6 第五章 診斷用制品制造技術(shù).ppt

1、第四章,第五節(jié)診斷用生物制品制造技術(shù),診斷用生物制品（diagnosticum）,包括診斷用抗原、診斷用抗體（血清）和標記抗體等三類。 該類制劑的最基本要求是特異性強和敏感度高。生物制劑用于診斷的原理(略) 診斷液: 利用細菌、病毒和寄生蟲培養(yǎng)物、代謝物、組分（提取物）和反應(yīng)物等有效物及動物血清等材料制成的，專門用于動物傳染病和寄生蟲病診斷和檢疫的一大類制品。,一、診斷抗原,（一）血清學(xué)診斷抗原 血清學(xué)診斷抗原是用已知微生物和寄生蟲、微生物和寄生蟲的組分或浸出物、代謝產(chǎn)物、感染動物組織制成，用以檢測血清中的相應(yīng)抗體 該類制劑可與血清中的相應(yīng)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，形成可見或可以測知的復(fù)合物，以確診

2、動物是否受微生物感染或接觸過某種抗原。 常用的抗原有凝集反應(yīng)抗原、沉淀反應(yīng)抗原、補體結(jié)合反應(yīng)抗原和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）抗原等。,1、凝集反應(yīng)抗原,凝集反應(yīng)抗原是顆粒性抗原，如細菌和紅細胞等。 在有電解質(zhì)存在條件下，能與特異性抗體結(jié)合，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 舉例: 布魯氏菌凝集反應(yīng)抗原、馬流產(chǎn)凝集反應(yīng)抗原、雞白痢全血凝集反應(yīng)抗原、豬傳染性萎縮性鼻炎I相菌抗原和雞源支原體平板凝集反應(yīng)抗原等。,布魯氏菌凝集反應(yīng)抗原制造及使用方法,菌種 抗原性良好的23種布魯氏菌。菌落須為光滑型。 制造要點 將檢定合格的種子液，接種于適于布魯氏菌生長的瓊脂扁瓶上(或液體通氣培養(yǎng)基)，37培養(yǎng)23d； 加

3、入適量0.5石炭酸生理鹽水，洗下培養(yǎng)物，經(jīng)紗布過濾，涂片雜菌檢查。 熱凝集和吖啶黃凝集試驗合格的過濾菌液，在7080水浴中殺菌lh，觀察無凝集塊出現(xiàn)，離心,將下沉菌體重新懸浮于0.5石炭酸生理鹽水中，此即為濃菌液，置210冰箱中保存?zhèn)溆谩?標化,用石炭酸生理鹽水將濃菌液稀釋為1:20、1:24、1:28、1:32、1:36，5個不同稀釋度，將標準陽性血清稀釋為1:300、1:400、1:500、1:600、1:700，5個稀釋度。 將稀釋的抗原和血清排成方陣進行試管凝集試驗，每只反應(yīng)管中加抗原和血清各0.5ml，37 24h觀察結(jié)果。,觀察/測定,當標準陽性血清對標準抗原的凝集價為1:1000

4、“+”時，在血清1:1000稀釋度呈現(xiàn)“+”，1:1200呈現(xiàn)“-”，“”或“+”的凝集現(xiàn)象的抗原最小稀釋度，即為濃菌液應(yīng)稀釋的倍數(shù)。在下表中(舉例)濃菌液的稀釋倍數(shù)為1:28，此即為標化抗原的初測結(jié)果。 然后再以同法作一次測定，如果第二次結(jié)果仍為1:28倍，則此批濃菌液作1:28倍稀釋，即為使用液。出廠的抗原原液比使用液濃20倍。,菌 液 稀 釋 血 清 最 初 稀 釋 度 1:300 1:400 1:500 1:600 1:700 加入抗原后的血清稀釋度 1:600 1:800 1:1000 1:1200 1:1400 1:20 + + + - - 1:24 + + + - - 1:28

