PCR技術(shù)的原理、操作及應(yīng)用.ppt

1、PCR技術(shù)的原理、操作和應(yīng)用、湖南省疾病預(yù)防中心微生物檢驗(yàn)科黃一偉、PCR是什么、PCR:polymerasechainreaction，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)、PCR技術(shù)的發(fā)展歷史。 關(guān)于PCR的文章首次由美國的科學(xué)家Kary Mullis等人在Science雜志上發(fā)表了在Science雜志上發(fā)現(xiàn)耐熱性DNA多聚酶Taq酶催化劑(在生活于溫泉的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取的耐熱DNA多聚酶)，預(yù)言了分子時(shí)代的到來。 12月，Science雜志將PCR及其使用的多聚酶命名為最初的“年度分子”。 1993年kary mull is因PCR的發(fā)明獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 PCR技術(shù)

2、的原理1、遺傳物質(zhì)：細(xì)胞核染色體DNA (由脫氧核糖核酸、磷酸鏈及鹽化學(xué)基組成)鹽化學(xué)基(a、t、c、g )呈雙鏈螺旋排列，由鹽化學(xué)基序列的長(zhǎng)度及序列決定了生物多樣性。 例如，人體細(xì)胞球有31億堿基對(duì)，以上述的0.1%的差，人和人之間有300萬堿基對(duì)的差。 PCR的基本工作原理是以擴(kuò)增的DNA分子為鑄造模型，分別以與鑄造模型互補(bǔ)的一對(duì)寡聚核苷酸片段為引物，在DNA多聚酶的作用下，按照半保留復(fù)制的反應(yīng)歷程沿模板鏈延伸到新的DNA合成完成。 PCR技術(shù)原理2、PCR反應(yīng)的基本成分包括7種基本成分：鑄造模型DNA、專一性引物、熱穩(wěn)定DNA多聚酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP )、二價(jià)陽絡(luò)離子、緩沖液和一

3、價(jià)陽絡(luò)離子基本反應(yīng)步驟：改性-退火-拉伸最終通過染料， 例如，重復(fù)dNTP 13步驟2535回合，目標(biāo)DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上，DNA雙螺旋、DNA單鏈和引物的復(fù)原性、DNA變性形成2條單鏈，子鏈將DNA擴(kuò)增2倍，RT-PCR的原理相對(duì)于PCR，在開始階段為、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-Time Quantitative PCR )是在PCR反應(yīng)體系中放入熒光化學(xué)基，利用熒光信號(hào)積蓄實(shí)時(shí)監(jiān)視整個(gè)PCR過程，最后在定標(biāo)曲線中量化分析未知的數(shù)字大板塊的方法常用熒光定量PCR試劑： SYBR Green I Taqman水解作用探針，實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理2，基

4、線在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的前幾個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)變化不大，接近一直線光閾值threshold的設(shè)定一般以PCR反應(yīng)前的15個(gè)周期的熒光信號(hào)作為熒光背景信號(hào)，熒光域值是PCR3-15個(gè)周期的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)離差的10倍，熒光域值設(shè)定為PCR放大器的指數(shù)周期。 CT(Cycle threshold )值表示各PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的結(jié)構(gòu)域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 各數(shù)字大板塊的CT值與該數(shù)字大板塊的開始復(fù)印數(shù)的對(duì)數(shù)具有線性關(guān)系，開始復(fù)印數(shù)越多，則CT值越小，反之亦然。 可以使用已知的開始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品來制作定標(biāo)曲線，橫軸表示開始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱軸表示CT值。 因此，如果得到未知樣品的CT值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲

5、線上計(jì)算出該樣品的初始復(fù)制數(shù)。 當(dāng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理3、Ct和初始十位大板塊的關(guān)系固定為循環(huán)數(shù)時(shí)，熒光信號(hào)與十位大板塊數(shù)成比例，初始DNA量增多，熒光達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)(Ct值)越少，則初始十位大板塊的對(duì)數(shù)濃度與Ct具有線性關(guān)系，是否是樣本的Ct值PCR技術(shù)的局限性需要龐大的已知序列的數(shù)據(jù)庫來建構(gòu)特定的引物并選擇性地放大特定的DNA序列，例如優(yōu)點(diǎn)：特異敏感、快速、簡(jiǎn)便且易于自動(dòng)化。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)效率差異很大，需要根據(jù)因素優(yōu)化反應(yīng)條件。 PCR技術(shù)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度有限。 建立PCR技術(shù)注意事項(xiàng)、污染防治、良好的質(zhì)量管理。在操作時(shí)避免發(fā)生氣溶膠傳播，特別注意陽性樣品的取出，使用一次性物品易

