細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題

1、細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)節(jié)基本文章-無(wú)菌操作基本技術(shù)N 1 .實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室和無(wú)菌控制臺(tái)(laminar flow)用紫外線燈照射殺菌，用70 %ethanol擦拭無(wú)菌操作升降機(jī)面，啟動(dòng)無(wú)菌控制臺(tái)風(fēng)扇10分鐘后，實(shí)驗(yàn)才開(kāi)始。一次只處理一個(gè)細(xì)胞系，即使培養(yǎng)基相同，也不共享培養(yǎng)基以防止混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)用品拿出工作臺(tái)上，用70%的乙醇擦拭滅菌工作升降機(jī)的面。操作間隔應(yīng)在滅菌控制臺(tái)啟動(dòng)10分鐘以上后進(jìn)行到下一個(gè)細(xì)胞系。N 2 .殺菌的工作區(qū)域必須干凈寬敞，必需物品(如試管架、吸管吸收器或吸管盒等)可以暫時(shí)放置，其他實(shí)驗(yàn)用品用完后，必須轉(zhuǎn)移，以幫助氣流流通。實(shí)驗(yàn)用品用70%乙烯利擦拭后，才會(huì)

2、帶入滅菌控制臺(tái)。實(shí)驗(yàn)工作不應(yīng)在升降機(jī)表面的中央無(wú)菌區(qū)，邊緣的非無(wú)菌區(qū)工作。N 3 .注意殺菌的實(shí)驗(yàn)物品，以免污染。不要觸摸吸管端頭或容器瓶蓋，不要在打開(kāi)的容器正上方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。打開(kāi)容器后，用手抓住瓶蓋，旋轉(zhuǎn)大約45度，可能的話，不要把蓋子放在桌子上。N 4 .職員要注意自己的安全，戴實(shí)驗(yàn)服和手套進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。感染人體或病毒的細(xì)胞株應(yīng)特別注意，選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)的無(wú)菌控制臺(tái)(至少第II類(lèi))。操作過(guò)程中應(yīng)避免aerosol的發(fā)生、DMSO和TPA等毒性藥品注意、鋒利針的損傷等。N 5 .定期檢測(cè)以下項(xiàng)目：5.1 .CO2圓柱中的CO2壓力5.2 .CO2培養(yǎng)箱CO2濃度、溫度及水板是否污染(隨行的水每周用無(wú)菌

3、水更換)。5.3 .滅菌控制臺(tái)上的氣流壓力、紫外線燈和赫波過(guò)濾器、預(yù)過(guò)濾器(300小時(shí)/預(yù)過(guò)濾器，3000小時(shí)/赫波)。N 6 .水槽可以通過(guò)添加消毒劑(Zephrin 1:750)定期更換水槽中的水?；A(chǔ)文章-實(shí)驗(yàn)用品N 1 .類(lèi)別：1.1 .細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品都是無(wú)菌的，除了玻璃容器和pasteur pipet以外，是塑料無(wú)菌產(chǎn)品。1.2 .TC級(jí)培養(yǎng)盤(pán)表面有用于細(xì)胞吸附的coating高分子物質(zhì)，培養(yǎng)容器種類(lèi)有Tflask、plates、dishes、roller bottle等，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要使用。1.3 .plastic sterle pipet : 1ml、2ml、5ml、10ml、

4、25ml1.4 .塑料離心管： 15 ml，50 ml具有兩種不同的材料。其中，多邊形樣式(gp)是不透明材質(zhì)，多邊形樣式(PS)是透明材質(zhì)，您可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要為材質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)碾x心管。1.5 .使用glass pas tuer pipet : 9英寸提取廢棄的培養(yǎng)液等。1.6 .玻璃血清?。?00ml、250ml、500ml、1000mlN 2 .清潔：2.1 .新購(gòu)買(mǎi)的玻璃血清瓶先用0.10.05 N HCl浸泡幾小時(shí)后開(kāi)始使用。2.2 .使用的玻璃血清病用高壓蒸汽滅菌，洗凈后，分別用1，2次去離子水沖洗，不加洗滌劑沖洗。N 3 .殺菌：3.1實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶用鋁箔涂敷蓋子，將高壓蒸汽滅菌1

