腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

1、,腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 三、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)檢測(cè) 四、腫瘤細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸 五、總結(jié),一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),1、取材,腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)材料主要來(lái)源于外科手術(shù)或活檢的瘤組織。取材部位非常重要體積較大的腫瘤組織中央常有退變或壞死區(qū)，取材時(shí)應(yīng)去掉壞死組織，故應(yīng)去瘤體的周?chē)鼋M織做培養(yǎng)，癌性轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)或癌性胸腹水是較好的培養(yǎng)材料。取材后應(yīng)盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可按正常組織儲(chǔ)存方法保存，將組織剪成1mm3左右的小塊，放入培養(yǎng)液中，置4保存，但存放時(shí)間不宜超過(guò)24h。取材時(shí)應(yīng)注意無(wú)菌操作。,類(lèi)固醇細(xì)胞瘤,一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),2、分離,培養(yǎng)液中1

2、mm3的組織塊，僅有少量處于周?chē)募?xì)胞可能生存和生長(zhǎng)。若要獲得大量生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，須將組織分散開(kāi)，使細(xì)胞解離出來(lái)。目前分散組織的方法有機(jī)械和化學(xué)兩種，要根據(jù)組織種類(lèi)所需和培養(yǎng)要求，采用適宜的手段。 機(jī)械法：機(jī)械分散發(fā)、剪切分離法 消化分離法：胰蛋白酶消化法、膠原酶法,一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),2、分離,剪切分離法:在進(jìn)行組織塊移植培養(yǎng)時(shí)，可以采用剪切發(fā)，即將組織剪或 切成小塊然后分離培養(yǎng)。 步驟：1、首先將經(jīng)修整和沖洗過(guò)的組織塊放入小燒杯中，用剪刀反復(fù)剪 切組織至似糊狀。 2、用吸管吸取緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)液加入燒杯中，反復(fù)輕輕吹打， 低速離心去上清剩下的組織小塊即可用于培養(yǎng)。,一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

3、,2、分離,胰蛋白酶消化法：適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝等 組織。對(duì)傳代細(xì)胞效果也很好，胰蛋白酶消化效果主要與 PH值、溫度、濃度、組織塊大小和硬度有關(guān)。,1、將組織塊剪切成12mm3 2、加入胰蛋白酶37熱消化 3、過(guò)篩200目 4、必要時(shí)重復(fù) 5、加入胰蛋白酶冷消化6-24h 6、沉淀去上清 7、加新的胰蛋白酶37消化30min 8、過(guò)篩 9、離心去上清 10、加入血清培養(yǎng)基吹打 11、計(jì)數(shù) 12、接種瓶培養(yǎng),熱消化,冷消化,共同步驟,一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),2、分離,二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),1、原代培養(yǎng),我們?yōu)楹我M(jìn)行原代培養(yǎng)？ 1、建立各種細(xì)胞系的第一步 2、是獲取細(xì)胞的

4、主要手段 3、組織和細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生大變化 4、最接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，適合做藥物測(cè)試、細(xì)胞分化等試驗(yàn) 原代培養(yǎng)方法有組織塊法、消化培養(yǎng)法、器官培養(yǎng)法等。最基本和最常用的是組織塊法和消化培養(yǎng)法。,二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),1、原代培養(yǎng),組織塊培養(yǎng)法是一種簡(jiǎn)便易行且成功率較高的常用原代培養(yǎng)方法。即將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)瓶可根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)的需要作適當(dāng)處理。例如預(yù)先涂以膠原薄層，以利于上皮樣細(xì)胞等的生長(zhǎng)，涂以多聚賴(lài)氨酸培養(yǎng)需旺細(xì)胞等，適用于組織量少的原代培養(yǎng)。,1、取材修剪沖洗 2、剪成1mm3小塊 3、移入培養(yǎng)瓶 4、分布組織小塊間距5cm 5、翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加入適量培養(yǎng)

5、液， 37靜置2-4h 6、翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng) 7、原代細(xì)胞生長(zhǎng),二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),1、原代培養(yǎng),這種方法采用前述的組織消化分散法，將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，易于從外界吸收養(yǎng)分和排出代謝產(chǎn)物，可以很快得到大量活細(xì)胞，細(xì)胞也可能在短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)成片。適用于培養(yǎng)大量組織，原代細(xì)胞產(chǎn)量高；但步驟繁瑣、易污染，一些消化酶價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本高。 步驟：1、按消化分離法收獲細(xì)胞。 2、待組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，則終止消化，過(guò)篩200目 過(guò)掉組織塊，大塊組織繼續(xù)消化。 3、收集過(guò)濾消化液離心1000rpm/min，5min，去上清加含血清 培養(yǎng)液，輕輕吹打形成

