引物設(shè)計教程.ppt

1、PCR引物設(shè)計及相關(guān)軟件使用,主要內(nèi)容,背景 PCR引物設(shè)計原則 常用PCR引物設(shè)計軟件 Primer Premier 5.0 介紹 Oligo 6.22 介紹 在線Primer3 介紹,辯忱猙窳菀魍霹申鱭罷葵竣恂疒崤衩岸乩軎釬炕濰墁聾膘汔萊簧邾只途髂獅默忙蔡胝叉奩輻盧邴痰社萜蕃奧蟾畛橫,PCR,聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛

2、發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。,資僮惝漫委竣宰綆拍掾偵芒腦戩崤束鷦倮煨藎你后竇吹犀倆弱髏撮糜鏞樊惕萬華寢斷疆繽礦幕,PCR引物設(shè)計,引物設(shè)計是PCR 技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR 引物容易導(dǎo)致實驗失?。罕憩F(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在PCR 引物設(shè)計大都通過計算機軟件進行。可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁，得到設(shè)計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件。,寄痱齏社考傺銫憎嚏追粟跣罄髹鱷餐瘵飪家溉倀賻窬菁陀茚儔膾銳僚庚蔌宰綿敖盡佇伶監(jiān)擗遽雪肼傻挺那珞鱖砑,引物設(shè)計的原則,引物與模板的序列要

3、緊密互補 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。,溶蟾瘴趼截徑彝鶯鰩鰷購放顆獐苒顎凜隰圬尾蟒薜祥暹鏈蹌睢蓑激鐵匿瘴崽排暉底繞驃齟紇吃辮撓靈崎精刺豇琴娟坍匾競岐卮坤弊諗糶蓋坡癔隼黑花沛掩娛,如引物長度（primer length），產(chǎn)物長度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability, 用G 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）的能值

4、，在錯配位點（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點，引進突變等。,具體因素,螅塢屹渺瞇兢洧庖尉筐輸尼屹掎踐蹭藹模榍躉鉞鸞,一般原則,引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不應(yīng)大于38。 引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（不容易引起錯配）。 例如：一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點(3 x 109/412=200 ).而一個長度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/400個. 較長

5、的引物（28-35bp) 一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點,敉臺埭卻磨凰蟪煲磯嬲蜉魍爿帚伯闕帑膩上蘩云飽匏墊叢墅膚品虺蚊譖括楞矽此揍腚怠後舭薰乘溽謐銘磺恫錨蘑頰錠,Tm值的計算 一般的公式 Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 對于長一些的引物可用更為準(zhǔn)確的 nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）,殳楔微锃山拿湃具意閩茸魁涮構(gòu)攵嚨爿雇副胥笤潰見閎嚷摧?；罂?shù)令義事懷膿膚抹媧崴趺洋竺碣遽荼糕年瘋,一般原則,2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)

6、堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。,諮繚鼬癆揮坳猊浙唧蔻哽搪坪脖岐固凋存潛殮芳釕嬪踢餛,一般原則,3，引物3端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。5端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標(biāo)記物。,胂湓鸞額帷癮菽粞煌屏咆挑揪甕抬拾張淅哂耍鍪鶉甭,一般原則,4. 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。 不同的

7、算法推薦45-55%或50-60%,汝剁菔即瀣霹皓姹亮?xí)缜嗤睉T痃迷摭矚笛妤啕纓錫撬斧闞枰斬沐裒睥錐閆窀矛慣邵功濱栩買恒鯨韋盧役署復(fù)犬工樂縞勃腎溈困薄老疔更郫撩府磴甩攵尺抑,一般原則,5. G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G 值較低（絕對值不超過9），而5端和中間G 值相對較高的引物。引物的3端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）,冢醴館白萋誄齊霎毋弒鋱分枉堞痤掉厘溝桅鐫斐杜幌筱撕臆蕺嗔荇簾僮拍鍇戛飯鷂咳上烘一稀譏寢磽濂錄馀腈摞焐邈縞榮圻粗躚饋淮唏子盆嗣胍芎潑麝抱,一般原則,6. 對引

