多克隆抗體制備.ppt

1、A,1,多克隆抗體制備,A,2,多克隆抗體的制備方法,A,3,動物選擇,一、選擇制備多克隆抗體(抗血清)的動物種類應(yīng)考慮的要點(diǎn): 需要制備的抗血清的質(zhì)量; 供給蛋白質(zhì)抗原的動物與免疫動物之間的種系關(guān)系; 免疫動物產(chǎn)生的抗體特性（針對不同性質(zhì)的免疫原選用相應(yīng)的動物）。 二、動物的年齡、性別和數(shù)量對抗體制備的影響 優(yōu)先選取青壯年動物； 雌性動物的免疫應(yīng)答狀況,無論是細(xì)胞性還是體液性免疫都比雄性個(gè)體強(qiáng)烈。,A,4,家兔,家兔是最適合制備抗體的動物。 其體型適中,成年體重為26kg,一次采血量可達(dá)2550ml,全放血量則達(dá)100180ml; 性格馴順,易于操作和采血; 壽命相對較長,為58年; 能生產(chǎn)

2、足夠量的高效價(jià)和高親和力的抗血清； 通常適用于制備抗嚙齒類和人蛋白質(zhì)的抗體； 家兔僅一型IgG而無亞型。用家兔的IgG很容易制備Fc、Fab和F(ab)2等片段,A,5,雞,雞的種系距哺乳動物較遠(yuǎn),用以制備抗哺乳動物蛋白質(zhì)的抗體具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。 雞的IgG常稱IgY,其特點(diǎn)是不會激活哺乳動物的補(bǔ)體成分C1,也不會與細(xì)菌蛋白A或蛋白質(zhì)G、哺乳動物的Fc受體或類風(fēng)濕因子等發(fā)生反應(yīng)。在極端條件下,雞IgY的穩(wěn)定性不如家兔IgG,不過,雞的IgY在雞蛋內(nèi)可保持穩(wěn)定達(dá)數(shù)月之久,純品IgY在中性緩沖液和冷藏條件下則可保存數(shù)年之久。用雞IgY已經(jīng)制備出Fc和單價(jià)的Fab或Fab等片段。 雞可將大量IgY輸送

3、入雞蛋黃中, 從雞蛋中收獲抗體可避免采用損傷性的收集手段。,A,6,免疫劑量,劑量：免疫原合適劑量的選定應(yīng)考慮抗原性強(qiáng)弱、分子量大小和免疫時(shí)間。大動物抗原劑量（以蛋白抗原為準(zhǔn)）約0.51mg/只，小動物約0.10.6mg/只。如無免疫佐劑可適當(dāng)提高免疫劑量（10-20倍）。 乳化：一般抗原與免疫佐劑體積比1:1混合。首次免疫采用完全佐劑，加強(qiáng)免疫采用不完全佐劑。,（1）延長抗原釋放時(shí)間； （2）增加抗原的表面積； （3）佐劑能刺激吞噬細(xì)胞對抗原的處理；（4）增強(qiáng)輔助T細(xì)胞的作用； （5）刺激致敏淋巴細(xì)胞的分裂和漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。使無免疫原性物質(zhì)變成有效的免疫原； （6）改變抗體的產(chǎn)生類型以及產(chǎn)生

4、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，并使其增強(qiáng)。,A,7,免疫方式,注射途徑：免疫注射的途徑也很重要。一般采用多點(diǎn)注射，一只動物注射總數(shù)約為810點(diǎn)，包括足掌及肘窩淋巴結(jié)周圍，背部兩側(cè)、頜下、耳后等處皮內(nèi)或皮下，皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，對提高抗體效價(jià)有利,A,8,免疫方式,間隔與免疫時(shí)間：第一次免疫后，因動物機(jī)體正處于識別抗原和b細(xì)胞增殖階段，如很快接著第二次注入抗原，極易造成免疫抑制。一般以間隔1020天為好。二次以后每次的間隔一般為710天，不能太長，以防刺激變?nèi)?，抗體效價(jià)不高。 免疫次數(shù)：根據(jù)抗體效價(jià)要求確定（抗血清滴度測定）,A,9,免疫應(yīng)答,機(jī)體免疫系統(tǒng)受到抗原刺激后，免疫細(xì)胞發(fā)生一系列變化，并產(chǎn)生一定