6、細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種到培養(yǎng)瓶，置 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。,二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),1、原代培養(yǎng),器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或器官組織塊后，不進(jìn)行組織分離，保持其原有器官的結(jié)構(gòu)和連接，直接將器官或器官的一部分在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中保持器官或其一部分組織的結(jié)構(gòu)和功能。器官培養(yǎng)主要強(qiáng)調(diào)器官組織的相對(duì)完整性，重點(diǎn)觀(guān)察細(xì)胞正常聯(lián)系和排列情況下，它們之間的相互影響，和局部環(huán)境的失物調(diào)節(jié)作用等。,二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),2、傳代培養(yǎng),腫瘤細(xì)胞的傳代是人們利用培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞作為進(jìn)一步研究的靶材料。細(xì)胞性狀的好壞直接影響研究的結(jié)果。常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞的傳代多指細(xì)胞系的傳代，大致分為兩種：一種是貼壁型細(xì)胞傳代；另一種是懸浮型細(xì)胞傳

7、代。 注意事項(xiàng)：1、細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前（80%）， 不要急于傳代。 2、不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因而要根據(jù)需要注意觀(guān)察 及時(shí)處理。 3、吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷。 4、首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞盡可能適應(yīng)新環(huán) 境利于細(xì)胞生存和增殖。,二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),2、傳代培養(yǎng),1、貼壁型細(xì)胞的傳代 步驟：1、選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞一瓶，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)液， 緩沖液洗一遍。 2、從無(wú)細(xì)胞側(cè)加入0.25%的胰蛋白酶，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使消化液 浸沒(méi)細(xì)胞1min左右。 3、翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，放置5-10min，觀(guān)察細(xì)胞出現(xiàn)布紋孔狀為止。 4、倒掉消化液。 5

8、、沿細(xì)胞面加入適量生長(zhǎng)液,洗下細(xì)胞，吹散，按1:2或1:3傳 代培養(yǎng)。 6、37培養(yǎng)，接種后30min可貼壁。48h換液一次，3-4d形 成單層細(xì)胞。,二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),2、傳代培養(yǎng),CHO貼壁細(xì)胞,開(kāi)始培養(yǎng) 48h形成致密單層,二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),2、傳代培養(yǎng),加入0.25%胰酶,皺縮邊緣、間隙增大、不再致密,二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),2、傳代培養(yǎng),基本皺縮變圓 完全皺縮變圓，棄去胰酶，將細(xì)胞洗下,二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng),2、傳代培養(yǎng),2、懸浮型細(xì)胞傳代 步驟：1、選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞一瓶，輕輕加入適量生長(zhǎng)液。 2、用無(wú)菌吸管輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮，吸出一半的細(xì)胞懸液， 加入到新的培養(yǎng)瓶中。 3、37，

9、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。 4、如細(xì)胞濃度較高，可按1:3進(jìn)行傳代。,三、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)檢測(cè),1、目的,一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)成為形態(tài)單一的細(xì)胞群體后，不論是用于短期實(shí)驗(yàn)研究，還是用于建立細(xì)胞系，都需要進(jìn)行一系列的細(xì)胞生物學(xué)鑒定。 其目的在于： 1、 證明培養(yǎng)細(xì)胞是否來(lái)自原來(lái)的腫瘤細(xì)胞： 2、說(shuō)明腫瘤組織類(lèi)型； 3、描述腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。,三、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)檢測(cè),2、檢查項(xiàng)目,1、組織起源：對(duì)培養(yǎng)材料應(yīng)說(shuō)明起源于哪個(gè)胚層，什么器官的何種組織； 來(lái) 源于什么樣的供體，患有何種疾病，輔助鑒別細(xì)胞的來(lái)源。 2、形態(tài)學(xué)觀(guān)察：細(xì)胞一般形態(tài)，如細(xì)胞形狀、核漿比例、染色質(zhì)

10、 和 核仁大 小及多少，以及細(xì)胞骨架的排列等。培養(yǎng)底細(xì)胞多呈多角 形大小異型性明顯，核漿比例倒置有豐富的三極或多 極有絲分裂，核仁清晰、多個(gè)，微絲、微管排列紊亂等。,人成骨肉瘤細(xì)胞 人白血病細(xì)胞,三、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)檢測(cè),2、檢查項(xiàng)目,細(xì)胞生長(zhǎng)特征：檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、細(xì)胞核分裂指數(shù)、倍增時(shí)間以及細(xì)胞周期 等。癌細(xì)胞失去正常的接觸抑制，細(xì)胞呈多層生長(zhǎng)，細(xì)胞倍增 時(shí)間較短，細(xì)胞生長(zhǎng)密度增加，細(xì)胞核分裂指數(shù)較高，并具有 無(wú)限增殖能力，細(xì)胞侵襲能力較強(qiáng)等特性。,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn),三、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)檢測(cè),2、檢查項(xiàng)目,軟瓊脂培養(yǎng)：軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)主要用于非貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，某些惡性腫瘤 細(xì)

11、胞，不僅在貼壁狀態(tài)下能增殖，在懸浮狀態(tài)下能增殖，其在軟 瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，這種方法可用于細(xì)胞分 化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗(yàn)等方面。 步驟：1、制備1.2%和0.7%濃度的瓊脂糖溶液，滅菌備用。 2、制備20%FBS+2x1640+2xPS營(yíng)養(yǎng)液。 3、鋪下膠：1:1混合1.2%與營(yíng)養(yǎng)液，混勻，凝固，備用。 4、鋪上膠：1:1混合0.7%與營(yíng)養(yǎng)液，加入細(xì)胞懸液， 混勻鋪到下膠上，凝固后培養(yǎng)箱培養(yǎng)，10-14d。,三、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)檢測(cè),2、檢查項(xiàng)目,細(xì)胞核型分析：檢測(cè)核型特點(diǎn)、染色體數(shù)量、有無(wú)標(biāo)記染色體、染色體帶型等。 癌細(xì)胞染色體數(shù)日和結(jié)構(gòu)異常，大多為異倍

