分子生物學(xué)的應(yīng)用技術(shù)+ppt.ppt

1、分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用、(基因表達(dá))、基因表達(dá)、基因表達(dá)是指基因組中的一個(gè)基因從細(xì)胞轉(zhuǎn)錄到mRNA并翻譯成蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_(dá)的變化預(yù)示著分子水平上細(xì)胞的變化。這往往是細(xì)胞形態(tài)功能改變之前的變化。影響基因表達(dá)的因素：1，遺傳因素個(gè)體差異，終身不變。2，環(huán)境因素激素，藥物，細(xì)胞因子，機(jī)械刺激，病原體感染，電刺激，細(xì)胞轉(zhuǎn)基因，基因表達(dá)研究手段，1，RT-PCR (RNA) 2，Northern blot (RNA根據(jù)PCR產(chǎn)品的數(shù)量判斷基因表達(dá)的強(qiáng)度。RT-PCR是半定量方法，實(shí)驗(yàn)操作：1)RNA提?。喝蚬ぞ甙?。防止RNA分解，RNA提取成功與否是RT-PCR分析中最重要的階段。(2

2、)逆轉(zhuǎn)錄：RNA，緩沖液，dNTP，逆轉(zhuǎn)錄酶，引物(隨機(jī)引物，Oligo dT)，3) PCR，特定引物，模板，Taq聚合酶。通過PCR將目標(biāo)片段增加幾十-一百萬倍。在一定范圍及特定條件下，PCR的生成物量與模板量成正比。，模板量，4)一些注意事項(xiàng)：反應(yīng)平臺(tái)內(nèi)部人參1，PCR效率差異，重復(fù)性2，內(nèi)部參數(shù)選擇3，共同放大4，放大片段長(zhǎng)度5，mRNA豐富度，mRNA、100%、160%、a b c d、2.0 2.0、2.0 1.0、2.0 2.0、1.0 1.0、RT-PCR特性：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、特異性高、操作方便。缺點(diǎn)：可信度低，沒有細(xì)胞位置。2，Northern blot，標(biāo)記探針與膜固相R

3、NA雜交。根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱判斷表達(dá)量，根據(jù)雜交信號(hào)位置判斷分子長(zhǎng)度。雜交信號(hào)，實(shí)驗(yàn)操作：1)RNA提取2)RNA電泳(分離不同長(zhǎng)度的RNA)3)膜(固相RNA形成)4)探針標(biāo)記(同位素/無同位素)5)預(yù)雜交，雜交可以確認(rèn)未知基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)的長(zhǎng)度。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：1，操作煩人2，同位素3，低靈敏度4，對(duì)RNA質(zhì)量的高要求5，不能定位細(xì)胞，3，Western blot，標(biāo)記抗體和膜固體蛋白質(zhì)作用。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度判斷蛋白質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度。根據(jù)信號(hào)位置判斷蛋白質(zhì)分子量。標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)，特定反應(yīng)帶，1)蛋白質(zhì)提取2)蛋白質(zhì)電泳(分離其他分子量蛋白質(zhì))3)轉(zhuǎn)移4)閉合5) 1段反應(yīng)6)標(biāo)記2段(HRP/

4、AP標(biāo)記)作用7)著色，實(shí)驗(yàn)操作：缺點(diǎn)：低靈敏度的一項(xiàng)準(zhǔn)備難度高，購(gòu)買價(jià)格高，容易發(fā)生交叉反應(yīng)，無法確定細(xì)胞位置，4，免疫組織化，顯示抗體和組織細(xì)胞作用。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱判斷表達(dá)強(qiáng)度，根據(jù)信號(hào)位置判斷表達(dá)細(xì)胞。eNOS表達(dá)，(對(duì)照)，(實(shí)驗(yàn))，實(shí)驗(yàn)操作，1)組織切片(石蠟/凍結(jié))2)閉合，內(nèi)源性過氧化物酶失活3)一元作用4)二項(xiàng)式(HRP標(biāo)記)基因表達(dá)強(qiáng)度取決于混合信號(hào)強(qiáng)度?；蛐酒卣鳎簝?yōu)點(diǎn)：通過一次雜交，可以獲得大量的表達(dá)信息。透氣性好。缺點(diǎn)：成本高，需要特殊設(shè)備。人類基因組計(jì)劃表明，人類有3.4萬個(gè)基因，并已死亡多達(dá)10萬個(gè)基因?；虻耐瑫r(shí)空表達(dá)是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。是組織、器官和系統(tǒng)發(fā)育分化