5、+ + + + - 1:32 + + + + - 1:36 + + + + - 標準抗原 + + + - - (1:20),成品檢驗,抗原應(yīng)為乳白色均勻菌液，沒有搖不散的凝塊或雜質(zhì),沒有任何細菌生長。對標準陽性血清1:1000倍稀釋出現(xiàn)“+”凝集，對陰性血清1:251:200稀釋均不出現(xiàn)凝集。,2、沉淀反應(yīng)抗原,沉淀反應(yīng)抗原為膠體狀態(tài)的可溶性抗原，如細菌和寄生蟲的浸出液、培養(yǎng)濾液、組織浸出液、動物血清和動物蛋白等，與相應(yīng)抗體相遇，在二者比例合適并有電解質(zhì)存在時，抗原抗體相互交聯(lián)形成免疫復(fù)合物達一定大時，即出現(xiàn)肉眼可見的沉淀。 沉淀抗原是細胞浸出成分，為細微的膠體溶液，單個抗原的體積小而總面積大

6、，出現(xiàn)反應(yīng)需要的抗體量多，故試驗時常采取稀釋抗原加不稀釋的血清，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價。,沉淀反應(yīng)抗原分類,由于使用方法不同，沉淀反應(yīng)抗原又分為環(huán)狀反應(yīng)抗原，如炭疽動物臟器抗原；絮狀反應(yīng)抗原，如測定抗毒素效價的絮狀反應(yīng)抗原；瓊脂擴散反應(yīng)抗原和免疫電泳抗原等。 我國用于畜禽沉淀反應(yīng)抗原有馬傳染性貧血瓊脂擴散反應(yīng)(AGP)抗原、雞傳染性法氏囊病AGP抗原、及馬立克氏?。∕D）AGP抗原等多種。,馬立克氏病（MD）AGP抗原,用1113日齡的鴨胚制備成纖維細胞單層培養(yǎng)物，24h后接種MD病毒感染雞的脾細胞懸液。接種后24h，吸出接種物并更換營養(yǎng)液，接毒后約6d，消化細胞，分瓶，傳3代后，

7、細胞培養(yǎng)物即可用于制備MD沉淀抗原。 一般在75%以上的細胞出現(xiàn)病變時進行收獲，在-20以下凍結(jié)，室溫融化，如此反復(fù)凍融3次，經(jīng)適當濃縮后即為抗原。用雙擴散法進行診斷。,3、補體結(jié)合反應(yīng)（CF）抗原,補體結(jié)合反應(yīng)包括反應(yīng)系統(tǒng)（檢測系統(tǒng)）和指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）。 反應(yīng)系統(tǒng)為抗原和抗體。 指示系統(tǒng)是綿羊紅細胞及溶血素。 補體可與反應(yīng)系統(tǒng)的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，也可與綿羊紅細胞-溶血素的復(fù)合物結(jié)合而引起溶血，以觀察溶血與否來判定反應(yīng)的結(jié)果。 在補體的參與下可明顯地提高抗原、抗體特異性反應(yīng)的敏感性。 我國生產(chǎn)的獸用補體結(jié)合反應(yīng)抗原有馬傳染性CF抗原、鼻疽CF抗原、布魯氏菌CF抗原和鉤端螺旋體CF抗原等

8、。,鼻疽補體結(jié)合反應(yīng)抗原的制造及檢驗程序, 菌種 用13株抗原性良好的鼻疽桿菌，接種在4%甘油瓊脂培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)2d，經(jīng)檢定合格者后用生理鹽水洗下，作為種子培養(yǎng)物。 制造要點 將種子培養(yǎng)物均勻地接種于甘油瓊脂扁瓶，37培養(yǎng)34d，挑選生長典型和無雜菌污染者，用滅菌含0.5%石碳酸生理鹽水洗下培養(yǎng)物，121 滅菌30min，置于215冷暗處浸泡24個月，吸取上清液即為抗原，按常規(guī)方法進行無菌檢驗。, 效價測定,將抗原用生理鹽水作1:10、1:50、1:75、1:100、1:150、1:200、1:300、1:400和1:500稀釋。 用生理鹽水將兩份鼻疽陽性血清分別稀釋成1：10，1:25、