5、21，15，20分鐘放在oven上干燥。3.2實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet是干燥熱的滅菌，170，4小時(shí)。3.3 .液體或固體廢棄物可以在hypo chloride溶液(次氯酸，漂白劑)或蒸汽高壓滅菌121 、15、20分鐘內(nèi)處理?；A(chǔ)文章-徽章N 1 .液體培養(yǎng)基保存在4冰箱里，避免光，實(shí)驗(yàn)前放在37 水槽里取暖。N 2 .液體培養(yǎng)基(加上血清)保管期限為6個(gè)月，滑翔機(jī)就能分解，如果細(xì)胞生長(zhǎng)不好，可以添加適當(dāng)數(shù)量的格萊默。N 3 .粉末培養(yǎng)基的制備(以1為例):3.1細(xì)胞培養(yǎng)基一般需要添加10%的血清，因此粉末培養(yǎng)基的制造體積為900毫升，pH為7.2-7.4。NaHCO3是單獨(dú)添加

6、的，直接將NaHCO3粉末添加到液體培養(yǎng)基中可能導(dǎo)致pH誤差或局部過(guò)堿。因此，粉末培養(yǎng)基和NaHCO3粉末必須分別溶解后混合，然后用CO2氣體(而不是強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)調(diào)節(jié)pH。因?yàn)槁入x子會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，在儲(chǔ)存過(guò)程中培養(yǎng)基的pH值容易變化。N 3.2 .資料：純凈水(milli-Q水或2-3次蒸餾水，水的質(zhì)量非常重要)，粉末培養(yǎng)基，NaHCO3，電磁攪拌器無(wú)菌血清瓶，0.1或0.2毫米無(wú)菌濾膜，pH米，真空泵，二氧化碳?xì)怏w步驟N 3.3:3.3.1。將粉末培養(yǎng)基溶解在700 ml mill-q水中。3.3.2 .將適量的NaHCO3粉末溶解在200ml milli-Q水中，溶解后

7、，將CO2氣體通過(guò)飽和約3-5分鐘。3.3.3 .將含有溶解和飽和CO2的NaHCO3溶液放入溶解的液體培養(yǎng)基中攪拌?；旌先芤旱膒H值必須為7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否則不需要酸堿重新平衡。如果太堿，可以通過(guò)CO2氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基通過(guò)真空泵通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)，pH值增加0.1-0.2。3.3.4。使用0.1或0.2毫米無(wú)菌過(guò)濾膜，分放在滅菌容器中，同時(shí)標(biāo)記培養(yǎng)基類(lèi)型、日期、瓶號(hào)等，儲(chǔ)存在4 。(血清也可以添加到培養(yǎng)基中一起過(guò)濾)3.3.5。制備培養(yǎng)基的制備應(yīng)通過(guò)生長(zhǎng)試驗(yàn)和污染試驗(yàn)。附著.制備培養(yǎng)基的生長(zhǎng)試驗(yàn)n材質(zhì)：MDCK cell (ATCC CCL-34或CCRC 60004)6-

8、well TC plate (or 35 mm TC磁盤(pán))MethanolGlacial acetic acid10% gie MSA解決方案(gibco brl10092-013)步驟n:1.以MDCK cell為測(cè)試對(duì)象培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，在6-well plate(或35mm TC dish)中為每個(gè)well接種1 102活性細(xì)胞，作為對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.接種5 7天后用100倍工具顯微鏡觀察細(xì)胞群的生長(zhǎng)情況。細(xì)胞群很大，可以用肉眼觀測(cè)到，但群體之間不互相接觸的情況下可以使用。3.除去徽章，10 min Carnoys固定液(甲醇：冰醋酸？4.去除固定物，第二次水洗。5.添加1 ml

9、 10% Giemsa解決方案，在室溫下靜置2-3分鐘。染料去除液，水洗二次。7.如果用肉眼計(jì)算群落數(shù)進(jìn)行比較，如果新配制或新加入批次的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不好，就會(huì)丟棄?；A(chǔ)文章-抗生素N 1 .細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞培養(yǎng)液中沒(méi)有抗生素。1.1 .培養(yǎng)ATCC引進(jìn)的細(xì)胞系?；照吕锊环趴股?。1.2 .如果要培養(yǎng)從其他實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)的細(xì)胞株，并制作token freeze前培養(yǎng)基，就必須添加抗生素，如果token freeze通過(guò)污染測(cè)試，就不放抗生素，而是大量培養(yǎng)。N 2 .發(fā)送生細(xì)胞時(shí)，如果需要將培養(yǎng)液填滿整個(gè)flask，則需要添加抗生素(pencillin 100 units/ml strept myci

10、n 100 ug/ml)。N 3 .要檢測(cè)支原體，gentamicin抑制支原體生長(zhǎng)，因此不能向培養(yǎng)基中添加gentamicin。N 4 .抗生素混合公式： pencillin 250 units/ml、strepomycin 250 ug/ml、neomycin 250 ug/ml、bacitracin 2.5 units/ml、混合使用N 5 .抗生素使用類(lèi)型和濃度：工作濃度。溫度存儲(chǔ)。殺死細(xì)菌pen cillin 100 units/ml-20g()bacteriaStrptomaycin 100 ug/ml-20 g()和g (-) bacteriaChlo tetracycline