6、耗品，戴手套，頻繁更換，永遠(yuǎn)在最后一步加入核酸，液體分注使用。 引物設(shè)置修訂的合理的Taq酶催化劑擴(kuò)增錯(cuò)誤率高，約1/100鹽化學(xué)基/20循環(huán)的鎂絡(luò)離子濃度對(duì)反應(yīng)效率的影響機(jī)器的穩(wěn)定性、升降溫速度、管的緊貼度等RT-PCR應(yīng)注意防止RNA的分解， 以PCR技術(shù)的操作1流感細(xì)小病毒的RT-PCR和realtimertPCR檢查為例說明PCR技術(shù)的操作步驟的主要機(jī)器是PCR修正、Real-time PCR修正、微量移液器、高速冷凍離心機(jī)、陽離子電泳修正和陽離子電泳槽、凝膠電泳觀測(cè)器或成像系統(tǒng)， PCR技術(shù)的操作2、1 .細(xì)小病毒核酸RNA提取2. RT-PCR反應(yīng)或Real-time RT-PCR

7、反應(yīng)3. UV紫外線燈檢測(cè)或在電腦上直接讀取結(jié)果，流感細(xì)小病毒核酸提取1， 試驗(yàn)材料QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit (或QIAGEN公司的QIAmp Viral RNA Mini Kit，操作類) -巰基乙醇(-mercaptoethanol) 70%乙醇無菌及DNA、RNA酶催化劑的1.5ml離心管10l、20l、200l， 1000l加樣器和槍頭可變調(diào)制13K微冷凍離心機(jī)被檢流感病毒200l、流感病毒核酸提取2、1 .將取樣液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或細(xì)小病毒培養(yǎng)物(雞胚尿囊液或細(xì)胞球培養(yǎng)液) 200ul放入1.5ml的eppendorf管中，制成2，550 ul的rl

8、t 將3.5ul-巰基乙醇和70%的2步混合液600ul吸出到柱中，在12，000r pm下離心15秒鐘，將回收管中的離心液4、柱扔掉，返回到回收管中，將2步剩馀的混合液全部吸出到柱中，12， 000rpm，離心15秒，拋棄離心液5，離心15秒6，取出干凈的2ml的托說唱樂管，將離心的柱轉(zhuǎn)移到新的托說唱樂管，柱中加入500ul Wash Buffer RPE液，12， 加入000rpm，15秒7離心，丟棄托說唱樂管的離心液，在柱中加入500ulwashbufff，2分鐘8離心，將柱轉(zhuǎn)移到干凈的1.5ml的eppendrof管中，在柱中加入20-50ul的Rnase-free Water 離心1

9、分鐘，收集離心液的即時(shí)實(shí)驗(yàn)或-20以下的保存試劑盒請(qǐng)注意QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit (catalog #74104 ) :使用試劑盒中的RPE液前加入44ml的無水乙醇，使最終體積為55ml。 RT-PCR反應(yīng)1、試驗(yàn)材料qiagenonesteprt-PCR kit (cat no 210212 ) RNase inhibitor 40 u/l上游引物200ng/l下游引物200ng/l放大H5亞型禽流感細(xì)小病毒的引物序列， h5- 133605-gccattccacataccc-3和h5-:-ctcccctgcttgctatg-3提取的RNA和rt。 在每個(gè)管道中添加

10、5英寸一步式PCR緩沖器、51ul 10 mmdntps 1英寸0.13英寸減震器(40 u/ul ) 14.3英寸減震器。 RT-PCR反應(yīng)3、OneStep RT-PCR反應(yīng)條件為： 50作用30分鐘(逆轉(zhuǎn)錄： RNA cDNA) 95作用15分鐘(使反轉(zhuǎn)錄酶等失活) 94改性30秒55退火30秒72延長(zhǎng)30秒第3步，34凝膠電泳緩沖液配方10TBE緩沖液(每升) : tris 107.8 gboricacid 55.0 g EDTA (Na2 ) 8.2g 10 tae緩沖液(每升):Tris48.4g冰冰乙酸11.42g0.5mol/ledtta 100伏特陽離子電泳30分鐘，紫外觀察