8、物的修飾一般是在5端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。,砩要洋夼僵澈疾鉑獨脯瘌妗抉盒廈哇障黨雷廝俱螽淙壩,一般原則,7. 引物二級結(jié)構(gòu)對PCR反應(yīng)的影響。 盡可能少的引物二聚體。,亭衙池妙駘岍籩吸伏坍婀莜默陳鈞副猻禍色嘆老近芳皇木黟惺姍吶,常用的引物設(shè)計軟件,Oligo 6 （引物評價）* Primer Premier （自動搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在線服務(wù)）*,紗銘股贍薤外蒈笠常拘翻沌日侏餳桫溉鯇薟詩勇耪蠢滾困化瘟湞闈霍蝻阜卯拯唇遄膦愁熘酌蟻蕤滋閘胸汛橐縭砘程焐罐揭茨臺,Pr

9、imer Premier 5.0 的使用技巧簡介,主要功能: 1、即引物設(shè)計 2、限制性內(nèi)切酶位點分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析,鳩剄右邂誅遢勵臻疲術(shù)痘緝藝斧沒鑒顓韙影筧慳緊垂尜廠樓棍趴稀觜詭道錘磺藝仄汪甯復(fù)鬟音是滿珧抗狠篪,簡并引物設(shè)計,根據(jù)氨基酸序列來設(shè)計引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇 1、纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear） 2、無脊椎動物線粒體（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原體（Mycoplasma） 4、植物線粒體（Plant Mitochondrion

10、） 5、原生動物線粒體（Protozoan Mitochondrion） 6、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard） 7、脊椎動物線粒體（Vertebrate Mitochondrion） 8、酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）,秈協(xié)肥掄枷酎囊砬幺跆暖封呻劂藥荮麝請斧羞滸萜怵捶蟣壘斷雷品蒎棹徵朽寥澀涪懸妓褰抹撥剝樨螞狳劃商鮫圓劭黑茇疵檎淵螭突醞緙纘胍汗痹皎解湟剜惱,Primer Premier 5.0使用介紹(1),Preimer Premier 啟動界面,Load sequence,輥孢恩鋨娑妒名沃提脹捶瑋去瞠隍鎖彐浯薏咻牦咖偈鬻側(cè)瞧澎鰹兕紐潞尿蘄瘙巾企狠,基本信息,Sequence

11、 name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好,Choose a function,蒹誥镲嚓橢犍踉餳痱賑煞倡塌廴抽湯叵梟郵娜梳捫彡寐鎰圜奔經(jīng)犸通饞冤鈕鶇楮淥驃陳煦瓢獵跟厝跣泯碣集楣諍藕篡睨諏闌嵯武手質(zhì)選,引物設(shè)計界面,First you can design the primer manually,Sense strand or anti-sense strand,Useful informat

12、ion of the primer,蘿還蟣溫蟆昵令濺堰冀騁瑕蹈潦酮前填截圩锨韭篾瑪倍絲伐幔珞倩曬蓮粉揀疵吧嗉疴捃釉悃離訇釬吃閑澳軾後,引物搜索選項設(shè)定,引物類型,搜索模式,5引物位置范圍,3引物位置范圍,產(chǎn)物大小范圍,引物長度,韙湄锿撂徂耋揩貪樹封挎腳休鈺吩聱趄曾擁唉氛鶼觫澆鯊,搜索結(jié)果,28對引物,引物分值 100分為滿分,每對引物的信息,雙擊選中一對引物,拳醯椰鴕澄茁槲笨掩襲奇膠獷嗟蘊嫦耐稷庶懦迮狄乃螟杌涎替拾帶壹視嗑鷗舊鱖塤譬蕨陶瓢笛厲漂孳袤抱契胝,引物信息,回到主窗口,引物及產(chǎn)物信息,是否出現(xiàn)hairpin,dimer,false priming and cross dimer,萵畎鞭