9、1:50、1:75和1:100，在5859水浴滅活30min，按表4.5、4.6和4.7測定抗原效價。 對兩份陽性血清的各種稀釋液均發(fā)生最強的抑制溶血現(xiàn)象的抗原稀釋度，即為抗原效價。 在本例中，抗原效價為1:150。制成的抗原效價在1:100以上認為可用。測定抗原效價后，取一份陰性馬血清作1:5和1:10稀釋，在5859滅活30min，然后與新制抗原的一個工作量作補體結(jié)合反應(yīng)，必須為陰性，方認為合格。,（二）變態(tài)反應(yīng)抗原,細胞內(nèi)寄生菌(如鼻疽桿菌，結(jié)核分支桿菌和布魯氏菌等)，在傳染過程中引起以細胞免疫為主的第IV型變態(tài)反應(yīng)，即感染機體再次遇到同種病原菌或其代謝產(chǎn)物時出現(xiàn)一種具有高度特異性和敏感

10、性的異常反應(yīng)。據(jù)此,臨床上常用于診斷某些傳染病。 引起變態(tài)反應(yīng)的抗原物質(zhì)稱為變應(yīng)原（變態(tài)反應(yīng)抗原），如鼻疽菌素、結(jié)核菌素和布魯氏菌水解素等。布魯氏菌水解素是變態(tài)反應(yīng)原性良好的布魯氏菌水解物，專用于綿羊和山羊布魯氏菌病的變態(tài)反應(yīng)診斷。羊的皮膚變態(tài)反應(yīng)在愈后11.5年才逐漸消失，所以對污染羊群檢出率高于血清學(xué)方法檢測結(jié)果。,布魯氏菌水解素制造方法,1菌種 培養(yǎng)特性和生化性狀典型、熱凝集試驗和吖啶黃凝集試驗陰性、菌落為光滑型的布魯氏菌，變態(tài)反應(yīng)原性良好，對布魯氏菌陽性血清具有高度的凝集性。,2. 制造要點,將種子菌液接種于肝湯瓊脂扁瓶培養(yǎng)基上37培養(yǎng)27d（或液體通氣培養(yǎng)36h）， 用0.5%石炭酸

11、生理鹽水洗下生長良好的培養(yǎng)物，在7080水浴中加熱滅菌lh， 離心沉淀去上清，菌體懸浮于0.5%石炭酸生理鹽水中，再離心沉淀洗一次。 菌體懸浮于0.5%硫酸水溶液中，使懸液濃度大致為布魯氏菌試管凝集抗原液的2倍，盛于玻璃瓶中，121加熱3040min，促使菌體水解。,制造要點,室溫或冰箱放置1224h，吸取上清液，用NaOH液調(diào)整為pH6.87.0， 再靜置沉淀未水解部分。 上清液用蔡氏濾器過濾后7580 加熱， 凱氏法測定總氮量（用標準水解素作對照），用滅菌蒸餾水稀釋濾液，使其最終總氮量為0.40.5mg/ml（或與標準的水解素相同）。,3質(zhì)量標準,除按成品檢驗的有關(guān)規(guī)定進行外，須做如下檢驗

12、： 安全檢驗：取體重1822g小鼠6只，腹腔注射水解素0.5m1，觀察10d，應(yīng)全部健活。,效力檢驗：,取體重350-500g豚鼠10只，皮下接種適量布魯氏菌令其感染致敏， 經(jīng)30-40d，用標準水解素1:10稀釋液0.1ml接種于臀部皮內(nèi)， 經(jīng)24h和48h觀察反應(yīng)面積在100mm以上，即可用作正式試驗。,正式試驗,然后剃去合格豚鼠腹部兩側(cè)的被毛， 被檢水解素和標準水解素分別作5和10倍稀釋， 一側(cè)腹部皮內(nèi)注射0.1ml被檢水解素， 另側(cè)注射同量的標準水解素， 同時用兩只未致敏的健康豚鼠，依前述方法和劑量注射被檢水解素，和標準水解素作為對照， 經(jīng)24h和48h各觀察一次，被檢水解素腫脹面積的