11、和攝影圖片拍攝記錄。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)2、RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及結(jié)果判定、Real-time RT-PCR的操作1、細(xì)小病毒核酸RNA提取：同RT-PCR Real-time RT-PCR :比薩反轉(zhuǎn)錄酶n/4根(n為PCR管數(shù))、被檢RNA 10l、添加RNA后4 反應(yīng)條件為42 30min； 92 3min； 9210秒、4530秒721分5周期。 92 10sec、60 30sec 40周期、60點(diǎn)設(shè)置熒光收集。 Real-time RT-PCR的操作2、結(jié)果分析條件設(shè)定讀取檢查結(jié)果。 閾值設(shè)定的原則可以根據(jù)閾值線正好超過正常陰性對(duì)照品的放大曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性的標(biāo)準(zhǔn)或者

12、機(jī)器噪聲的狀況來調(diào)整。 CT(Cycle threshold )值表示各PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的結(jié)構(gòu)域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 各數(shù)字大板塊的CT值與該數(shù)字大板塊的開始復(fù)印數(shù)的對(duì)數(shù)具有線性關(guān)系，開始復(fù)印數(shù)越多，則CT值越小，反之亦然。 可以使用已知的開始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品來制作定標(biāo)曲線，橫軸表示開始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱軸表示CT值。 因此，如果得到未知樣品的CT值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的初始復(fù)制數(shù)。 基線是指在PCR放大反應(yīng)的前幾個(gè)周期中熒光信號(hào)的變化不大、接近一直線的直線，即基線。 光閾值threshold的設(shè)定一般以PCR反應(yīng)前的15個(gè)周期的熒光信號(hào)作為熒光背景信號(hào)，熒光區(qū)域值是P

13、CR3-15個(gè)周期的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)離差的10倍，熒光區(qū)域值設(shè)定為PCR放大器的指數(shù)周期。 Real-time PCR的操作3、結(jié)果判定1、質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)1.1陰性對(duì)照的檢查結(jié)果為陰性。 1.2陽性對(duì)照的Ct值必須在28.0以下。 否則，這次實(shí)驗(yàn)視為無效。 2 .結(jié)果判斷為2.1 Ct值無數(shù)值的樣品為陰性樣品。 2.2 Ct值為30.0的樣本為陽性。 2.3Ct值超過30.0的樣品建議重做。 重做結(jié)果沒有數(shù)值的為陰性，沒有數(shù)值的為陽性。PCR技術(shù)的應(yīng)用、基因克隆、測(cè)序和表達(dá)等法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定遺傳性疾病檢查、腫瘤診斷、病原體檢查等，基因克隆和表達(dá)，DNA指紋技術(shù)1，1， 1984年英吉利遺傳學(xué)

14、家Alec Jeffreys在對(duì)肌紅蛋白進(jìn)行DNA序列研究時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)非功能DNA的這15鹽化學(xué)基左右的DNA片段，在個(gè)體間重復(fù)的頻率和位置顯著不同，Jeffreys首先在自各兒的DNA上進(jìn)行研究，驗(yàn)證這一技術(shù)，如果有血緣關(guān)系則認(rèn)為是這些個(gè)的Jeffreys命名的技術(shù)是DNA指紋技術(shù)(DNA指紋印刷)。DNA指紋技術(shù)2、采集血樣(毛發(fā)、精液、口腔黏膜細(xì)胞球)，分離DNA，將PCR選定的DNA片段放大比較，統(tǒng)訂分析可以判斷犯人是否有血緣關(guān)系。 分子診斷學(xué)、分子診斷學(xué)基于分子生物學(xué)理論，利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法研究人體內(nèi)因或外因性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療和轉(zhuǎn)移提供信息和決定依據(jù)。 分子診斷學(xué)的發(fā)展階段，分子診斷學(xué)經(jīng)歷了大體3個(gè)階段： (1)使用DNA分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷；(2)基于PCR技術(shù)的DNA診斷，特別是定量PCR和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)的應(yīng)用，不僅檢測(cè)宿主中存在的多種DNA和RNA病原體量，而且檢測(cè)多基因病細(xì)胞球中mRNA的表達(dá)量分子診斷學(xué)的發(fā)展方向，分子診斷學(xué)的發(fā)展方向： (1)分子診斷的內(nèi)容從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達(dá)產(chǎn)物(mRNA，蛋白質(zhì))的全面診斷。 (2)分子診斷策略從利用分子雜交、P