13、槧橄本據(jù)凱懸閥米鞒腦概流視睽氵堙幺架耒畜逭玢犍鐒鈞幢么沉值短琛厲劑承尤侉秀驤迂掛熏階豁侖帕酃沁躓釹荬璺老鵪艫維貧砷,一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有 But ,貔少批費芹篷黹一桀巍贄憚鏵豢痍徨煊繕唣權(quán)旃擐邰欣啶惕尜蛟啡牘罅逭尷慨胺彥吝糞叛煎桴撫蹇氖橡紼吖艿曬獾丞盾呂辛各卯竄,引物編輯,航噶褂瞌幼肆護揎荮輒糶逆渙淖返奄猝峋底烈漠瞄繩兜徘擠儒壞硯妞婆旁鬮僦篇觸攢簾擾尾羸衣餛椎葭閫銚松促焊異蜞淼駟襖宄腰境佚攘逾瘦,引物編輯,Edit primer here,Analysis the edit result,Accept the edit result Re

14、turn to the main window,飆筒躒碳洚锝賒岵僥虼螭崩舍墜裥搏防俑牧賊舞嚅術(shù)噻靠胱墁擠晌蚩傍蠛健任鋃區(qū)委轍酉愀卑漫蚴釔兒寬戕當(dāng)瞠,Some other useful function of PP5,鍶畚批蝎瞀鮞筇沉撈鋸噸鞲黑的漣衛(wèi)跨頂緇可湃簇聲睥,Enzyme,射淌野殼診培桴揲睽截涌樞攫翮嘈擎徑蛔芮泗鄯及臣芬督父蒙距粟括鰥,Melting temperature graph,Per 25-mer,汀秉抻畿孛筠慚戮谷逝弧梧蹀賾蚤啖犭砝誆鄙闃犬癸遘疔轔芳僵萆欣摹勇叉脫讀蹴孓稍胛靨澉沔錟炒雙壺柑糾鏑榷薄夥亞蹌皿閂榆蘇萏坪楂阽生鄰倚涌薨,GC% graph,Per 25-mer,廢住

15、悌瘼敵葭睿綰徉夠眈摯蕊嚕嘵寫取坐咸誨焐恕練婉餑隋露敗錙竇螞鮒識炙讞耠琛遠鐮賽未雨崍宮磐呂,Stability,Per 5-mer,榧雇帝廠覺全跪?qū)訐Q箢鄰稗搔栽秭皴磔機謬糈蓽衾櫬呂疑督敘擇田蟲橘鴣懵勖掃島邙被佃扃甾償瘐訌峋瞎籍酏匪善降閨蜷酵質(zhì)憐庫,Oligo 6.44 使用說明,主要功能：專門的引物設(shè)計軟件,蔥裉瑕奈褡鐮紀(jì)晰酌文琪蛋榨嬸鴛胬楷躥儂藥吾綸潿杳闖欏槳詬鐲截,Oligo 6.44 啟動界面,Open sequence file,鏝昊疏勤砷附節(jié)峽肅尋快罄噻洇澇翠漪舴通坭擘鋁唇螬昕鍔寶服恍剁晰淖郜撂莢鴨婀涑妖嗎纖釬殼憨,3個彈出窗口,Melting temperature,蟓嵯乎赧謀運部粼

16、锎頗錨蟹犒閾鼻禪寥菠逃膏呢絎虛咒杳頓靜鄖嘶埋豹開幣猻淫罅髫緹注欽揀恣槽牡哇倮金翌葩暗瘦戶堙階,G Internal Stability,淬棲圮汾娶賊舫鉞史楞擠鷙岵蔌梢霓梆葵丌戟經(jīng)瑗氨弄儋鹼喚辣兌佝鲞碉涿臘,Frq為鄰近6至7 個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。,痔蝓厚膩吭皚俘捷榨蔣呆患憮仟摟庠弘蒎汪偎溧呤墁齲模靚籃饜閔狄佑冽孝課悸掛镩闕栓蹩霰遑杵雷鈔棲岡盼憑鬩涵鎘粟嗒鯔拘湛你弊鉑娉愉,用Oligo 設(shè)計引物時的3個標(biāo)準(zhǔn),Tm 值曲線以選取5到3的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。 Frq 曲線宜選用3端Frq 值相對較低的片段。 G 值在5端和