13、總和應(yīng)與標準水解素腫脹面積的總和一致，或比值不超過0.1,對照豚鼠無反應(yīng)為合格。,二、診斷抗體,診斷抗體包括診斷血清和單克隆抗體等。 診斷血清簡稱抗血清（antiserum），是指利用血清反應(yīng)以鑒別微生物、鑒定病原血清型或診斷傳染病的一種含已知的特異性抗體的血清。 通常以抗原免疫接種動物制成。有些血清則需再經(jīng)吸收除去非特異性抗體成分后供診斷用。,分類和定義,含有多種血清型抗體的血清稱為多價診斷血清，只對一個型的稱為單價診斷血清或稱因子血清。 單含鞭毛抗體成分的血清稱為H血清， 單含菌體成分的血清稱為O血清。 針對菌毛和針對莢膜的均稱為K血清。 血清中的抗體一般是由多個抗原決定簇刺激不同B細胞克

14、隆而產(chǎn)生的，故稱之為多克隆抗體（polyclonal antibody）。 由一個B細胞克隆所分泌的抗體為單克隆抗體（monoclonal antibody）。,三、標記抗體,具有示蹤效應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)與抗體結(jié)合后，仍保持其示蹤活性和與相應(yīng)抗原特異結(jié)合能力，此種結(jié)合物稱為標記抗體。 可借以示蹤和檢測抗原的存在及其含量，多用于鑒定抗原和診斷疾病。 常用的標記物有熒光素、酶和放射性同位素。,（一）熒光素標記抗體技術(shù),將提純的抗體球蛋白用冷pH7.2 PBS稀釋成10-20mg/ml的濃度，按蛋白量的1/80和1/100加入異硫氰酸熒光黃（FITC）， 先用pH9.5 0.5M碳酸鹽緩沖液溶解FITC，

15、 于5min內(nèi)滴加到抗體球蛋白溶液中， 最后補加碳酸鹽緩沖液，使其總量為抗體球蛋白溶液量的1/10；,標記,在4攪拌標記1215h（2025 12h）： 用大量的pH7.2 PBS透析4h， 用Sephadex G-50凝膠濾除標記抗體中游離熒光素，通過DEAE纖維素層析除去過高標記和未標記的蛋白分子； 最后測定效價和特異性，分裝保存。 標本染色分直接染色法和間接染色法,（二）酶標記抗體技術(shù),常用方法有戊二醛一步法、戊二醛二步法和過碘酸鈉氧化法三種。本文只介紹過碘酸鈉氧化法。 其原理是辣根過氧化物酶（HRP）含18%碳水化合物，過碘酸鈉將酶分子表面的多糖鏈氧化為醛基，用硼氫化鈉中和多余的過碘酸

16、。酶上的醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合。,標記步驟：, 取5mg HRP溶于1.0ml新配制的0.3mo1 pH8.2的NaHCO3，溶液中。 滴加0.1ml l% 2,4二硝基氟苯（FDNB）無水乙醇溶液，室溫避光輕輕攪拌1h。加入1.0m1 0.06M過碘酸鈉（NaIO4）水溶液，室溫輕攪30min。,標記步驟：,加入lml 0.16M乙二醇，室溫避光輕攪，然后裝人透析袋中。 于1000ml pH9.5 0.01M碳酸鈉緩沖液中，4C透析過夜，其間換液3次。 吸出透析袋中液體，加入每毫升含IgG 5mg的pH9.5 0.01M碳酸鈉緩沖液1m1，室溫避光輕輕攪拌2-3h。 加硼氫化鈉（N

17、aBH4）5mg，置4 3h或過夜。,標記步驟：,逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液，置41h后，4000r/min離心15min，棄上清，沉淀。再用50%飽和硫酸銨沉淀2次。沉淀物溶于少量pH7.4 0.01M磷酸緩沖鹽水液，裝人透析袋，以同樣緩沖鹽水液充分透析至無銨離子，l0000rpm離心30min，上清液即為酶標記抗體。 該類制劑主要用于ELISA試驗。,（三）放射性同位素標記抗體技術(shù),目前多使用同位素碘作標記。125I半衰期較長（60d）、同位素豐度大、輻射損傷小和計數(shù)率較高。先將提純的免疫抗體 IgG與同位素125I置試管中，再加入氯胺T。由于碘化反應(yīng)進行很快，故碘及氯胺T必須在攪拌下加入