11、50ug/ml-20 g()和g (-) bacteriagentamic in 50ug/ml-20c g()和g (-) bacteria，mycoplasmaamphotericsin b 2.5 ug/ml-20yeast and moldsnystatin 50ug/ml-20yeast and moldsfungi zone 2.5 ug/ml-20yeast and molds基礎(chǔ)文章-血清N 1 .血清應(yīng)保存在-20 -70，如果保存在4 ，則不要超過(guò)一個(gè)月。如果一次不能用完一瓶，可以將40-45毫升安裝在無(wú)菌50毫升離心管上，血清凍結(jié)時(shí)體積會(huì)增加約10%，因此需要為這個(gè)膨脹體

12、積留出空間。否則，污染或容器容易凍結(jié)。N 2 .一般來(lái)說(shuō)，制造商提供的血清是無(wú)菌的，不再需要無(wú)菌過(guò)濾。如果血清中有很多懸浮物，就不能將血清放在培養(yǎng)基中過(guò)濾，直接過(guò)濾血清。N 3 .瓶子(500毫升)血清解凍階段(分步解凍法):-20 或-70-c-4的冰箱溶解一天，在室溫下完全溶解后再化妝，一般可以在50毫升無(wú)菌離心管內(nèi)裝扮成40-45毫升。溶解過(guò)程中要有規(guī)律地?fù)u晃(注意不要產(chǎn)生氣泡)，溫度和成分都要均勻，減少沉沒(méi)發(fā)生。不要直接解凍-20 到37 。溫度變化太大，很容易發(fā)生蛋白質(zhì)凝結(jié)，可能會(huì)發(fā)生粘連。N 4 .heat-inactivation的意思是56 ，加熱完全解凍的血清30分鐘。加熱時(shí)

13、要有規(guī)律地?fù)u動(dòng)和均勻。熱處理的目的是激活血清的補(bǔ)體成分。除非必須這樣，否則一般不建議這種熱處理，因?yàn)檫@會(huì)影響沉淀物的顯著增加和血清質(zhì)量。補(bǔ)體參與反應(yīng)包括cyto lytic activities、contraction of smooth muscle、release of histamine from mast cells and platelets、enhanced phagocytosisN 5 .不要把血清放在37 太久。放置在37 太久會(huì)使血清渾濁，血清中不穩(wěn)定的成分也會(huì)破壞很多，影響血清的質(zhì)量。N 6 .血清沉淀物6.1 .凝固物：由于多種原因發(fā)生，但普遍的原因是血清中脂蛋白變性及

14、解凍后血清中存在的纖維蛋白(fibrin)，這些凝固物不影響血清本身的質(zhì)量。要減少這些沉淀物，可以在離心力3000 rpm、5分鐘或離心力后將上等液添加到培養(yǎng)基中過(guò)濾。由于可以阻止過(guò)濾膜，建議不要使用過(guò)濾步驟去除這些凝固的沉積物。N 6.2。顯微鏡觀察到的“小黑點(diǎn)”:一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增加。有些沉淀物像顯微鏡下看到的“小黑點(diǎn)”一樣，誤以為血清被污染了，想在37 放入血清培養(yǎng)它的“微生物”在37 ，但在37 ，這種沉淀物增加，被誤認(rèn)為是微生物的增殖，用細(xì)菌培養(yǎng)培養(yǎng)基檢測(cè)出來(lái)，沒(méi)有污染。一般來(lái)說(shuō)，這個(gè)小黑點(diǎn)不應(yīng)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，但如果懷疑這種血清的質(zhì)量，就要立即停用，更

15、換其他批次的血清。附件-血清生長(zhǎng)試驗(yàn)n材質(zhì)：MDCK cell (ATCC CCL-34或CCRC 60004)a-mem(alpha modified minimal essential medium，gibco brl12000-022)6-well TC plate (or 35mm TC磁盤(pán))MethanolGlacial acetic acid10% gie MSA解決方案(gibco brl10092-013)步驟n:1.T75 flask將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)到80% confluency，a-MEM with 10% FBS(經(jīng)測(cè)試)。2.用trypsin-EDTA處理細(xì)胞，離心后添加未添加血清的適量a-MEM，制作細(xì)胞懸浮液，測(cè)定細(xì)胞濃度。未添加血清的a-MEM稀釋細(xì)胞濃度為1102活性細(xì)胞數(shù)/ml。3.將6ml細(xì)胞懸浮接種于6井平板，在1毫升中添加不同