5、免疫效應(yīng)的過程。 (一) 感應(yīng)階段(inductive stage) 稱致敏階段(sensitization stage)，是抗原物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)，抗原遞呈細(xì)胞(APC)對其識別、捕獲、加工處理和遞呈，以及抗原特異性淋巴細(xì)胞(T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞)對抗原的識別階段。 ( 二) 增生分化階段(proliferative and differentiative stage) 又稱反應(yīng)階段(reactive stage)，是抗原特異性淋巴細(xì)胞識別抗原后活化，進(jìn)行增殖與分化，以及產(chǎn)生效應(yīng)性淋巴細(xì)胞和效應(yīng)分子的過程。T 細(xì)胞增殖分化為淋巴母細(xì)胞，最終成為效應(yīng) T 細(xì)胞(或稱致敏 T 細(xì)胞)，并產(chǎn)生多種細(xì)胞因

6、子；B 細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞，合成并分泌抗體。一部分 T、B 淋巴細(xì)胞在分化過程中成為記憶細(xì)胞(Bm 和 Tm)。在此階段，有多種細(xì)胞間的協(xié)作和多種細(xì)胞因子的參加。 (三) 效應(yīng)階段(effective stage) 此階段是由活化的效應(yīng)細(xì)胞(CTL 與 TD 或 TDTH)和效應(yīng)分子(抗體與細(xì)胞因子)發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)和體液免疫效應(yīng)的過程。這些效應(yīng)細(xì)胞和效應(yīng)分子共同作用清除抗原異物。,A,10,A,11,初次應(yīng)答(primary response),機(jī)體初次接受適量的抗原刺激后，引起體內(nèi)抗體產(chǎn)生的過程稱為初次應(yīng)答，主要特點(diǎn)為： 機(jī)體初次接觸抗原后，需經(jīng)一定的潛伏期血清中才能出現(xiàn)抗體，潛伏期的長

7、短取決于抗原的性質(zhì)、抗原進(jìn)入機(jī)體的途徑、所用的佐劑類型、受體情況等，潛伏期之后為抗體的對數(shù)上升期，抗體含量直線上升，然后為持續(xù)期，抗體產(chǎn)生和排出相對平衡，最后為下降期； 初次應(yīng)答最早產(chǎn)生的抗體為 IgM，可在幾天內(nèi)達(dá)到高峰，然后開始下降，接著才產(chǎn)生 IgG，IgG 抗體產(chǎn)生的潛伏期比 IgM 長，如果抗原劑量少，可能僅產(chǎn)生 IgM，IgA 產(chǎn)生最遲，而且含量少； 初次應(yīng)答產(chǎn)生的抗體總量較低，維持時(shí)間也短，通常以 IgM 為主，且抗體的平均親和力較低。,A,12,再次應(yīng)答(secondary response),機(jī)體再次接觸相同的抗原時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生抗體的過程稱為再次應(yīng)答或回憶應(yīng)答(anamnestic response)，主要特點(diǎn)為： 潛伏期顯著縮短，約為初次應(yīng)答潛伏期的一半； 抗體含量大幅度上升，比初次應(yīng)答多幾倍到幾十倍，而且維持時(shí)間長； 誘發(fā)再次應(yīng)答所需的抗原劑量極??； 再次應(yīng)答產(chǎn)生的抗體主要為 IgG，而 IgM很少，抗體的平均親和力高。如果再次應(yīng)答間隔的時(shí)間越長，機(jī)體越傾向于只產(chǎn)生 IgG?？乖镔|(zhì)如經(jīng)消化道和呼吸道等粘膜途徑進(jìn)入機(jī)體，可誘導(dǎo)產(chǎn)生分泌型 IgA，在粘膜表面發(fā)揮免疫效應(yīng)。,A,13,血液采集,A,14,多克隆抗體純化,蛋白A親和層析 蛋白A可與多種哺乳動物的I