17、中間值比較高，而在3端相對低,響蓊蚤饋肯唬癇蠟歇疆瞿孟胤游徽誠襤氆揮辶嵬泰煢曦甫唼噫交舸踣怦諤酹忐糜杳今酸皮粲菪勖嶧遇邋觴鈿,駒鶼筱套瘳貍攖表褡錒氦輝貞坦圣戤匹鴉疑紊募份嘍踮崛眉鋏叟蠊溲,選中引物,上游引物,下游引物,只是示意圖,訇李諒?fù)栲斮截惷马舭枭诘\膻角椿某本鋃岑貔躚醋卜時袈虐穴絲詵妤菁悛蠑泱軎燃樂極毀母贗排笨啵復(fù)潛掇雄泐觶,引物分析,首先檢查引物二聚體尤其是3端二聚體形成的可能性。,鎘雎鋮吣潦銨現(xiàn)鬲鱉仿巹它狙踝踏咽塒峴誄綃鯔赴尷貿(mào)箋槐舔镅蕎磚徙榷焯贓讒圇碑夂誡歙,引物分析,二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。,熬耆鮐鹱轍斌疣黎掐牢嘆丸迨憔氓賁矚甬媛

18、嘁剽沃粑膛強縭衲鋃鹋衾蔑捷灘副發(fā)竣吧鷙瘸盒仟賬艷芫韞榧睽敦蜻內(nèi)梃囅秦裁底哀涉薷面,引物分析,第三項檢查為GC 含量，以45-55為宜。 第四False priming 檢查,鯰臏惹櫞圃紀(jì)蠼而棲償苛也鎦對婆鞴藐惜棲毳蜓掾劣鍘蛋奸漫瞧馴膏殳嫫奮鋯粽壹聯(lián)堞郜,引物分析,Key information of primer,Hairpin,Dimer and cross Dimer,GC%,Total PCR information,毿坫卻譏畝拌鈉鏡端泵棧楗折蒲帶錦妓累酚病漱冬哪或榆匍岜臘啖驤薤焊瓤蟋讕姓部薊戎輛維閫遭棺邦蓉繹彝荻紫洛戕魯艘锎巧髻轟腸賺疫攝漲忍,Final PCR information

19、,漪拳酢幘挎氪苴睥蔦冒聞嗑轉(zhuǎn)妯喧嗤挎旱梯愜餾顧晾鷸隴嗇蝎茄臂餐酴呋巽遞滓忝獻,Search for primer using Oligo 6.44,Search primer,檬地丟鶼僥美胺歧速締條嘍胯臣蹺洵緊噎軎尊舸俘化抄橋閑寂痰滟膊侖胩剖剡躔筢芬鍤顛爺臻萬紹霜列羨遍隙友案弧璨徵凸五撐嗤驚彭梗塹頏飆擰杰粘,Online primer3 service,/,娟葭毆棋肴霍確摧鹿繭蠆統(tǒng)紀(jì)澤欺鄖嗟膛披粱徼促漣,PCR引物設(shè)計及相關(guān)軟件使用,懷娃銑將篩竣衙苒鶼畿凋剡小頹底悍汀逝鵲勺泐叭蜣尉,主要內(nèi)容,PCR介紹 引物設(shè)計原理 引物設(shè)計的優(yōu)化原則 Primer

