動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(全面)

1、實(shí)驗(yàn)篇實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)器材的清洗實(shí)驗(yàn)物品 （一）每一大組公用物品（每班分6大組）吸球4個(gè)、酒精棉球瓶兩個(gè)、消毒水一瓶、吸瓶兩個(gè)、計(jì)數(shù)板1塊、洗液缸一個(gè)、95%酒精1瓶。（二）每一小組公用物品（兩人一小組）刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1個(gè)、 80-200銅濾網(wǎng)1塊、培養(yǎng)皿2個(gè)、 l00毫升鹽水瓶 及塞子4個(gè)、l0毫升鹽水瓶 及塞子1個(gè)、100ml培養(yǎng)瓶及塞子4個(gè)、10ml培養(yǎng)瓶及塞子1個(gè)、鑷子1個(gè)、剪刀1把、凍存管（1.5毫升，2毫升）2個(gè)、軟毛刷2個(gè)、塑料盆一個(gè)。（二）公用物品小濾器、大濾器2個(gè)、1000毫升量筒2個(gè)、100毫升量筒2個(gè)、家用剪刀、耐酸乳膠手套長的兩雙、短的四雙 、酒精一壺、玻璃棒

2、幾個(gè)、 0.22m的小濾膜一盒、電爐3個(gè)。清洗注意事項(xiàng)和要求（一）使用后的實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)立即投入清水中。帶毒的玻璃器皿需先浸泡在5來蘇兒或1鹽酸溶液中（依病毒的種類而定）1天以上或高壓滅菌。 （二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液體，不得有氣泡。 （三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑（直徑35厘米的鋁鍋，用洗衣粉10克左右）；若洗滌劑和實(shí)驗(yàn)器材同時(shí)從冷水煮至沸騰或使用過量洗劑均易腐蝕玻璃表面，使玻璃堿化PH值上升。 （四）軟毛刷的刷端已掉毛的應(yīng)該棄去，否則會(huì)損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑,會(huì)改變培養(yǎng)液PH和毒害細(xì)胞。 （五）浸泡器材的蒸餾水容器要專用，并做好標(biāo)記，如“蒸餾水1盆”

3、、”蒸餾水2盆。（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作時(shí)，手指不可接觸器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套進(jìn)行操作，這樣省時(shí)又保證清洗質(zhì)量。（七）清潔物品應(yīng)及時(shí)包裝消毒，應(yīng)注意妥善保存，防止落人灰塵、蟑螂、螞蟻等引起二次污染。（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗；不得殘留洗滌劑、清潔液。操作方法（一）清洗液（俗稱酸液）的配制方法常用清潔液配方重鉻酸鉀100g，濃硫酸200ml，蒸餾水800ml。 以配置10000ml常用清潔液為例介紹如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸餾水8000ml，稱取1000g重鉻酸鉀，用玻璃棒攪拌直至溶解（可加熱以輔助溶解），待重鉻酸鉀液冷卻后，緩慢加入濃硫酸，邊加邊

4、用玻璃棒攪動(dòng)，以混合液溫度不過快上升和不出現(xiàn)重鉻酸鉀結(jié)晶為度。配好后倒入洗液缸中備用。新配制的清潔液呈棕紅色。當(dāng)使用時(shí)間過久，清潔液的顏色變暗、發(fā)綠或混濁時(shí)，應(yīng)棄去（深埋地下），配制新的。配制、盛裝清潔液的容器應(yīng)防酸、耐熱、有較大的開口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。（二）物品的清洗1、新購置物品玻璃器皿清洗步驟清水浸泡半小時(shí)以上簡單刷洗5%的稀鹽酸浸泡過夜自來水沖洗在洗滌劑中反復(fù)刷洗自來水中充分沖洗涼干（或50烤干）浸入清潔液中（俗稱浸酸）過夜流水振蕩沖洗20遍漓水去離子水沖洗34次或浸泡2次（每次24小時(shí)）三蒸水沖洗兩次（或浸泡一次）50烤干，待包裝。2、用過的玻璃器皿清洗步驟帶毒玻

5、璃器材用后應(yīng)立即浸入消毒水中，非帶毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡刷洗自來水沖洗涼干（50烤干）浸入清潔液中（俗稱浸酸）過夜流水振蕩沖洗20遍漓水去離子水沖洗34次或浸泡2次（每次24小時(shí)）三蒸水沖洗兩次（或浸泡一次）50烤干，待包裝。3、橡皮帽和橡皮塞的清洗新購置的橡膠制品（大小膠塞、橡皮膠頭）的洗滌方法如下； 2%NaOH煮沸15分鐘流水沖洗25%稀HCl煮沸15分鐘流水沖洗去離子水煮沸20分鐘（或去離子水浸泡過夜）去離子水沖洗一次三蒸水煮沸20分鐘三蒸水沖洗一次50烤干備用4、塑料制品（塑料培養(yǎng)板、針頭式加壓塑料小濾器）的清洗用后立即用流水沖洗浸于自來水中過夜用紗布或棉簽刷洗流水沖洗晾干浸于

6、清潔液中15分鐘流水沖洗20遍去離子水浸洗三次雙蒸水中浸泡24小時(shí)晾干備用。注射器薄膜濾器刷洗前先將上、下兩部分分開，按上述方法清洗晾干后將纖維薄膜濾片夾在中間（光面向下）擰緊上下兩部分，備用。5、不銹鋼除菌濾器的清洗先用洗滌劑刷洗濾器流水沖洗15分鐘去離子水沖洗23次（去離子水浸泡24小時(shí)）三蒸水沖洗23次或浸泡24小時(shí)干燥備用。6、鑷子、剪刀紗布擦去臟污自來水洗凈酒精棉球擦試。7、金屬濾網(wǎng)自來水沖洗蒸餾水沖洗三蒸水沖洗。實(shí)驗(yàn)二 實(shí)驗(yàn)器材的包裝和消毒實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)一中清洗的所有物品、脫脂棉一卷/班、紗布一卷/班、高壓鍋一個(gè)/班、無菌操作臺(tái)一臺(tái)/組、牛皮紙1張/組，紙繩一卷/組、塞脫脂棉用的針頭

7、或牙簽、記號(hào)筆一個(gè)/組。實(shí)驗(yàn)方法（一）包裝1、包裝時(shí)手指與器材接觸面積要小，手指不能觸及器材的使用端。2、瓶類：需用局部包扎，用牛皮紙包扎。隨后單個(gè)或幾個(gè)一起用紙包好。 3、玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端、抽濾瓶下口端等）加脫脂棉，吸管、滴管，隨后置玻璃吸管筒或銅制、鋁制吸管筒內(nèi)（內(nèi)放紗布），塞上棉塞或蓋上有孔蓋子（內(nèi)外孔對(duì)好），外包上兩層牛皮紙，若沒有吸管筒應(yīng)每根吸管單獨(dú)包扎。4、帶蓋的瓶子或塑料離心管等物品應(yīng)擰松蓋子，包裝消毒后再擰緊。6、為防止已消毒品和未消毒品發(fā)生混淆，應(yīng)在包裝盒或包裝紙的表面注以符號(hào)或?qū)懮献帧啊?“”。（二）器皿的消毒 干熱消毒主要用于玻璃器皿的消毒。160、l20

