǎng)液之前用PBS沖洗2-3次之前注意。結(jié)束5:培養(yǎng)，小心地吸出孔培養(yǎng)液。在6:每個孔中加入150ul二甲基亞砜，搖晃，低速振動10分鐘，使晶體充分熔化。每個孔的吸光值是從enzyme-linked immunosorbent detector od 490nm測量的。7:還設(shè)置零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，并設(shè)置對照組孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。懸浮細(xì)胞：1:

7、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮濃度1106/ml，補(bǔ)充式1640(無血清)培養(yǎng)基40ul放線菌素D(毒性)10ul用培養(yǎng)液稀釋(儲液100mg/ml，需要事先測試才能找到最佳稀釋度，1333610-1:12)；需要檢查10ul；細(xì)胞懸浮50ul(即5104cell/孔)，總計100ul添加到96孔板(邊緣孔填充無菌水)。每個板的控制組(添加100ml 1640)23360在37，5%CO2孵化16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。每個3:孔添加10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。(懸浮細(xì)胞推薦WST-1，培養(yǎng)4 h后可以跳過步驟4)，直接酶聯(lián)免疫吸附分析器OD

8、570nm(630nm校準(zhǔn))測量每個孔的吸光度值)4、離心(1000轉(zhuǎn)x10min)，小心地吮吸，在每個孔中放入100 ul二甲基亞砜，在搖床中低速振動10分鐘，使晶體完全溶解。每個孔的吸光值在酶聯(lián)免疫吸附分析儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))中測量。5、同時調(diào)整零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)、比較孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)、每組3個復(fù)合孔。注意事項：(1)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。(2)防止血清干擾：一般選擇低于燃燒血清10%的培養(yǎng)液進(jìn)行實驗。著色后，盡可能吸出孔內(nèi)殘留的培養(yǎng)液。(3)設(shè)置空白對照組：空白對照組，與只添加培養(yǎng)液(無細(xì)胞)的實驗并行。其他測

9、試階段是一致的，最終的非顏色用空色調(diào)調(diào)整0。(4) MTT實驗吸光度最終在0-0.7之間，超出此范圍則不是直線關(guān)系。(5)要利用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞測定MTT細(xì)胞活性，必須在將DMSO添加到本書所述的200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO之前去除培養(yǎng)液，使DMSO能夠溶解a Zan粒子，進(jìn)行非比尋常的測定(6)一般每個孔有4000個細(xì)胞為宜，共2000個/ml，MTT 20ul的濃度，4小時后沖洗上等液，注意不要沖洗甲流病，然后在每個孔中放入150ul DMSO，在脫色的搖床中振動10分鐘后測定吸收值。旋轉(zhuǎn)MTT法原理、步驟和注意事項MTT原理MTT全部為3-(4，5)-dimet

10、hylthiahiazo (-z-y1)-3，5- di-phennytetrazoliumromide，中文化學(xué)名稱3-(4是黃色染料。MTT比色法是檢測細(xì)胞生存和生長的方法。其檢測原理是，活細(xì)胞線粒體中的丁二酸脫氫酶可以將外源MTT還原為水不溶性的青紫結(jié)晶甲(Formazan)，使細(xì)胞沉積，而死細(xì)胞則不然。二甲基亞砜(DMSO)溶解細(xì)胞內(nèi)的金屬，在490nm波長(目前用作570nm的570nm波長)使用酶聯(lián)免疫吸附分析儀間接反映活性細(xì)胞數(shù)。在特定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)MTT結(jié)晶形成的數(shù)量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法廣泛用于部分生物活性因子的活性檢測、大規(guī)?？拱┧幬锖Y選、細(xì)胞毒性測試、腫瘤輻射敏感性測定等。

11、以高靈敏度、經(jīng)濟(jì)性為特點。缺點：由于MTT還原生成的a產(chǎn)品不溶于水，所以溶解后才能檢測到。這不僅會增加工作量，還會影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，溶解甲的有機(jī)溶劑也會對實驗者造成危害。MTT溶液配制方法通常，該方法的MTT濃度為5mg/ml。因此，取0.5克MTT，在100毫升磷酸緩沖液(PBS)或沒有酚紅的培養(yǎng)基中使用0.22m濾膜去除溶液中的細(xì)菌，保存4 的紅光即可。在制造和保存過程中，容器最好用鋁箔包裝。做實驗的時候，我通常認(rèn)為最好關(guān)掉超順臺的熒光燈來避光。要注意，MTT方法只能用于檢測細(xì)胞數(shù)量和相對活性，但不能測量細(xì)胞絕對數(shù)量。用Zymogram測試結(jié)果時，為了確保實驗結(jié)果的線性性，MTT吸光度

12、最好在0-0.7范圍內(nèi)。MTT一般最好過濾4的光照射保存2周，有效使用，或制作為5mg/ml，長期保存-20度，避免重復(fù)凍融，使用低容量化妝，用菲光袋或黑紙和箔進(jìn)行感光包裝，防止分解。我一般在EP管上裝入MTT粉，使用時配合，直接加到培養(yǎng)板上，不必一次配合那么多。特別是MTT變成灰綠色后，絕對不能再使用了。我自己的工作一般是15毫升準(zhǔn)備，過濾后4菲光保存，2周內(nèi)就會耗盡。MTT有致癌性，使用時要小心，有條件地戴上那個透明的副膜手套比較好。配制的MTT需要無菌，MTT對細(xì)菌很敏感。即使去96鴨子版，也最好不要發(fā)光。時間短或不能放心的時候，關(guān)掉操作臺燈也可以。MTT溶解為PBS(ph=7.4)。P

