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文檔簡介
1、第四章,第五節(jié)診斷用生物制品制造技術(shù),診斷用生物制品(diagnosticum),包括診斷用抗原、診斷用抗體(血清)和標記抗體等三類。 該類制劑的最基本要求是特異性強和敏感度高。生物制劑用于診斷的原理(略) 診斷液: 利用細菌、病毒和寄生蟲培養(yǎng)物、代謝物、組分(提取物)和反應物等有效物及動物血清等材料制成的,專門用于動物傳染病和寄生蟲病診斷和檢疫的一大類制品。,一、診斷抗原,(一)血清學診斷抗原 血清學診斷抗原是用已知微生物和寄生蟲、微生物和寄生蟲的組分或浸出物、代謝產(chǎn)物、感染動物組織制成,用以檢測血清中的相應抗體 該類制劑可與血清中的相應抗體發(fā)生特異性反應,形成可見或可以測知的復合物,以確診
2、動物是否受微生物感染或接觸過某種抗原。 常用的抗原有凝集反應抗原、沉淀反應抗原、補體結(jié)合反應抗原和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)抗原等。,1、凝集反應抗原,凝集反應抗原是顆粒性抗原,如細菌和紅細胞等。 在有電解質(zhì)存在條件下,能與特異性抗體結(jié)合,形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 舉例: 布魯氏菌凝集反應抗原、馬流產(chǎn)凝集反應抗原、雞白痢全血凝集反應抗原、豬傳染性萎縮性鼻炎I相菌抗原和雞源支原體平板凝集反應抗原等。,布魯氏菌凝集反應抗原制造及使用方法,菌種 抗原性良好的23種布魯氏菌。菌落須為光滑型。 制造要點 將檢定合格的種子液,接種于適于布魯氏菌生長的瓊脂扁瓶上(或液體通氣培養(yǎng)基),37培養(yǎng)23d; 加
3、入適量0.5石炭酸生理鹽水,洗下培養(yǎng)物,經(jīng)紗布過濾,涂片雜菌檢查。 熱凝集和吖啶黃凝集試驗合格的過濾菌液,在7080水浴中殺菌lh,觀察無凝集塊出現(xiàn),離心,將下沉菌體重新懸浮于0.5石炭酸生理鹽水中,此即為濃菌液,置210冰箱中保存?zhèn)溆谩?標化,用石炭酸生理鹽水將濃菌液稀釋為1:20、1:24、1:28、1:32、1:36,5個不同稀釋度,將標準陽性血清稀釋為1:300、1:400、1:500、1:600、1:700,5個稀釋度。 將稀釋的抗原和血清排成方陣進行試管凝集試驗,每只反應管中加抗原和血清各0.5ml,37 24h觀察結(jié)果。,觀察/測定,當標準陽性血清對標準抗原的凝集價為1:1000
4、“+”時,在血清1:1000稀釋度呈現(xiàn)“+”,1:1200呈現(xiàn)“-”,“”或“+”的凝集現(xiàn)象的抗原最小稀釋度,即為濃菌液應稀釋的倍數(shù)。在下表中(舉例)濃菌液的稀釋倍數(shù)為1:28,此即為標化抗原的初測結(jié)果。 然后再以同法作一次測定,如果第二次結(jié)果仍為1:28倍,則此批濃菌液作1:28倍稀釋,即為使用液。出廠的抗原原液比使用液濃20倍。,菌 液 稀 釋 血 清 最 初 稀 釋 度 1:300 1:400 1:500 1:600 1:700 加入抗原后的血清稀釋度 1:600 1:800 1:1000 1:1200 1:1400 1:20 + + + - - 1:24 + + + - - 1:28
5、+ + + + - 1:32 + + + + - 1:36 + + + + - 標準抗原 + + + - - (1:20),成品檢驗,抗原應為乳白色均勻菌液,沒有搖不散的凝塊或雜質(zhì),沒有任何細菌生長。對標準陽性血清1:1000倍稀釋出現(xiàn)“+”凝集,對陰性血清1:251:200稀釋均不出現(xiàn)凝集。,2、沉淀反應抗原,沉淀反應抗原為膠體狀態(tài)的可溶性抗原,如細菌和寄生蟲的浸出液、培養(yǎng)濾液、組織浸出液、動物血清和動物蛋白等,與相應抗體相遇,在二者比例合適并有電解質(zhì)存在時,抗原抗體相互交聯(lián)形成免疫復合物達一定大時,即出現(xiàn)肉眼可見的沉淀。 沉淀抗原是細胞浸出成分,為細微的膠體溶液,單個抗原的體積小而總面積大