12、體，并可出現(xiàn)異常 的標(biāo)記染色體。,一個(gè)癌細(xì)胞的染色體共104條，包括許多異常的染色體,三、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)檢測(cè),2、檢查項(xiàng)目,動(dòng)物致瘤試驗(yàn)：用(120)x106個(gè)mL細(xì)胞密度癌細(xì)胞懸液接種裸鼠背部 皮下，能夠生長(zhǎng)成為實(shí)體瘤，其組織學(xué)形態(tài)與原發(fā)腫瘤相似。,Balb/c裸鼠體內(nèi)的干細(xì)胞致瘤實(shí)驗(yàn),四、腫瘤細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸,1、凍存,細(xì)胞凍存是指將細(xì)胞混懸于凍存液中，以一定的冷凍速度將細(xì)胞懸液降至-70以下，常于-196的液氮罐中長(zhǎng)期保存。細(xì)胞凍存可保持傳代細(xì)胞某些性質(zhì)的相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)也減少了長(zhǎng)期傳代中支原體等微生物污染的機(jī)會(huì)。 原理： 向?qū)⒁獌龃娴募?xì)胞中加入陳存液，內(nèi)含10甘油或二甲亞

13、礬，可 降低冰點(diǎn)，減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，從而降低了細(xì)胞在凍存過(guò) 程中的損傷程度。細(xì)胞可在-70以下冰箱或液氮罐中長(zhǎng)期保存。,四、腫瘤細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸,1、凍存,方法 1、選用指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存細(xì)胞前1d換液1次。 2、貼壁細(xì)胞需用常規(guī)方法將細(xì)胞消化下來(lái)，制備成單細(xì)胞懸液。收集單 細(xì)胞懸液，然后離心(1000r/min，離心5min)。 3、棄上清，用凍存液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至(110)x106/ml。 4、將細(xì)胞懸液按凍存管大小分裝(0.5-1.5ml/管)，扭緊管盟，注明細(xì)胞 名稱(chēng)和凍存日期。 5、將上述凍存管在4下放置30 min，然后將凍存管移人-80超低溫 冰箱或

14、液氮中保存。 6、為保持細(xì)胞最大存活率，般采用逐漸降溫的方法，標(biāo)準(zhǔn)冷凍速為 -2-1/min，當(dāng)溫度達(dá)到-25時(shí)下降速率可加速至-10-5/min， 到-100可迅速放入液氮罐中。,四、腫瘤細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸,1、凍存,細(xì)胞凍存步驟,四、腫瘤細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸,2、復(fù)蘇,細(xì)胞復(fù)蘇指按一定的復(fù)溫速度將凍存的細(xì)胞恢復(fù)到常溫。當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài) 時(shí)，凍存細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常，代謝反應(yīng)即可恢復(fù)。 方法： 1、 取出凍存管，立即放入37-40水浴鍋中，快速搖晃直至完全融化 (應(yīng)在1min內(nèi)完成)。 2、 離心細(xì)胞(1000r/min，5min)后，棄上清。用少量生長(zhǎng)液懸浮細(xì) 胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中配成

15、所需要的細(xì)胞濃度，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 3、 無(wú)菌操作打開(kāi)凍存管，將細(xì)胞懸液吸到培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足生長(zhǎng)液后， 置5CO2 37)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。46h后，待細(xì)胞貼壁，輕輕倒 掉含凍存液的生長(zhǎng)液，換生長(zhǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。,四、腫瘤細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸,2、復(fù)蘇,細(xì)胞凍存、復(fù)蘇步驟,注意事項(xiàng)： 1、應(yīng)在1min內(nèi)使凍存細(xì)胞完全融化，復(fù)溫速度太慢會(huì)造成細(xì)胞損傷。 2、復(fù)蘇過(guò)程中應(yīng)戴手套和護(hù)目鏡。凍存管可能涌入液氮，解凍時(shí)凍存管 內(nèi)的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸，應(yīng)予以注意。,四、腫瘤細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸,3、運(yùn)輸,在購(gòu)買(mǎi)和交換培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需根據(jù)保存方式和運(yùn)輸時(shí)間，采用適當(dāng)?shù)倪\(yùn)輸方法。 1、充液法運(yùn)輸：選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，待接近或剛剛連接成片后，去掉培養(yǎng) 液，加入新鮮培養(yǎng)液至培養(yǎng)瓶頸部(保留少量空氣)，擰緊 瓶蓋，然后用封口膜將瓶口密封。到達(dá)目的地后，棄去多 余培養(yǎng)液，置37培養(yǎng)，次日傳代。 2、冰瓶運(yùn)輸：