18、，以免碘化不均勻，約5min后加入還原劑偏重亞硫酸鈉，阻斷氯胺T作用以終止碘化反應(yīng)，再加入碘化鉀作為碘離子的載體，以減少蛋白分子吸附試劑中數(shù)量不穩(wěn)定的放射性碘離子。最后用過葡聚糖G-50柱等方法將游離碘及其他放射性雜質(zhì)與標記抗體分開。 該類標記抗體可用于檢測相應(yīng)的抗原。,第六節(jié) 治療用生物制品制造技術(shù),一、概 述 治療用生物制品是指用于治療動物傳染病的制品。一般是利用微生物及其代謝產(chǎn)物等作為免疫原，經(jīng)反復(fù)多次注射同一動物體，所生產(chǎn)的一類含高效價抗體，主要包括高度免疫血清、卵黃抗體和牛奶抗體等。 高度免疫血清簡稱“高免血清”（hyperimmune serum），又稱免疫血清（immune se

19、rum）或抗血清（antiserum）?？煞譃榭共⊙搴涂苟舅貎深?。該類制劑治療或預(yù)防某些相應(yīng)的疾病，具有很高的特異性。也用作被動免疫，緊急預(yù)防和治療相應(yīng)傳染病。,（一）作用機理,含有特異性的免疫球蛋白抗體輸入動物體后，動物即可被動地獲得了抗體，從而形成免疫力，即所謂的人工被動免疫。 當動物己感染某種病原微生物發(fā)生傳染病時，注射大量的抗病血清后，由于抗體的作用，可抑制動物體內(nèi)的病原體繼續(xù)繁殖，并協(xié)助體內(nèi)正常防御機能，消滅病原微生物，使病畜逐漸恢復(fù)健康。 該作用具有很強的特異性，一種血清只對相應(yīng)的一種病原微生物或毒素起作用。,（二）應(yīng)用,用作緊急預(yù)防注射，通常是在已經(jīng)發(fā)生傳染病或受到傳染病威脅的

20、情況下使用，其優(yōu)點是注射后立即產(chǎn)生免疫。 但是這種免疫力維持時間較短，一般僅23周，因此，在注射血清后23周仍需再注射一次疫苗，才能獲得較長時間的抗傳染能力。,舉例,抗炭疽血清、 破傷風(fēng)抗毒素、 抗羔羊痢疾血清、抗氣腫疽血清、 抗豬瘟血清、 抗小鵝瘟血清、 抗傳染性法氏囊病血清； 抗犬瘟熱血清等， 其中，破傷風(fēng)抗毒素血清的效果最佳，應(yīng)用最廣。,二、制造高免血清用動物的選擇與管理,(一) 動物的選擇 1. 動物的品種 用于制備免疫血清的動物有馬、牛、山羊、綿羊、豬、兔、犬、雞和鵝等。 制備抗菌和抗毒素血清多用異種動物，通常用馬和牛等大動物制備。如破傷風(fēng)抗毒素多用青年馬制備，抗豬丹毒血清多用牛制備

21、。 抗病毒血清的制備多用同種動物，如犬瘟熱血清用犬制備，抗豬瘟血清用豬制備。 總的來看，制備免疫血清用馬較多，因為血清滲出率較高，外觀顏色較好。也可使用多種動物制備一種抗毒素血清，以避免發(fā)生過敏反應(yīng)或血清病。選定動物應(yīng)有一定的數(shù)量，一個批次應(yīng)用多頭動物。,2. 動物的年齡及健康情況,通常選擇體型較大、性情溫馴、體質(zhì)強健的青壯年動物為宜。馬以年齡38歲、體重350kg以上者為宜；牛以310歲、體重300400kg以上為宜；豬以50kg以上，年齡612月齡為宜；家免體重需達2kg以上為好。 供制造免疫血清的動物，必須從非疫區(qū)選購，經(jīng)過嚴格檢疫,并經(jīng)隔離觀察，每日測溫兩次，觀察二周以上，確認健康者方