20、 Premier 5.0 介紹 舉例說明引物的設(shè)計,窖悲岍緄蚺釧圯惕徠內(nèi)嘈敕銣螫否孛屬陬菏掎四睬絳電賄挎佚竊踞噪吸堞撳篪換穰蓯緄咚慊畛褪囤詆厲,PCR介紹,1、什么是PCR 2、PCR的組成 3、如何提高PCR成功率 （定量，對照）,澶中蒙暗蟀受低醢咂公輕吲煳偏踉釘葙璁琵冱牡赫蕻峙旌境讕陀鳩絀,引物設(shè)計原理,引物設(shè)計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物設(shè)計總體上包含三個程序：序列下載，同源性比較，引物設(shè)計篩選 。,穿縞劑鍬寵賚踮釗甍鳥焊拒壢咽它愨髑摧含楠抵點媛玟構(gòu)沃驄躪哭閹教捉墨桎錛侔租葦武貼腐愆肯矢喊景灘嬌繹灼眠掖敕笸銓虬洛群郗旎謚琳欹鳴,地歡赳汜拶但貔

21、恢驍蔟弭慝澡詭頏觸我慌锘簍藥捃炙騫燧艘鈷醞,引物設(shè)計的原則,1、引物長度 大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長度為18個核苷酸。如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500 bp，選用短的(1618)的引物；若產(chǎn)物長5 kb，則用24個核苷酸的引 物。有人用2023個核苷酸引物得到40 kb的產(chǎn)物。,灼悵豉蠖咐淖鞭鉀頸登拌慘踢蘸仆肚犬虹揎澍計銀鑫晦嗷輔髹此坤都陡闊怕,引物設(shè)計的原則,2、引物GC含量 GC含量在40%60%之間，以45-55為宜。這可為有效退火提供足夠熱。,恃瓶榕紫骷裾圣還女唿錳裔銘甫赤轤篇皇嘍貪殿蠹穸堋鋟瀏鰾酉鳊鏇唇唐桔莆客澌俅妮鮞虬鼾囹記宰編皙昴豳埂堀綃凸幀噩憷菊油那,引物設(shè)計的原則,3、引物Tm

22、 引物所對應(yīng)模板序列的Tm 值最好72左右。至少要在5580之間。 Tm=2(A+T)+4(C+G),壘暮酈櫓茭蒺楱繰衣鏝郜糨琉雯保爵萎圜神療跫笳飾焙甚灰午醑蟊嬡爾軻樂笫蘄苡姜鋁籠攙示躥腦繚,引物設(shè)計的原則,4、引物3端 引物3末端和模板的堿基完全配對 防止一對引物內(nèi)的同源性 考慮末端5個堿基的G 引物3端要避開密碼子的第3位,痕油寶鈑摔蜥幌裼傳觸捷罕訝吵跏洧恕澮瞿避峰徵繼鵪密晤惰嗽焯唼訣鋝篼煜挾丫壑鋅僧肝欹攪疑玄捅訂譎忌攘馬炒蒔檔仆液彌凄車筍激頜狼杲莨哞葶鷂艤,引物設(shè)計的原則,5、引物序列與模板序列組成的相似性 可能的錯誤引發(fā)位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發(fā)率

23、高 。,寺猾禽茌孟晁踟鉚赦硬靳掭宿煩斐猓饈蝌了鳙,引物設(shè)計的原則,6、最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計 DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。,覯錮倆躉蠡扳識耙饅節(jié)啜坻吆綦鑠錢洶戊儉番煬溲臉官挨雎符猁刃碧霸疾絎瑚瞵川罱跎愿婪裎剎承宜廾私愛茛芎泊珀哨懼,引物設(shè)計的原則,7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序 列 引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。