8、分鐘，消毒后不要立即打開箱門，以防止冷空氣驟然進(jìn)入引起玻璃炸裂，影響消毒效果。 濕熱消毒即高壓蒸汽消毒：布類、膠塞、金屬器械、玻璃器皿以及某些培養(yǎng)用液等都可用此方法消毒滅菌。消毒時(shí)間是從壓力達(dá)到15磅，溫度達(dá)到121時(shí)算起。一般蒸氣消毒30分鐘。橡皮手套和儲(chǔ)在小瓶內(nèi)的溶液都不應(yīng)超過15分鐘。消毒后，調(diào)節(jié)活塞使壓力在7分鐘左右均勻地下降到零。這樣能使任何可能存在的液體得以與周圍蒸氣以相同的速度散熱，而不至于激烈的沸騰。各種物品有效消毒壓力和時(shí)間不同，一般要求如下： 培養(yǎng)用液、橡膠制品 l0磅l0分鐘 布類、玻璃制品、金屬器械等 15磅20分鐘實(shí)驗(yàn)三 培養(yǎng)用液的配置實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)器材：1000ml的

9、量筒2個(gè)，1000ml的燒杯2個(gè)，磁力攪拌器一臺(tái)，玻璃棒兩個(gè)，感量0.1mg的分析天平,100ml的鹽水瓶若干,化學(xué)試劑:NaCl,KCl, KH2PO4 ,Na2HPO4.12H2O 2.85g 或Na2HPO4.2H2O, NaHCO3, 小?；蛱ヅＱ?胰蛋白酶,醋酸。實(shí)驗(yàn)要求及方法（一）PBS液實(shí)驗(yàn)室常用含0.85%,pH7.2的PBS(簡稱pH7.2的PBS)1. PBS貯存液配法NaCl(AR) 8.5g； KCl(AR) 0.2g； KH2PO4 0.27g；Na2HPO4.12H2O 2.85g (或Na2HPO4.2H2O 1.13g) 溶于100ml雙蒸水中。2. PBS應(yīng)

10、用液配法取貯存液50ml加雙蒸水450ml即成,經(jīng)103kPa(121.3)15分鐘滅菌,置室溫或4保存?zhèn)溆谩?配制BSS液的要求 （l）BSS液中各試劑規(guī)格為一級(jí)GR試劑（guaranteed reagent）或二級(jí)AR（analytic reagent）試劑. （2）配制后液體呈桃紅色，pH 7.4左右沒有混濁和沉淀。 （3）含鈣鎂離子的物質(zhì)要單獨(dú)溶解. （4）可配制10倍濃度的貯存液，濾過消毒，分裝，每瓶10毫升；冰箱保存。使用時(shí)每瓶加三蒸水至 l00毫升。 （5）配制離散細(xì)胞用的消化液和細(xì)胞洗滌液時(shí)，宜采用無鈣、離子的DHanks液，或PBS液。 （二） 血清滅活處理的方法:1.選用與

11、血清瓶同規(guī)格的對(duì)照瓶一個(gè)。2.對(duì)照瓶內(nèi)放入與血清等體積的水。3.溫度預(yù)試：使水浴鍋溫度保待在56。放入內(nèi)45支溫度計(jì)，選擇23支溫度計(jì)， 4.血清滅活：血清瓶與帶溫度計(jì)的對(duì)照瓶一齊放入水浴箱中，待溫度計(jì)所示溫度上升至56時(shí)定時(shí)30分鐘。5.大瓶血清滅活后進(jìn)行分裝。6.分裝后，抽樣做無菌試驗(yàn)，2070保存。（三）配制合成培養(yǎng)基（液）注意事項(xiàng)。1用三天內(nèi)制備的玻璃三蒸水配制培養(yǎng)液2按二周用量配制為宜，配量過多，存放時(shí)間過長會(huì)造成培養(yǎng)基老化、變質(zhì)、產(chǎn)生沉淀。3培養(yǎng)液中各成分是否完全溶解的判斷方法：將培養(yǎng)液置室溫或4冰箱30分鐘后，觀察瓶底有無顆粒產(chǎn)生。4根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，在培養(yǎng)液中加入適量37單獨(dú)溶解的

12、NaHCO3溶液。正常體細(xì)胞培養(yǎng)液中NaHCO3量為2022克升，腫瘤細(xì)胞為1.51.7克升。5干粉培養(yǎng)基不易溶于水，實(shí)驗(yàn)室采用空氣CO2助溶法即將甲液在磁場(chǎng)上攪拌一段時(shí)間，當(dāng)甲液pH值下降到5.8左右時(shí)（橙黃色）氨基酸和維生素基本溶解,在甲液內(nèi)再加入溶解有NaHCO3的乙液，兩液混和后，營養(yǎng)液pH值為7.07.1，抽濾后pH值上升0.1。此法操作簡便，營養(yǎng)液pH值穩(wěn)定。（四）胰蛋白酶液 胰蛋自酶是一種黃白色粉末，水解蛋白質(zhì)時(shí)作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶的活力是用解離酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和1:250兩種,即

13、1份胰蛋白酶能解離125份或250份酪蛋白。不同的細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶液的濃度、作用溫度和作用時(shí)間等要求也不一樣。一般來說，濃度越大、溫度越高、作用時(shí)間越長，對(duì)細(xì)胞的分離能力也越大，但超過一定限度就會(huì)損傷細(xì)胞。常用的胰蛋白酶液的濃度是0.25利0.125，作用溫度37或室溫，pH7.4左右。Ca2+ Mg2+和血清的存在都會(huì)降低其活力O.25胰蛋白酶液的配制方法如下。l.過濾消毒法。 按實(shí)驗(yàn)需要稱取酶粉，用少量D-Hanks液或PBS液將胰蛋白酶粉調(diào)成糊狀。 加適量D-Hanks液或PBS液(橙紅色)，磁力攪拌溶解溶解后的酶液（深紅色）濾過除菌，分裝，-20凍存。2.高熱消毒法。利用胰蛋白酶在酸性條