22、可應(yīng)用。最好自繁自養(yǎng)動物，或由專門飼養(yǎng)場提供標準化的SPF或其他級別的動物。 對某些購進動物進行必要的和對制備抗血清無影響的預(yù)防免疫接種。,（二）動物的管理,符合要求的動物：動物應(yīng)在隔離條件下飼養(yǎng)，杜絕高免時強毒及發(fā)病時散毒。應(yīng)詳細登記每頭動物的來源、品種、性別、年齡、體重、特征及營養(yǎng)狀況、體溫記錄和檢疫結(jié)果等，建立制造血清動物的檔案。 嚴格的管理制度。：由專人負責(zé)喂養(yǎng)和精心管理。加強日常飼養(yǎng)管理，喂以營養(yǎng)豐富的飼料，并加喂多汁飼料，最好能經(jīng)常喂給一些胡蘿卜，還須喂給適量的食鹽和含鈣的補充飼料。 在高免和采血期間，每日要檢測體溫兩次，隨時觀察其健康情況。每日至少運動4h。在生產(chǎn)過程中，若發(fā)現(xiàn)健

23、康狀況異?；蛴谢疾】梢蓵r，應(yīng)停止注射抗原和采血，并進行隔離治療。 動物采血前1d，禁食喂水，避免血中出現(xiàn)乳糜。,三、免疫原,良好的免疫原應(yīng)具備3個條件： 異物性、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和一定的物理性狀。 一般來說，顆粒性抗原較可溶性抗原的抗原性強，球形分子的蛋白質(zhì)較纖維形分子的免疫原性強，聚合狀態(tài)的蛋白質(zhì)較單體狀態(tài)的蛋白質(zhì)免疫原性強。 分子量較小和抗原性較低的蛋白質(zhì)應(yīng)吸附于載體上，才可獲得較高的免疫原性。,制造抗病血清所用的免疫抗原,要根據(jù)病原微生物的培養(yǎng)特性，采用不同的方法生產(chǎn)。免疫原提純和濃縮十分必要。 根據(jù)需要，有時可加合適的免疫佐劑。,1.抗細菌免疫血清制備,基礎(chǔ)免疫用抗原多為疫苗或死菌，而高度

24、免疫的抗原，一般選用毒力較強的毒株。 菌種接種于最適生長的培養(yǎng)基，按常規(guī)方法進行培養(yǎng)。通?；罹乖栌眯迈r培養(yǎng)菌液，并按規(guī)定的濃度使用，培養(yǎng)時間較死菌抗原稍短為好，多用1618h 培養(yǎng)物，經(jīng)純粹檢查，證明無雜菌者，即可作為免疫抗原。,抗細菌免疫血清制備,在固體培養(yǎng)基上繁殖，加適量滅菌生理鹽水或緩沖鹽水洗下菌苔，制成均勻的菌懸浮液； 用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，應(yīng)在生長菌數(shù)高峰期（對數(shù)期）收獲；為減少由培養(yǎng)基帶來的非特異性成分，可通過離心，棄上清，再將菌體制成一定濃度的細菌懸浮液，作為免疫原。,2.抗病毒免疫血清制備,以病毒為免疫原，須通過反復(fù)凍融或超聲裂解方法，將病毒從細胞中釋放出來，并盡可能地提高病毒