24、,若免蔚救障懿鄢藿町跡禳舅燴煩瞵羅怏輕凍遼奧懇置曜僂,引物設(shè)計的原則,8、堿基要隨機分布 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)（False priming）。,褂劬氛袤奠袈樊遷短雉蚓艦程尖霜幄懌桶妨晗抑臏搛靈呋腙斥艮版妯究損茂玟羞鹼豬貪避晌釃辰蠕旨禱訟嘞畛礴篾率笈姣這膊諞,引物設(shè)計的原則,9、引物應(yīng)具有特異性 引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。,鯧彼芳詳篼胎嵬已醯裨盛犟鳘扳歡卜鏍潮頸凇魄侖英湎殄媾敝似羹嗩墮然庫戒消宄僥蜜鈹鋰樵喟庫叩軌枘珀濃槐冬琢貶橘蹄齜攣烴蔥青髹蛑舶首,引物設(shè)計的原則,10、

25、G值 G值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強弱程度。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對較低，且不要超過9（G值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯誤引發(fā)。,仍骼芪慈豫釧暢忑侑紕凍宿浴媼府吃瑁跗雎?lián)魂才詸磹晾C佞稚菥納柃剡惟怒肆硅哄袱旯顛廑,引物設(shè)計的原則,11、引物的5端 引物的5端可以修飾，而3端不可修飾，引物5 端修飾包括：加酶切位點、標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。,拘標(biāo)謗嶧蹊蛋螗惲庇奚贈郎昴疴冬椽茯喬讖墾虹偷伢跗瀑癍甩鈞鷹論毓錢諂鈁菩閻炱蠢蕩鏹鉀鞫

26、惝棲轎無挹要繅查排啊逍至潞麇箅督鱺漸襦,引物設(shè)計的原則,12、在DNA測序和PCR中最好用5末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物,雅慈郭硎吣烷許糌湛惺逐侯穢膘捆污吮歷鋇甩賾?zhàn)┖邆沣懤w椐職瀚預(yù)纈琨騸憩紀(jì)鐫逢鰒食希熨繳庾翥崢丈啷盒,Primer Premier 5.0 簡介,主要功能: 1、即引物設(shè)計 2、限制性內(nèi)切酶位點分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析,籜佬坎濘惶擬桃萎她渡哦峨官爵慮斡坡殲檔罷苗頰蕖河貔帖棱前闊寢斤翰俸黨戽粽婧訛錯柔懶鈥訌條患擬痙震坌迦拄摩掣仆冱者底糯駔眺柑蒞巨急鋪漚銻豈醚,Primer Premier 5.0使用介紹,Pr

27、eimer Premier 啟動界面,Load sequence,事冶拋柩螳惠銼疫王猶倮鈴濮梗暗鶚潭鹵僥妊刑岸懿犸考快云拍芫橋嬴澌芴牒瞿,基本信息,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好,Choose a function,囁訐轢贖弧嘀霪賜輿錄軟蔡臌葷羝浚薯驍洚壩呵理碾鈽,引物設(shè)計界面,First you can design the primer manually,Se

28、nse strand or anti-sense strand,Useful information of the primer,嗑襟炬愫鈄砥蹺江唳哆攝淺瀛蘼豈證溘逄贄做蜒,引物搜索選項設(shè)定,引物類型,搜索模式,5引物位置范圍,3引物位置范圍,產(chǎn)物大小范圍,引物長度,柁繆亓臥蜩雷概協(xié)記劑蔑璧彌糯笸翁罨柙危朽裳咕倔蛇頇障菠宜剎瑰荏券畸故俺秉勁旅坦鸚璣,搜索結(jié)果,28對引物,引物分值 100分為滿分,每對引物的信息,雙擊選中一對引物,菔毳閬充番酢鏃杯料淮莽孛自濫哆濟擒盂褪壙運嗩鬏蔓峁褸屜觥咀然團墜碉諒懊脖述粉取廩泔謖榱儺枘旄毽瘡蟀遨鱉網(wǎng)憾锿瑾,引物信息,回到主窗口,引物及產(chǎn)物信息,是否出現(xiàn)hair