14、件下有較好的熱穩(wěn)定性對(duì)其進(jìn)行高熱消毒。、按實(shí)驗(yàn)需要稱取酶粉溶于1毫摩爾升pH3.0的HCl中。、酶液和2倍DHanks液同時(shí)在0.1兆帕，120條件下滅菌20分鐘。、兩液冷卻至室溫時(shí)，等量混勻。酶液濃度高時(shí)，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，兩液等體積混勻。然后用10摩爾升的NaOH調(diào)消化液PH值至7.2（橙紅色或深紅色）、經(jīng)計(jì)算，消毒后酶濃度下降50。如消毒前酶濃度為0.1%0.5，消毒后為0.05O.25。高熱消毒法比過濾消毒法更加簡便、安全、可靠。（五）PH調(diào)整液1、 NaHCO3溶液常用的濃度有7.4、5.6、3.7三種，配制時(shí)37三蒸水溶解后通過濾膜過濾除菌，分裝于安瓶中4冰箱保存，每

15、支一次用完。使用時(shí)，NaHCO3液要逐滴加入，并不時(shí)攪動(dòng)培養(yǎng)液。以防pH值過高。2、 10醋酸液 高壓滅菌,分裝， 4冰箱保存。使用方法和要求同NaHCO3液。（六）200毫摩爾升L-谷氨酰胺 L谷氨酰胺2.9222克（M=146.15），加適量50三蒸水溶解定容至l00毫升，濾過除菌，1毫升安瓶，一20保存使用時(shí)每 l00毫升培養(yǎng)基中加 1毫升谷氨酰胺。（七）抗菌素液加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌和霉菌的生長，而不影響細(xì)胞的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。青霉素、鏈霉素液又稱雙抗溶液。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。（八）細(xì)胞用液的分裝要求 l.使用嚴(yán)格無菌操作

16、。盡量減少試劑在空氣中的暴露時(shí)間。 2.根據(jù)配量準(zhǔn)備分裝瓶和瓶塞，分裝瓶規(guī)格、數(shù)量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備。避免因包裝瓶過大、貯液時(shí)間過長或反復(fù)凍融使用造成營養(yǎng)成分丟失和微生物污染。按一次用量或一周內(nèi)用量挑選小包裝瓶。融化后的液體置4保存。 3.分裝前做好分裝量標(biāo)記，分裝瓶內(nèi)液體量要小于瓶容積的23。4.做好分裝瓶標(biāo)記，包括試劑名稱、濃度、配制日期、組號(hào)。采用邊過濾邊分裝的方法。瓶口的液體用干酒精棉球擦去，火焰消毒，加塞包裝。實(shí)驗(yàn)四 組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作要領(lǐng)和注意事項(xiàng)（一）原代細(xì)胞培養(yǎng)操作要領(lǐng) 1、原代細(xì)胞混勻操作要領(lǐng) 火焰消毒吸管，用Hanks液冷卻和濕潤管內(nèi)壁（這是因?yàn)閯偡蛛x的組織細(xì)胞易粘

17、在管壁上）。 吸管頭插入管底。 用吸管反復(fù)輕輕吹打組織塊。 2、器械的使用操作要領(lǐng) 用工作臺(tái)消毒鑷子取浸泡在酒精中消毒的器械。 器械置無菌干紗布內(nèi)擦一下，迅速通過火焰，冷卻后使用。 用過的器械置另一加蓋的器皿中再消毒。 器械按浸泡消毒的順序使用. 各套再消毒器械不可混用。 3、除去組織塊多余水分的操作要領(lǐng) 用吸管將組織塊推向器皿一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向?qū)?cè)的多余水分。 注意：多余水分若不除去，會(huì)使組織塊剪切不細(xì)。消化后的細(xì)胞懸液清亮（細(xì)胞數(shù)少），并可見消化液中有線狀或絮狀物漂浮。 4、細(xì)胞計(jì)數(shù)操作要領(lǐng) 用吸管混勻待計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液。 將一小滴細(xì)胞懸液從蓋玻片與載玻片交界部位滴

18、入細(xì)胞計(jì)數(shù)池中。 沉降1分鐘，低倍鏡下計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板四大中格中的結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞，小細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)為l。 計(jì)數(shù)時(shí)，如果細(xì)胞壓在格上，則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。然后按下式計(jì)算出每毫升懸液中的細(xì)胞數(shù)。 （四大中格細(xì)胞數(shù)4）10000=細(xì)胞數(shù)毫升 注：細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，每中格體積為0.1立方毫米。（二）原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)1、嚴(yán)格進(jìn)行動(dòng)物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動(dòng)物皮膚先用2碘酒液消毒，成年鼠先用35碘酒液消毒，后再用75酒精消毒。 2、嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。3、 吸取液體前，瓶口和吸管口應(yīng)行火焰消毒；吸取液體時(shí)，避免兩者碰撞。 4、離心管入臺(tái)前，管口、管壁應(yīng)

19、消毒。 5、實(shí)驗(yàn)者離開超凈臺(tái)時(shí)，要隨即用肘部關(guān)閉工作窗。 6、使用過的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個(gè)器皿中繼續(xù)消毒，在浸泡器械時(shí)剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。 7、器材使用時(shí)既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用PBS液冷卻。超凈臺(tái)內(nèi)溫度、濕度較大，在夏天工作時(shí)臺(tái)內(nèi)散熱更慢。因此進(jìn)行細(xì)胞懸液混勻、接種時(shí)，離火焰要稍遠(yuǎn)些。實(shí)驗(yàn)方法一、雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 通常應(yīng)用胚胎或幼小動(dòng)物的組織來制備細(xì)胞培養(yǎng)，因?yàn)樗鼈兎至淹?，容易生長。各種動(dòng)物的大多數(shù)組織細(xì)胞都能在體外培養(yǎng)。應(yīng)用最多的為腎、肺、皮膚等，雞胚組織應(yīng)用最為普遍。 （一）雞胚的處理 1 取10

20、11日齡的雞胚，在氣室部用5碘酒消毒，用酒精脫碘。2 用滅菌鑷子擊破和除去該部卵殼和卵膜。3 以眼科彎頭鑷子撕破絨尿膜和羊膜，鉤住雞胚頭部，提出移于平皿內(nèi)。4 去頭、腳、翅和內(nèi)臟。用Hanks液或PBS液洗去血液，重復(fù)三次。5 用外科剪剪成12mm3大小的碎塊。加Hanks液約20m1混勻，稍靜置使組織塊下沉。用滅菌吸管將混有紅細(xì)胞及碎片的懸液充分吸去。依同法再洗23次，至Hanks液不渾濁為止。也可將雞胚投入20m1注射器(不帶針頭)內(nèi)擠出，以替代剪碎。（二）蛋白酶消化 1 將025胰蛋白酶溶液(pH78)于37水浴中預(yù)熱2 棄去Hanks液。3 按組織塊的35倍，將預(yù)熱好的025胰蛋白酶溶