25、滴度和免疫原性。 如抗豬瘟血清，基礎(chǔ)免疫的抗原，可用豬瘟兔化弱毒疫苗；高度免疫抗原，則用豬瘟血毒或臟淋毒乳劑等強毒。 豬接種豬瘟強毒發(fā)病后57d，當出現(xiàn)體溫升高及典型豬瘟癥狀時，由動脈放血，收集全部血液，經(jīng)無菌檢驗合格后即可作為抗原使用。 接種豬瘟強毒的豬，除血中含有病毒外，脾臟和淋巴結(jié)也有大量的病毒，可采集并制成乳劑，作為抗原使用。,3. 抗毒素血清制備,免疫原可用類毒素、毒素或全培養(yǎng)物（活菌加毒素），但后兩者只有在需要加強免疫刺激的情況下才應(yīng)用，一般多用類毒素作免疫原。,四、免疫程序,免疫程序分為： 第一階段為基礎(chǔ)免疫，第二階段為高度免疫。 （一）基礎(chǔ)免疫 基礎(chǔ)免疫通常先用本病的疫苗按預(yù)防

26、劑量作第一次免疫，經(jīng)13周再用較大劑量的滅活苗或活菌或特制的滅活抗原再免疫13次，即完成基礎(chǔ)免疫。 基礎(chǔ)免疫大多數(shù)13次即可，抗原無須過多過強，可為高度免疫產(chǎn)生有效的回憶應(yīng)答打下基礎(chǔ)。,（二）高度免疫,高度免疫亦稱加強免疫，一般在基礎(chǔ)免疫后24周開始進行。 注射的抗原采用強毒制造，微生物的毒力越強，一般免疫原性越好。免疫劑量逐漸增加，每次注射抗原間隔時間為310d，多為57d。 高免的注射次數(shù)要視血清抗體效價而定。有的只要大量注射12次強毒抗原，即可完成高度免疫；有的則要注射10次以上，才能產(chǎn)生高效價的免疫血清。,（三）免疫途徑,免疫原注射途徑一般采用皮下或肌肉注射。如果免疫劑量大，應(yīng)采用多部

27、位注射法，尤其應(yīng)用油佐劑抗原時。 免疫程序?qū)χ苽涓呙庋宸浅Ｖ匾莆湛贵w消長規(guī)律，適時免疫和采血尤為重要。 不能機械地定期免疫和采血。如有的動物在長期免疫和采血過程中，可能會現(xiàn)抗體達到一定水平后，反而逐漸降低，對免疫原的刺激無應(yīng)答反應(yīng)，這可能與免疫劑量、免疫間隔時間和免疫原中混雜免疫抑制物有關(guān)。此時，應(yīng)給免疫動物足夠時間休息，解除免疫抑制作用，并調(diào)整免疫程序。,五、血液采集與血清提取,按照免疫程序完成免疫的動物，經(jīng)采血檢驗（試血），血清效價達到合格標準時，即可采血。 （一）采血次數(shù)和方法 一般血清抗體的效價高峰在最后一次免疫后的710d。采血可以全放血或部分采血，采血時應(yīng)盡可能地作到無菌操作

28、。 全放血者，在最后一次高免之后的811d進行放血。 多次采血者，按體重每千克采血約10m1，經(jīng)35d第二次采血，按體重每公斤采810m1。第二次采血后經(jīng)23d，注射足量免疫原。,動物采血,不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者淘汰。采血前，動物應(yīng)禁食24h，但需飲水以防止血脂過高 豚鼠由心臟穿刺采血。 家兔可以從心臟采血或頸靜脈、頸動脈放血，少量采血可通過耳靜脈采取。 馬由頸動脈或頸靜脈放血。 羊可以從頸靜脈采血或頸動脈、頸靜脈放血。 家禽可以心臟穿刺采血或頸動脈放血。,（二）血清的分離,采血時一般不加抗凝劑，全血在室溫中自然凝固，在滅菌容器中使之與空氣有較大的接觸面。待血液凝固后進行剝離或

29、者將凝血切成若干小塊，并使其與容器剝離。先置于37 12h，然后置于4冰箱過夜，次日離心收集血清。 無菌的血清，組批分裝，保存于之-15半成品庫，待抽檢合格后交成品庫保存出。 如果采集的血量較大時，可采用自然凝固加壓法。即將動物血直接采集于事先用滅菌生理鹽水或PBS液濕潤的玻璃筒內(nèi)，置室溫自然凝約24h，有血清析出時，每采血筒中加入滅菌的不銹鋼壓鉈，經(jīng)24h后，用虹吸法將血清吸入滅菌瓶中，加入0.5%石炭酸或0.02%硫柳汞防腐。,六、免疫血清的使用,正確診斷，盡早應(yīng)用。特別是治療時，應(yīng)用越早效果越好。 血清的用量根據(jù)動物的體重和年齡不同而確定。預(yù)防量，大動物1020m1，中等動物（豬、羊等）