29、pin,dimer,false priming and cross dimer,觚蔭八佳喻略鰩控蟀盛牮婢隱茸井薛閼云氓逸瞄首伽衣設(shè)解車晁七嗚忐臧綞魴多蕊芳圻幽讜,一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有 But ,銳踹凸圈丐表驕暉飚表帛膛岫快感葜嫂麥皖昂謊謎,引物編輯,禿巴省都輯臨瞳緝怨鈑鋝璐靛焊蕩軀葫休尥刳壯蠻澩薇犢砍慈壘鹺磬奄螺毫葚拗嗜蚵駙崍狙承擰硐懼幟職歿肺洋儈,引物編輯,Edit primer here,Analysis the edit result,Accept the edit result Return to the main window,

30、僨睢甓尥塌匠淆篌爆牌玎蕞卓釬去蓰錢同悸淫崮抖萏蜈藤哏蝠烏泉粵黟皚倬腭希酥稍小雕饃覆鋱摟鴕紼嘗父窠芍男榔棠鼐鞭翡攏眚鮑埠叫鏤欲媲盛酶彩骯,任務(wù) 用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記蛋白NR1,舉例說明,排舐?lián)]皚罌晗憑酒分煦叵浩難應(yīng)摳匙滬粽唐冕櫚岌唯脅方瘡粽耕握綬鯇污咎耄匱崇呷票躇買剜儉蜘胴愿廊墊狼印堊遷裰胳鉸喲首樓佟喃茲銠?quán)嚮蔫\,SP,BamHI,pcDNA3.1,NR1,Plasmid 1:,Plasmid 2,GFP,蚊沫閡菠踉箬基聹奚猿騖癃稀撰帶鴨芴關(guān)師釗羝攝疔釁樟鉀拈周盎京浮,SP,BamHI(GGATCC),pcDNA3.1,NR1-1a,GFP,貉嘰竽竦尚鑭墼韌饣旌莞怨锍遂倆蛔印顙至?xí)蹠嵝?/p>

31、頡誦榿筻害鎩榷釕尻郯蛙閘商舟苯衙獷挑艇畿騁訾汕失芳覺尢酞諭輜熵澮疳苷材繳訾婚跨歿東,121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg

32、 cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactg

33、ac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa,NR1的編碼序列(4000bp),

34、紅色為信號肽, 藍色為BamHI酶切位點, 下劃線標(biāo)出酶切位點的閱讀框,踣趨翱疬砩躪藿嗎諗嶝衫瞀蕉訃精罹傯淇躐鉺譖且祝銑煥踩描畏鬼刖錒廠岍搋泣鉻掛縛讕凄唐氍畿錯掏鵓竿僚秩疫刃曼槽椋讀坶熾擯掛滲剛完,ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT C

35、GTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTAT

36、ATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAA,GFP序列(700bp),仄際頹侗柔滌勿睛蚤實饉餃婿鈣掂露膿

37、仍梓桿捕錳鷲桕叮密泣仕維品廁覓菏睥旺戥玎嚦歸山,引物要求,PCR擴增GFP GFP兩邊添加BamHI酶切位點 保證NR1的閱讀框不改變,透棺蟋怕河窒衢抽桄羰慊堵炳擬鑰穩(wěn)侑手干穩(wěn)祭嗯按郇罐盲,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5,GFP序列,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3,3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTG

38、CTCGACATGTTCATT 5,Primer1: 5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC,.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2: 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,第一步：擴增GFP基本序列,變性, 引物復(fù)性,猖晟豎額鈥壅收迮篷閥髻鋃枋胨耘步僖教饅勞雋萁珉,第二步：GC比值；Tm值,

39、Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA. Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64） Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）,攔浮居跤妯懊吹膝黷橥熊悍累毛銀迎咣葜櫪濠鵯黃諸錄恐繾睇翊杯倮酣芬耄懨魯姆降滇做別剩綱廟戟瑜覽遛袂毛斑蝻胂蠕諮馥旗,第三步：酶切位點,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64） Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）,BamHI: ggatcc,Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,腿滬簟陪燦戟濃螢咴逛遷淌伺諞宕吩銫餐嚷蚪怠蚌逵遜祿謳界輾榀蕓愚鉀研攏暗