21、液加于裝有雞胚的玻璃容器中。每個(gè)雞胚約需胰蛋白酶液l0ml。4 將玻璃容器放在37水浴中，每隔5min輕輕搖勻一次。5 如發(fā)現(xiàn)組織塊變得散松，沉降漸變緩慢時(shí)即表示消化足夠，約需l 520min6 將玻璃容器取出水浴，靜置12min，吸去胰蛋白酶液，加含犢牛血清的Hanks液約20m1，輕輕搖勻后吸去，如此重復(fù)一次，目的是洗去殘余的胰蛋白酶和抑制其消化作用。7 加入生長液，按每個(gè)雞胚10m1左右，以粗口吸管吹吸數(shù)次，使細(xì)胞脫落分散。8 靜置12min，使組織塊下沉，細(xì)心地輕輕吸出細(xì)胞懸液，另置一25m1玻璃容器中。如此反復(fù)數(shù)次，將各次收獲的細(xì)胞懸液合并一起.9 用滅菌紗布過濾一次，除去偶爾吸入的

22、組織塊。必須注意的是，每次吹吸次數(shù)不宜過多，一般56次即可，太多細(xì)胞容易受損。（三）細(xì)胞計(jì)數(shù) 可借染色法區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞，并計(jì)算每毫升細(xì)胞個(gè)數(shù)。 1配制臺(tái)盼藍(lán)溶液 取02g臺(tái)盼藍(lán)，溶于100m1磷酸平衡鹽水中貯存，臨用前再稀釋10倍。這是一種活體染液，完整的活細(xì)胞不被染色，而細(xì)胞膜受損后才染成藍(lán)色。 也可用001結(jié)晶紫液(用0.lmo1L檸檬酸配制)染色，這時(shí)細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色，但只能計(jì)數(shù)而無法區(qū)分死活。) 2取搖勻的細(xì)胞懸液1滴加于玻片上，加染液4滴，混勻后靜置45min。3吸取細(xì)胞懸液少許，滴到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)算四角4個(gè)大格內(nèi)完整的細(xì)胞數(shù)，如幾個(gè)細(xì)胞聚集一起，則按一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。然后將活

23、細(xì)胞總數(shù)換算成每m1中細(xì)胞數(shù)，最后還要乘以5，因?yàn)榧?xì)胞已被染液稀釋5倍。 活細(xì)胞數(shù)ml（4大格活細(xì)胞總數(shù)4）l0 000 5（四）稀釋和分裝 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，以生長液配成每m1含2040萬細(xì)胞的懸液，分裝細(xì)胞培養(yǎng)瓶。微量細(xì)胞培養(yǎng)板每孔(0.3cm2)0.1m1；轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)每100ml容量加10m1細(xì)胞懸液。必須注意，瓶口務(wù)必塞緊，不能漏氣，否則在培養(yǎng)過程中C02不斷逸出而使?fàn)I養(yǎng)液迅速變堿，而且容易被細(xì)菌污染。（五）生長液和維持液的配方 雞胚細(xì)胞較易生長，常用者有下列兩種。105乳蛋白水解物 95 犢牛血清 5 青霉素 100IUm1 鏈霉素 100Ugm1 此為生長液的配方，如為維持液可將血

24、清量減至12即可。 2Eagle氏MEM 95 犢牛血清 5 青霉素 100IUm1 鏈霉素 100Ugm1此為生長液的配方，如為維持液可將血清量減至12即可。細(xì)胞懸液分裝后置37溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，幾小時(shí)后細(xì)胞即可貼附于瓶壁，2448h長成單層，此時(shí)即可供接種病毒之用。如發(fā)現(xiàn)液體渾濁(有細(xì)菌或酵母生長)或有菌絲體 (有霉菌生長)，應(yīng)立即棄去。 如為微量細(xì)胞培養(yǎng)，可用滌綸膠布將板面密封，置C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。如為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，可將培養(yǎng)瓶放置在轉(zhuǎn)鼓上，以612rh的速度在37培養(yǎng)。二、兔腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)（一）實(shí)驗(yàn)材料：1. 兔嬰(出生48小時(shí)內(nèi)尚未進(jìn)食兔嬰，體重300500g)。2.培養(yǎng)基與試劑：含10%

25、FBS(或CS)的MEM、CMF-Hanks液、025胰酶/CMF-PBS。3.器具：各種吸管、離心管、80100目尼龍網(wǎng)或不銹鋼篩網(wǎng)、三角燒瓶、培養(yǎng)皿、瓶，手術(shù)刀、剪、鑷，1%新潔爾滅消毒缸、解剖板等。（二）實(shí)驗(yàn)方法1.取腎：取2日齡內(nèi)兔嬰，將其斷頸處死后，放入1%新潔爾滅溶液中浸泡lOmin。取出兔嬰，放置瓷盤內(nèi)的木板上，背部向上，四腳釘住固定。用碘酒，酒精消毒背部皮膚，用剪刀和鑷子將背部皮膚剪開剝?nèi)?。另換剪刀，在腰部背脊長肌兩側(cè)剪開腹腔如蠶豆大的缺口，即可看到腎。用尖頭鑷子夾緊腎蒂，剪斷血管及結(jié)締組織等，將腎提出放在平皿內(nèi)。2.組織處理及消化：剪下腎皮質(zhì)部分，移入小三角燒瓶內(nèi)，用小剪細(xì)剪

26、成1mm3左右的組織塊，用PBS或Hanks液洗3次，吸棄上清液，視其沉下的組織塊量，約加10倍量的0.25%胰酶，于37水浴中消化30min。以下步驟及方法與雞胚細(xì)胞制備相同，不贅述。3胰蛋白酶消化 分熱消化和冷消化兩種。熱消化與雞胚成纖維細(xì)胞相同，但時(shí)間必須延長到2530min。如欲獲得更多的細(xì)胞，可在消化瓶內(nèi)預(yù)放幾十粒玻珠，消化后轉(zhuǎn)動(dòng)消化瓶使細(xì)胞脫落。在吸出的胰酶細(xì)胞懸液中加入犢牛血清2m1以終止酶的作用。 剩下的組織塊另加胰蛋白酶液繼續(xù)消化20min，重復(fù)上述步驟12次，即可將組織幾乎消化殆盡。 許多實(shí)驗(yàn)室喜用冷消化，即在組織塊內(nèi)加入7一10倍量的胰蛋白酶液，在4冰箱內(nèi)消化過夜，翌日晨

27、取出，按熱消化法處理。 4、細(xì)胞計(jì)數(shù) 同雞胚成纖維細(xì)胞。5、生長液和維持液的配方 1）05乳蛋白水解物 45 Eagle氏MEM 45 犢牛血清 10 青霉素 100 IUm1 鏈霉素 100 Ugm1 此為生長液的配方，如為維持液可將血清量減至35。 2）Eagle氏MEM 90 犢牛血清 10 青霉素 100 IUm1 镕霉素 100 Ugm1 此為生長液的配方，如為維持液可將血清量減至35。 6、細(xì)胞懸液的稀釋和分裝 與雞胚成纖維細(xì)胞同，細(xì)胞濃度為50萬m1。在37培養(yǎng)45日可以長成單層。三、雞胚心肌塊的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品1.孵育911日齡雞胚一個(gè)2.培養(yǎng)液：MEM+20%小牛血清（CS），C

