分子生物學的應用技術+ppt.ppt

1、分子生物學技術在醫(yī)學研究中的應用、(基因表達)、基因表達、基因表達是指基因組中的一個基因從細胞轉錄到mRNA并翻譯成蛋白質的過程?；虮磉_的變化預示著分子水平上細胞的變化。這往往是細胞形態(tài)功能改變之前的變化。影響基因表達的因素：1，遺傳因素個體差異，終身不變。2，環(huán)境因素激素，藥物，細胞因子，機械刺激，病原體感染，電刺激，細胞轉基因，基因表達研究手段，1，RT-PCR (RNA) 2，Northern blot (RNA根據(jù)PCR產品的數(shù)量判斷基因表達的強度。RT-PCR是半定量方法，實驗操作：1)RNA提取：三唑工具包。防止RNA分解，RNA提取成功與否是RT-PCR分析中最重要的階段。(2

2、)逆轉錄：RNA，緩沖液，dNTP，逆轉錄酶，引物(隨機引物，Oligo dT)，3) PCR，特定引物，模板，Taq聚合酶。通過PCR將目標片段增加幾十-一百萬倍。在一定范圍及特定條件下，PCR的生成物量與模板量成正比。，模板量，4)一些注意事項：反應平臺內部人參1，PCR效率差異，重復性2，內部參數(shù)選擇3，共同放大4，放大片段長度5，mRNA豐富度，mRNA、100%、160%、a b c d、2.0 2.0、2.0 1.0、2.0 2.0、1.0 1.0、RT-PCR特性：優(yōu)點：靈敏度高、特異性高、操作方便。缺點：可信度低，沒有細胞位置。2，Northern blot，標記探針與膜固相R

3、NA雜交。根據(jù)雜交信號強弱判斷表達量，根據(jù)雜交信號位置判斷分子長度。雜交信號，實驗操作：1)RNA提取2)RNA電泳(分離不同長度的RNA)3)膜(固相RNA形成)4)探針標記(同位素/無同位素)5)預雜交，雜交可以確認未知基因的轉錄產物(mRNA)的長度。優(yōu)點：缺點：1，操作煩人2，同位素3，低靈敏度4，對RNA質量的高要求5，不能定位細胞，3，Western blot，標記抗體和膜固體蛋白質作用。根據(jù)信號強度判斷蛋白質表達強度。根據(jù)信號位置判斷蛋白質分子量。標準分子量蛋白質，特定反應帶，1)蛋白質提取2)蛋白質電泳(分離其他分子量蛋白質)3)轉移4)閉合5) 1段反應6)標記2段(HRP/

4、AP標記)作用7)著色，實驗操作：缺點：低靈敏度的一項準備難度高，購買價格高，容易發(fā)生交叉反應，無法確定細胞位置，4，免疫組織化，顯示抗體和組織細胞作用。根據(jù)信號強弱判斷表達強度，根據(jù)信號位置判斷表達細胞。eNOS表達，(對照)，(實驗)，實驗操作，1)組織切片(石蠟/凍結)2)閉合，內源性過氧化物酶失活3)一元作用4)二項式(HRP標記)基因表達強度取決于混合信號強度?；蛐酒卣鳎簝?yōu)點：通過一次雜交，可以獲得大量的表達信息。透氣性好。缺點：成本高，需要特殊設備。人類基因組計劃表明，人類有3.4萬個基因，并已死亡多達10萬個基因?；虻耐瑫r空表達是細胞結構和功能的基礎。是組織、器官和系統(tǒng)發(fā)育分化