30、510ml。以皮下注射為主，也可肌肉注射。 治療量需要按預(yù)防量加倍，并根據(jù)病情采取重復(fù)注射。注射方法以靜脈為好，以使其盡速奏效。 靜脈注射血清的量較大時，最好將血清加溫至30左右再注射。 皮下或肌肉注射，當血清量大時，可分幾個部位注射，并加揉壓使之分散。,不同源的血清過敏反應(yīng),對不同動物源的血清（異源血清），有時可能引起過敏反應(yīng)。 如果在注射后數(shù)分鐘或半小時內(nèi)，動物出現(xiàn)不安、呼吸急促、戰(zhàn)抖、出汗等癥狀，應(yīng)立即搶救。 搶救的方法，可皮下注射 1:100腎上腺素，大動物510m1，中小動物25m1，反應(yīng)嚴重者有時搶救不及時，常造成損失。,七、卵黃抗體的制備,產(chǎn)蛋雞（鴨和鵝）感染某些病原后，其血清和

31、蛋黃內(nèi)均可產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。因此，通過免疫注射產(chǎn)蛋雞，即可由其生產(chǎn)的蛋黃中提取相應(yīng)的抗體，并可用于相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療，該類制劑稱為卵黃抗體（yak antibody）。 近幾年來，卵黃抗體已成為免疫血清的重要替代品。卵黃抗體可以在一定程度上克服血清抗體成本較高、生產(chǎn)周期較長的弱點，并且具有用同批動物連續(xù)生產(chǎn)的優(yōu)點。 但是，卵黃抗體有潛伏野毒的危險，對生產(chǎn)用雞應(yīng)做認真的檢疫。,(IBD)卵黃抗體液的制備過程,擇健康無病的產(chǎn)蛋雞群，開產(chǎn)前或已開產(chǎn)后，以免疫原性良好的IBD油佐劑滅活苗肌肉注射，2m1/只，以后每隔710d，重復(fù)注射一次，疫苗劑量適度遞增，三免后定期檢測卵黃抗體水平，待瓊擴效價達1:

32、128時開始收集高免蛋，4貯存?zhèn)溆谩?瓊擴效價降到1:64時停止收蛋，可再進行加強免疫。高免蛋合格時間大約持續(xù)一個月。,制造,將高免蛋用0.5%新潔爾滅溶液浸泡或清洗消毒，再用酒精棉擦拭蛋殼，打取雞卵分離蛋黃。根據(jù)卵黃抗體瓊擴效價水平加入生理鹽水進行稀釋（稀釋后的卵黃抗體瓊擴效價不低于1：161：32），加青、鏈霉素各1000U （g）/m1，加硫柳汞濃度達1/萬，充分攪拌后分裝于滅菌瓶內(nèi)4 貯存。 每批都進行效價測定、細菌培養(yǎng)和安全檢驗，合格后方可出廠。,一、冷凍真空干燥原理與特點,一、冷凍真空干燥原理與特點 冷凍真空干燥，又稱冷凍干燥（freeze drying），簡稱凍干。它是物質(zhì)干燥的一種方法。冷凍干燥的過程包括：將含有大量水分的生物活性物質(zhì)先行降溫凍結(jié)成固體，再在真空和適度加溫（一般不超過40）條件下使固體水分子直接升華成水汽抽出，最后使生物活性物質(zhì)形成疏松、多孔樣固狀物。,優(yōu)點,能有效地保護熱敏性物質(zhì)的生物活性，如微生物、抗原物質(zhì)、血清制品、酶和激素等經(jīng)冷凍干燥后生物活性影響甚微。 能有效地降低氧分子對微生物和酶等活性物質(zhì)的作用，從而保護物質(zhì)