28、S，無鈣鎂Hanks液（CMF-Hanks）或pH=7.2的PBS。3器具：各種吸管、彎頭吸管，60mm培養(yǎng)平皿或25cm2 培養(yǎng)瓶，90mm玻璃平皿一個(gè)，60mm玻璃平皿3個(gè)，鑷子、眼科剪、吸管架，雞卵架等。實(shí)驗(yàn)方法1.雞胚摘出：取911日齡雞胚于卵架上，用碘酒、酒精消毒雞胚氣室側(cè)，用鑷子敲開氣室部，剪開氣室部蛋殼，用鑷子摘除卵殼膜，輕輕夾住雞胚頸部取出雞胚于無菌90mm平皿內(nèi)，注意不要強(qiáng)拉雞胚頸部。2.制備心肌塊：用鑷子固定雞胚，從腹部向胸部切開，用鑷子摘除心臟，移入裝有10mlCMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的60ml的平皿內(nèi)，用刀將心房和血管等切除，心室放CMF-Hanks液

29、或pH=7.2的PBS的平皿中充分洗滌，然后將心室移入另一裝有CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的平皿內(nèi),用刀將心室切成適當(dāng)大小(12mm3)小塊,于CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS液中洗滌數(shù)次,轉(zhuǎn)入裝有少量生長液的平皿中暫存。3.培養(yǎng)與觀察：將組織小塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi)，每只體積為25ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)可放置2030塊組織輕輕地傾斜擺動(dòng)培養(yǎng)瓶，使組織小塊均勻地分布于生長細(xì)胞瓶內(nèi)壁表面上。把瓶蓋蓋上，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置18-24小時(shí)，添加少量培養(yǎng)液。待外植塊均巳粘附玻壁上后，約經(jīng)過2天后，在每只培養(yǎng)瓶內(nèi)添加足量培養(yǎng)液。培養(yǎng)至35天后，于相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)及節(jié)律性收縮現(xiàn)

30、象。實(shí)驗(yàn)五 傳代細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)材料1蛋白酶消化液：主要是用無Ca2+、Mg2+的平衡鹽溶液或者PBS配制的0.08%0.25%(m/V，下同)胰蛋白酶溶液，其中也可以再補(bǔ)加0.02%的EDTA(或1 mmolL)。有時(shí)候還需要0.02%0.03%或200IU/ml的膠原酶溶液甚或其它的消化液。2培養(yǎng)器皿：一般與進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)所用類型相同。所需數(shù)量須根據(jù)擬傳代的規(guī)模而定。3培養(yǎng)液及平衡鹽溶液：同原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方法（一）貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法1取需要傳代的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶數(shù)次，懸浮起浮著在細(xì)胞表面的碎片，然后連同生長液一起倒出，用無鈣鎂的磷酸平衡鹽溶液洗滌2次。2從無細(xì)胞面加入0250.1

31、%胰蛋白酶液或002EDTA液（或兩者等量混合）45ml，將該培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使消化液浸沒細(xì)胞層。3在37放置815min。中途取出，用肉眼或低倍顯微鏡觀察。如單層邊緣略有卷邊，或低倍下細(xì)胞間已有縫隙，細(xì)胞層出現(xiàn)布紋孔，即表明消化適度。（如果細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形，應(yīng)立即終止消化。）4.將培養(yǎng)瓶倒置，使細(xì)胞不再接觸酶液，繼續(xù)在37放置幾分鐘。5.取出，傾去酶液越徹底越好，加入生長液后用吸管吸吹數(shù)次，使細(xì)胞分散。6.裝入離心管，離心(1000rmin，5min)。除去上清含酶溶液。7.用培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮。計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。8每瓶細(xì)胞單層可擴(kuò)大分裝24瓶。937靜置

32、培養(yǎng)12天又可長成單層（二）懸浮細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞可直接將培養(yǎng)物吸取一部分或者將培養(yǎng)物離心后再分成幾部分并接種培養(yǎng)即可。1、將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心(1000r/min，5min)。2、吸出上清液。給細(xì)胞沉淀加入培養(yǎng)液重新懸浮。3、分別取部分細(xì)胞懸液，接種在數(shù)個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)。4、補(bǔ)加培養(yǎng)液。入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。若為直接分部傳代，僅需停止攪拌或搖動(dòng)，待細(xì)胞自然下沉。吸去大部分上清培養(yǎng)液，再用吸管吹勻培養(yǎng)物成細(xì)胞懸液。分別吸取部分細(xì)胞懸液接種在數(shù)個(gè)培養(yǎng)器皿內(nèi)。補(bǔ)加培養(yǎng)液。入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)六 病毒的接種實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)試劑：青霉素，鏈霉素，Hanks液，細(xì)胞維持液。實(shí)驗(yàn)儀器：離心機(jī)，水

33、浴鍋，吸管，顯微鏡，培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)材料：病料，長滿單層的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法首先要選擇對(duì)特定病毒易感的細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長成單層后即可接種病毒或待檢病料。一般按下列步驟進(jìn)行。1將病料制備成1：10勻漿，離心沉淀，取上清，每m1加青霉素1000IU和鏈霉素1000Ug,室溫放置1一2min。如病料為糞便，則抗生素量要增加10倍。2.棄去細(xì)胞培養(yǎng)生長液，用預(yù)熱至37的Hanks液(pH7.274)洗一次，以除去細(xì)胞碎片等。3滴加病料上清，接種量約為生長液的110，原則是使細(xì)胞單層都能接觸病料為度。在37放置122h，使病毒吸附于細(xì)胞膜。在此期間可以轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶23次，以防部分細(xì)胞末接觸接種物。4棄去接種液

34、，用pH72Hanks液將細(xì)胞單層洗23次，以除去接種液內(nèi)可能存在的對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)，糞便等特別要注意。如果接種液就是細(xì)胞培養(yǎng)傳代病毒，則可省略此步驟。5按生長液量換加維持液，在37培養(yǎng)。6逐日在低倍顯微鏡下檢查CPE，或進(jìn)行其他試驗(yàn)。接種病毒后第2天如發(fā)現(xiàn)維持液渾濁，則表明有細(xì)菌污染，應(yīng)該棄去。真菌污染常在較后幾天才能發(fā)現(xiàn)。上述為大多數(shù)病毒的常規(guī)接種方法。有些如細(xì)小病毒需要在分裂旺盛的細(xì)胞中才能生長，這時(shí)病毒接種應(yīng)在細(xì)胞貼壁后不久進(jìn)行，甚至在細(xì)胞分裝時(shí)接種。還有一些細(xì)胞結(jié)合性病毒如馬立克氏病毒等，接種的病料必須是完整的感染細(xì)胞而非上清液，接種后細(xì)胞單層不能用Hanks液將感染細(xì)胞洗去。實(shí)驗(yàn)七