13、BS公式：NaCl 8g KCl 0.2g na 2 hpo 4 1.44g kh2po 4 0.24g pH 7.4，固定容量1L。一般MTT方法實驗階段：1:接種細(xì)胞：將含10%胎兒犢牛的血清培養(yǎng)液和1個細(xì)胞懸浮液結(jié)合，每個孔1000-10000個微量細(xì)胞被接種在每個孔200ul的孔板上。23360培養(yǎng)細(xì)胞：和一般培養(yǎng)條件一樣，培養(yǎng)3-5天(培養(yǎng)時間可以根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定)。3:著色：培養(yǎng)3-5天后，每個孔使用MTT溶液(5mg/ml用PBS制造，pH=7.4)20ul。繼續(xù)培養(yǎng)4個小時。終止培養(yǎng)，小心地吸出孔內(nèi)的上等液，懸浮細(xì)胞的情況是離心后，要吸出肺孔內(nèi)的上等液。在每個孔中加入15

14、0ul DMSO，使搖晃振動脫色，使晶體充分熔化10分鐘。4:比色：選擇490nm(570nm)波長，在酶聯(lián)免疫吸附分析程序中測量每個共光吸收值，并記錄結(jié)果(以小時為單位)橫坐標(biāo)、吸光度值是縱坐標(biāo)繪圖細(xì)胞生長曲線。藥物MTT法實驗階段附著細(xì)胞： (我的主要工作是附著細(xì)胞)1:收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮液的濃度，每個孔加100ul，鋪上將被測量細(xì)胞密度調(diào)整為1000的板子-10000孔(角孔填充無菌PBS)。在233035% CO2，37 孵化，細(xì)胞附著，濃度梯度添加藥物，原則上細(xì)胞附著在墻上，可以使用約2小時，或半天，但我們經(jīng)常在前一天下午鋪板，第二天早晨放藥。通常制作5-7個漸變，每個孔1

15、00ul，3-5個復(fù)雜的孔。最好設(shè)置5個。否則很難對實際情況做出反應(yīng)。3: 5%CO2，37 孵化24-72小時，倒置顯微鏡下觀察。每4:孔添加20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。如果藥物和MTT能反應(yīng)，離心后，可以廢棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗2-3次，加入含有MTT的培養(yǎng)液。結(jié)束5:培養(yǎng)，小心地吸出孔培養(yǎng)液。在6:每個孔中加入150ul二甲基亞砜，搖晃，低速振動10分鐘，使晶體充分熔化。酶聯(lián)免疫吸附法在傳染病檢測器OD490nm(570nm)中測量每個孔的吸光值。7:還設(shè)置空組(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)、對照組孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶出介質(zhì))質(zhì)量，培養(yǎng)液，M

16、TT，二甲基亞砜)。懸浮細(xì)胞：1:收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮濃度1106/ml，補(bǔ)充式1640(無血清)培養(yǎng)基40ul放線菌素D(毒性)10ul用培養(yǎng)液稀釋(儲液100mg/ml，需要事先測試才能找到最佳稀釋度，1333610-1:12)；需要檢查10ul；細(xì)胞懸浮50ul(即5104cell/孔)，總計100ul添加到96孔板(邊緣孔填充無菌水)。每個主機(jī)板組控制(附加100ml 1640)。23360在37，5%CO2孵化16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。每個3:孔添加10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。(懸浮細(xì)胞推薦WST-1，培養(yǎng)4 h后可以跳

17、過步驟4)，直接酶聯(lián)免疫吸附分析器OD570nm(630nm校準(zhǔn))測量每個孔的吸光度值)4、離心(1000轉(zhuǎn)x10min)，小心地吮吸，將100 ul二甲基亞砜放入每個孔，在搖床中低速振動10分鐘，使晶體完全溶解。每個孔的吸光值在酶聯(lián)免疫吸附分析儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))中測量。5、同時調(diào)整零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)、比較孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)、每組3個復(fù)合孔。注意事項：(1)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。每個孔有1000-10000個，但是還要查看細(xì)胞種類和狀態(tài)。我的工作是通過大約2000到8000個孔抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。如果2000過低，8000過高，則陰性組中高于5000的吸收率大于1.5。所以我的A549實驗通常使用3000-5000。通常每個孔4000個細(xì)胞是合適的(2)防止血清干擾：一般選擇低于燃燒血清10%的培養(yǎng)液進(jìn)行實驗。著色后，盡可能吸出孔內(nèi)殘留的培養(yǎng)液。(3)設(shè)置空白對照組：空白對照組，與只添加培養(yǎng)液(無細(xì)胞)的實驗并行。其他測試階段是一致的，最終的非顏色用空色調(diào)調(diào)整0。(4) MTT實驗吸光度最終在0-0.7之間，超出此范