35、 空斑形成技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理病毒的空斑猶如噬菌體的噬斑，故空斑和噬斑(又稱蝕斑)含義相同。動(dòng)物病毒的空斑形成試驗(yàn)。先制備成致密無孔的細(xì)胞單層；再感染適當(dāng)量的病毒；爾后加瓊脂復(fù)蓋和染色，加瓊脂復(fù)蓋的用意有二：其一是將每個(gè)病毒體都限制在它原來吸附和進(jìn)入的地方；其二，以襯托出空斑形成的地點(diǎn)。因每個(gè)病毒體只能在它吸附和進(jìn)入的地方繁殖，故1個(gè)病毒體只形成一個(gè)空斑。換言之，1個(gè)空斑亦相當(dāng)于1個(gè)病毒體。操作方法 1在細(xì)胞培養(yǎng)瓶或平皿中使細(xì)胞長成密集的單層，不能有空隙(細(xì)胞接種濃度不低于1l 06m1)。 2吸去生長波，用維持液將細(xì)胞單層洗一次。 3病毒檢樣用Hanks液(pH7274)作連續(xù)10倍稀釋。要能檢出孤

36、立可數(shù)的空斑，病毒濃度最好在100500TCID50m1，稀釋時(shí)要注意。每一濃度接種2個(gè)培養(yǎng)瓶。接種劑量隨容器大小而異。直徑6cm的平皿接種量約02ml，以此類推。 4將培養(yǎng)瓶在37培養(yǎng)60min，使病毒吸附于細(xì)胞，每15min將培養(yǎng)瓶輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使接種液分布均勻。 5將培養(yǎng)瓶放在水平的桌面上。 6加入融化后冷卻到4244的瓊脂覆益層，厚度約3mm。覆蓋層的組成如下： 225高級(jí)瓊脂(或瓊脂糖) 40ml； 2倍濃縮營養(yǎng)液 50m1； 犢牛血清 5m1； 1：1000中性紅溶液 5m1；青霉素 100IUml； 鏈霉素 100Ugm1。 先將瓊脂用雙蒸水配成225濃度，經(jīng)12l高壓蒸汽滅菌15m

37、in。使用前在100水浴中融化，然后使水浴冷卻到44。這時(shí)將其余成分放在水浴中預(yù)熱15min。把它們加入瓊脂中，輕輕混勻，不能產(chǎn)生氣泡。這時(shí)加入7NaHCO3使pH調(diào)到7274。 7瓊脂凝固后將瓶(平皿)翻轉(zhuǎn)，在37培養(yǎng)。如果是培養(yǎng)瓶，只需將瓶塞塞緊即可；如果是平皿，應(yīng)將其放在C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以保持適宜的CO2濃度和濕度。8培養(yǎng)34天后計(jì)算空斑數(shù)?？瞻叱实咨?，背景呈談紅色。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1瓊脂的質(zhì)量是空斑形成的關(guān)鍵，必須選用高級(jí)瓊脂或瓊脂糖。 2瓊脂加入前溫度切忌太高，以免影響細(xì)胞活力。在44水浴中加入NaHCO3后保留時(shí)間不能超過20 min，否則C02逃逸太多而使?fàn)I養(yǎng)液變堿。 3只要

38、細(xì)胞不衰老，培養(yǎng)時(shí)間盡量長些，使空斑充分發(fā)育。 4中性紅常對(duì)細(xì)胞有毒性，有人建議在瓊脂層中不加。在培養(yǎng)23天后再加第二覆蓋層(用雙蒸水配制1瓊脂，內(nèi)含001中性紅)。此層的厚度約1mm即可。更為簡單的辦法是在檢查空斑前瓶內(nèi)加入滅菌的001中性紅溶液，在37放置2h，傾去后觀察。 也可用其他染料代替中性紅，如臺(tái)盼藍(lán)，前者只染活細(xì)胞，后者只染死細(xì)胞。 5中性紅是光敏活體染料，感染細(xì)胞如在可見光下培養(yǎng)即不能產(chǎn)生正常的空斑。觀察時(shí)光線不宜太強(qiáng)，時(shí)間不宜過長。中性紅溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，或在暗處短期保存。實(shí)驗(yàn)八 細(xì)胞的保存細(xì)胞的凍存方法1實(shí)驗(yàn)用品對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞(證明無支原體污染)；0.25%胰蛋白酶；BSS

39、 培養(yǎng)液；DMSO(優(yōu)質(zhì)無色)；吸管；離心管；細(xì)胞凍存管(2m1)；酒精燈 ；標(biāo)記小牌和線繩；紗布小口袋(三層)。2實(shí)驗(yàn)程序(1)細(xì)胞：選對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞；收集細(xì)胞24小時(shí)前換液一次；(2)計(jì)數(shù)：按常規(guī)法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、令細(xì)胞密度達(dá)5106/m1(如一瓶細(xì)胞數(shù)量不足則用兩瓶或更多的細(xì)胞)，離心去上清； (3)凍存液：先用培養(yǎng)液9份DMSO 1份(或甘油)配成10%的DMSO凍存液；按上法一滴滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸；(4)分裝：分裝入無菌細(xì)胞凍存管中，每管加1.5毫升細(xì)胞懸液；(5)封口：用塑料凍存管時(shí)擰緊瓶口即可；如用火焰封閉安瓿口后，仔細(xì)檢查，定要封嚴(yán)，必要時(shí)需

40、進(jìn)行檢驗(yàn)。為安全起見，把安瓿縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時(shí)因受熱發(fā)生爆炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明細(xì)胞名稱，凍存日期，以便日后查找。 (6)凍存：當(dāng)前已有專用細(xì)胞凍存器，在無凍存器的情況下，可用手工辦法：把凍存物先放置0 30min，-20 冰箱中放置2小時(shí)，液氮上層過夜后直接投入液氮罐。檢驗(yàn)方法：將安瓿浸入預(yù)冷的005美藍(lán)溶液中，在4放置30min。這樣一方面可使冷凍保護(hù)劑(二甲基亞硯)與細(xì)胞之間平衡，另一方面檢查安瓿封口是否嚴(yán)密。如發(fā)現(xiàn)美藍(lán)液進(jìn)入安瓿，即證明封口滲漏。這是極其危險(xiǎn)的務(wù)必毫無保留地將其棄去或重封。因?yàn)榱粲形⒖椎陌碴吃谝旱拗幸旱獣?huì)滲入，以后取出時(shí)液氮會(huì)

41、迅速氣化而導(dǎo)致安瓿爆炸。細(xì)胞復(fù)蘇的方法1實(shí)驗(yàn)用品75%酒精 ；培養(yǎng)液；BSS；離心管；搪瓷罐或鋁鍋(帶蓋)。2.實(shí)驗(yàn)程序(1) 從液氮罐中取出凍存管(2)迅速放入盛有3637水的搪瓷罐或鋁鍋中，扣上蓋并不時(shí)搖動(dòng)，盡快解凍，(3)剪開紗布口袋，取出安瓿，用70%酒精擦試消毒后，凈化臺(tái)上打開蓋(如為玻璃安瓿則折斷安瓿頸部)；用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入離心管中，再補(bǔ)加10ml培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸??；(4)低速離心(5001000轉(zhuǎn)/分)5分鐘，取上清后再重復(fù)用培養(yǎng)液漂洗、離心。(5)加入培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，再移入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。 注意：安瓿內(nèi)凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，在融

42、解后能允許做1:10倍或1:20倍的稀釋(細(xì)胞數(shù)/毫升)，一般每瓶細(xì)胞接種濃度為5105/ml，因此凍存密度應(yīng)達(dá)到107/m1，在稀釋20倍時(shí)，仍能保持5105/m1數(shù)量。實(shí)驗(yàn)九 小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備實(shí)驗(yàn)原理骨髓細(xì)胞具有豐富的細(xì)胞質(zhì)和高度的分裂活性，因些細(xì)胞中有著較多的分裂相。在試驗(yàn)中需加以秋水仙素或秋水仙酰胺，使分裂細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期，再經(jīng)離心、低滲處理及固定、滴片步驟，便可制作較好的骨髓細(xì)胞的染色體標(biāo)本。此法不需無菌操作，設(shè)備簡單，所用時(shí)間較短。實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)試劑：秋水仙素350g/ml 10g 0.25ml,20g 0.5ml， 0.85NaCl溶液, 50%酒精溶液；0.07

43、5molL KCl,37; 固定液：甲醇:冰醋酸=3:1。共用物品：離心機(jī)，顯微鏡，Giemsa染色液。每組所需物品：注射器 1毫升2個(gè)，10毫升注射器1個(gè)，離心管5個(gè)，剪刀兩把，小白鼠5只，微量移液器1把（帶槍頭），玻片5片，酒精棉球。實(shí)驗(yàn)操作方法1 處死小鼠前36小時(shí)向小鼠腹腔中注入秋水仙素(按每克體重58g量注入)。2斷頸椎處死小鼠。3剪開腹腔，剝離出兩條后肢，由股骨關(guān)節(jié)處剪斷，取下后肢(注意不要將股骨剪斷)。 4將骨外面的肌肉盡可能剪掉，剩下附著在骨骼上的少量肌肉，用棉花或紗布蘸75的酒精來回搓，直至骨骼外不帶任何肌肉為止。5剝離股骨，并將股骨頭的兩端剪去少許，使共成為平面，然后用較細(xì)

44、的注射器針頭小心插人骨髓腔中，將骨髓腔穿通(不可用力過大，以防骨骼破裂)。6將1m1注射器的針頭插入骨髓腔12部位， 然后將股骨浸入盛有085生理鹽水的離心試管中，操縱注射器將骨髓細(xì)胞沖洗到離心試管內(nèi)，直至骨髓腔呈白色為止。丟棄股骨，拍打離心試管中的細(xì)胞使其散開。7用1000轉(zhuǎn)分鐘的速度離心810分鐘，棄去上清液，留下細(xì)胞。向細(xì)胞中加入46ml在37預(yù)熱的0075molL KCl溶液，拍打均勻，置37恒溫箱中2040分鐘進(jìn)行低滲處理。在此期間同時(shí)配制固定液，即甲醇加冰醋酸(3：1)，放入密閉的瓶中，置46冰箱中備用。 8低滲完畢，立即加入lml新配制的預(yù)冷的固定液，并用吸管抽打均勻，進(jìn)行預(yù)固定

45、。然后用1000轉(zhuǎn)分鐘的速度離心810分鐘。 9棄去上清液，沿離心管壁向沉淀的細(xì)胞團(tuán)中徐徐加入新配制并預(yù)冷的甲醇冰醋酸固定液46ml，用吸管輕輕地將固定液與細(xì)胞團(tuán)抽打混勻，置室溫下固定2530分鐘。10用1000轉(zhuǎn)分鐘速度離心810分鐘，棄去上清液。11再次加入固定液，抽打均勻后，將試管置于4冰箱中固定30分鐘或更長時(shí)間，必要時(shí)也可過夜。12用1000轉(zhuǎn)分鐘速度離心810分鐘，棄去上清液，13根據(jù)管底沉淀細(xì)胞的多少，加入新配制的固定液0305m1，并用吸管將細(xì)胞團(tuán)輕輕吹打散開，形成懸浮液。14滴片：將干凈的載玻浸入50酒精溶液中，并置4冰箱中預(yù)冷。使用前取出載玻片放入冰柜510分鐘后取出，用吸

46、管吸取細(xì)胞懸液從一米高處滴在預(yù)冷的載玻片上，每張載片上滴12滴但勿重疊，然后用鑷子夾住載玻片的一端，在酒精燈火焰上過一下，使染色體更好地散開。15染色：用pH68的磷酸緩沖液將姬姆薩母液稀釋10倍，放入染色缸中，將制備好的晾干的染色體標(biāo)本載片投入染色缸中，染色10分鐘。16迅速用自來水將染料沖洗掉，將載片標(biāo)本晾干，用光學(xué)顯微鏡鏡檢，必要時(shí)可用蓋片封后保存。實(shí)驗(yàn)十 臍血中單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理 從混合的細(xì)胞懸液中獲取目的細(xì)胞的過程叫細(xì)胞分離（cell separation ）。不同的細(xì)胞具有不同的形態(tài)和功能特征，細(xì)胞的形態(tài)特征反映在其物理性狀上，如各種細(xì)胞的大小、比重、表面電荷和黏附能力等

47、存在差異；而細(xì)胞的功能特征往往由該細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)（表面標(biāo)記）來體現(xiàn)，根據(jù)不同形態(tài)和功能特征，可以將各種目的細(xì)胞從混合細(xì)胞群體中分離出來。一步梯度密度離心法: 將細(xì)胞懸液加于一種高密度介質(zhì)上，應(yīng)用低速離心，密度大于介質(zhì)的細(xì)胞通過介質(zhì)而沉淀于管底，而密度低于介質(zhì)的細(xì)胞則滯留于介質(zhì)之上，體積較大的細(xì)胞沉降較快，體積較小的細(xì)胞沉降較慢，從而將具有不同密度和大小的細(xì)胞分離開來。一步密度梯度離心法常用于分離血細(xì)胞和形成玫瑰花環(huán)的淋巴細(xì)胞。一步密度梯度法常用的分離介質(zhì)是Ficoll-Hypaque，也可用Percoll、動(dòng)物血清、BSA等。 實(shí)驗(yàn)用品試劑：【按兩個(gè)臍血標(biāo)本（60-100ml）即兩次實(shí)驗(yàn)設(shè)

48、計(jì)耗材量 】1、 FicollHypaque分離液(密度1077l 0001gm1)：一瓶。2、 D-MEM/F-12（1）、liquid、11，11330-032， 500ml （GIBCO）3、 表皮生長因子【epidermal growth factor( EGF)、Human、Recombinant，13247-051， 100g （GIBCO）】：貯存液（2g/ml）配制方法：100g溶解50 ml三蒸水中，過濾除菌分裝注射液瓶（2ml5ml/瓶）， -20保存。使用時(shí)按100ml培養(yǎng)液加入1ml即可。4、 成纖維細(xì)胞生長因子【basic fibroblast growth fact

49、or （bFGF）,13256-029,10g（GIBCO）】：貯存液（2g/ml）配制方法：10g溶解5 ml三蒸水中，過濾除菌，分裝注射液瓶（1ml/瓶），-20保存。使用時(shí)按100ml培養(yǎng)液加入1ml即可。 5、 青霉素/鏈霉素（100）貯存液。按常規(guī)方法配制。6、 谷氨酰胺（100）貯存液配制:取0.3 g谷氨酰胺溶于10ml三蒸水過濾分裝, 分裝注射液瓶（1ml/瓶），-20保存。使用時(shí)按100ml培養(yǎng)液加入1ml。7、 pH調(diào)整液【NaHCO3常用濃度為7.4%、5.6%、3.7%（m/v）。高壓滅菌的10%的醋酸溶液。HEPES（化學(xué)全名羥乙基哌嗪乙硫磺酸）溶液：是一種氫離子緩沖

50、劑，一般培養(yǎng)基內(nèi)含20mmol/l HEPES即可達(dá)到緩沖能力?！?、 平衡鹽溶液【PBS液的配制：可配成含0.85%NaCl，pH=7.2的PBS(簡稱PH=7.2 的PBS) PBS液(10)貯存液配法: NaCl8.5g,KCl0.2g,NaHPO412H2O2.85g(NaHPO42H2O 1.13g),K H2 PO4 0.27g溶與100ml三蒸水中。1mol/L（100）HEPES貯存液配法：取23.8gHEPES溶于100ml三蒸水中,用1 mol/LNaOH調(diào)pH至7.58.0后,過濾除菌,分裝(2ml/瓶),4或-20保存?！?、 2%NaOH 1%HCL。器材與設(shè)備：可調(diào)

51、微量移液器（5-40l、40-200l、200-1000l）（共用）及對(duì)應(yīng)槍頭；鋁制或不銹鋼制盒子；針頭式濾器（0.22m的微孔濾膜）4個(gè)；100ml輸液瓶10個(gè)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶10個(gè)；50 ml刻度離心管：10個(gè)；刻度吸管5 m1、 10 m1各10個(gè)；尖頭吸管10個(gè)（帶小膠頭）；顯微鏡一臺(tái)；水平離心機(jī)一臺(tái)；吸管筒：3個(gè)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板一個(gè)；脫脂棉（酒精棉球）。材料來源：檸檬酸鈉抗凝臍血；實(shí)驗(yàn)方法（一）FicollHypaque分離法1、將FicollHypaque溶液小心地加于刻度離心管底部，體積不超過試管的14。2、取抗凝血若干毫升，用Hanks液（或PH=7.2 的PBS）將其稀釋1倍，混勻。

52、用刻度吸管將稀釋血液沿管壁輕輕加于FicollHypaque上面，使稀釋血液重疊于FicollHypaque溶液上。稀釋血與FicollHypaque液的柱高之比約為3：2，且兩者的總柱高不超過試管的23。（15/22.5）。3、將試管置水平離心機(jī)中，以2000rmin離心20min。離心畢，試管內(nèi)可見分為五層，一般可分為4個(gè)組分：最上層是血漿和血小板；第二層是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；第三層為FicollHypaque；第四層為粒細(xì)胞；第五層是紅細(xì)胞。收集第二層細(xì)胞于離心管內(nèi)。 4、將收集的目的細(xì)胞懸液進(jìn)一步用適量Hanks液（或PH=7.2 的PBS）1000rpm離心5min洗滌，棄上清，將沉

53、淀彈起，用適量D-MEM/F-12培養(yǎng)液將各管內(nèi)細(xì)胞收集在一管內(nèi)。（若紅細(xì)胞較多，可用三蒸水解離紅細(xì)胞，解離后加Hanks液（或PH=7.2 的PBS）離心、棄上清用適量D-MEM/F-12培養(yǎng)液懸?。?。 5、 檢查細(xì)胞活力,計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞密度：取2滴細(xì)胞懸液加l滴2臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻，5min后，取樣作濕 片檢查?；罴?xì)胞不著色，死亡細(xì)胞呈藍(lán)色。取用臺(tái)盼藍(lán)染過的細(xì)胞懸液用HANKs液（或PH=7.2 的PBS）稀釋一定倍數(shù)，混勻后吸取1 滴，加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，以下式計(jì)算細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度(個(gè)m1)： 細(xì)胞密度4大格細(xì)胞總數(shù)除以4乘以l04乘以稀釋倍數(shù)(個(gè)

54、m1)（二）細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法D-MEMF-12（11） 100ml ；谷氨酰胺 30mg；BFGF 2g；EGF 2g；青霉素 U；鏈霉素 10000g。根據(jù)分離出的細(xì)胞的密度，算出將細(xì)胞配成2106個(gè)/ ml的培養(yǎng)液的量，取該量的D-MEMF-12將細(xì)胞稀釋，再根據(jù)該量算出所需谷氨酰胺、 青霉素/鏈霉素貯存液的量并加入其中，37、5%CO2進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。每二天更換一次培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)十一 血細(xì)胞的分離和紅細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)試劑：1. PH=7.2 的PBS2. 0.4臺(tái)盼藍(lán)染液,3. 50聚乙二醇(PEG) 稱取一定量的PEG(MW4000)放入刻度試管，在酒精燈下或沸水中加熱溶化。待冷至50時(shí)，加入等體積并預(yù)熱至50的GKN液混勻。 4.GKN液 NaCl 8g，KCl 04g，Na 2HP042H20 177g，NaH2PO42H2O 069g，葡萄糖2g，酚紅001g，溶于1000ml三蒸水中。 器材與設(shè)備：刻度離心管5 ml：吸管；細(xì)胞計(jì)數(shù)板一個(gè)；顯微鏡一臺(tái)；水平離心機(jī)兩臺(tái)等。待分離材料：檸檬酸鈉抗凝血。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、將淋巴細(xì)胞分離液加入離心管2ml。2、取抗凝血2毫升，用PH=7.2 的PBS 0.5ml將其稀釋倍，混勻。用刻度吸管將稀釋血液沿管壁輕輕加于淋巴細(xì)胞分離液上，使稀釋血液重疊于溶液上