6、,出現(xiàn)反應需要的抗體量多,故試驗時常采取稀釋抗原加不稀釋的血清,并以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價。,沉淀反應抗原分類,由于使用方法不同,沉淀反應抗原又分為環(huán)狀反應抗原,如炭疽動物臟器抗原;絮狀反應抗原,如測定抗毒素效價的絮狀反應抗原;瓊脂擴散反應抗原和免疫電泳抗原等。 我國用于畜禽沉淀反應抗原有馬傳染性貧血瓊脂擴散反應(AGP)抗原、雞傳染性法氏囊病AGP抗原、及馬立克氏病(MD)AGP抗原等多種。,馬立克氏?。∕D)AGP抗原,用1113日齡的鴨胚制備成纖維細胞單層培養(yǎng)物,24h后接種MD病毒感染雞的脾細胞懸液。接種后24h,吸出接種物并更換營養(yǎng)液,接毒后約6d,消化細胞,分瓶,傳3代后,
7、細胞培養(yǎng)物即可用于制備MD沉淀抗原。 一般在75%以上的細胞出現(xiàn)病變時進行收獲,在-20以下凍結(jié),室溫融化,如此反復凍融3次,經(jīng)適當濃縮后即為抗原。用雙擴散法進行診斷。,3、補體結(jié)合反應(CF)抗原,補體結(jié)合反應包括反應系統(tǒng)(檢測系統(tǒng))和指示系統(tǒng)(溶血系統(tǒng))。 反應系統(tǒng)為抗原和抗體。 指示系統(tǒng)是綿羊紅細胞及溶血素。 補體可與反應系統(tǒng)的抗原-抗體復合物結(jié)合,也可與綿羊紅細胞-溶血素的復合物結(jié)合而引起溶血,以觀察溶血與否來判定反應的結(jié)果。 在補體的參與下可明顯地提高抗原、抗體特異性反應的敏感性。 我國生產(chǎn)的獸用補體結(jié)合反應抗原有馬傳染性CF抗原、鼻疽CF抗原、布魯氏菌CF抗原和鉤端螺旋體CF抗原等
8、。,鼻疽補體結(jié)合反應抗原的制造及檢驗程序, 菌種 用13株抗原性良好的鼻疽桿菌,接種在4%甘油瓊脂培養(yǎng)基上,37培養(yǎng)2d,經(jīng)檢定合格者后用生理鹽水洗下,作為種子培養(yǎng)物。 制造要點 將種子培養(yǎng)物均勻地接種于甘油瓊脂扁瓶,37培養(yǎng)34d,挑選生長典型和無雜菌污染者,用滅菌含0.5%石碳酸生理鹽水洗下培養(yǎng)物,121 滅菌30min,置于215冷暗處浸泡24個月,吸取上清液即為抗原,按常規(guī)方法進行無菌檢驗。, 效價測定,將抗原用生理鹽水作1:10、1:50、1:75、1:100、1:150、1:200、1:300、1:400和1:500稀釋。 用生理鹽水將兩份鼻疽陽性血清分別稀釋成1:10,1:25、
9、1:50、1:75和1:100,在5859水浴滅活30min,按表4.5、4.6和4.7測定抗原效價。 對兩份陽性血清的各種稀釋液均發(fā)生最強的抑制溶血現(xiàn)象的抗原稀釋度,即為抗原效價。 在本例中,抗原效價為1:150。制成的抗原效價在1:100以上認為可用。測定抗原效價后,取一份陰性馬血清作1:5和1:10稀釋,在5859滅活30min,然后與新制抗原的一個工作量作補體結(jié)合反應,必須為陰性,方認為合格。,(二)變態(tài)反應抗原,細胞內(nèi)寄生菌(如鼻疽桿菌,結(jié)核分支桿菌和布魯氏菌等),在傳染過程中引起以細胞免疫為主的第IV型變態(tài)反應,即感染機體再次遇到同種病原菌或其代謝產(chǎn)物時出現(xiàn)一種具有高度特異性和敏感
10、性的異常反應。據(jù)此,臨床上常用于診斷某些傳染病。 引起變態(tài)反應的抗原物質(zhì)稱為變應原(變態(tài)反應抗原),如鼻疽菌素、結(jié)核菌素和布魯氏菌水解素等。布魯氏菌水解素是變態(tài)反應原性良好的布魯氏菌水解物,專用于綿羊和山羊布魯氏菌病的變態(tài)反應診斷。羊的皮膚變態(tài)反應在愈后11.5年才逐漸消失,所以對污染羊群檢出率高于血清學方法檢測結(jié)果。,布魯氏菌水解素制造方法,1菌種 培養(yǎng)特性和生化性狀典型、熱凝集試驗和吖啶黃凝集試驗陰性、菌落為光滑型的布魯氏菌,變態(tài)反應原性良好,對布魯氏菌陽性血清具有高度的凝集性。,2. 制造要點,將種子菌液接種于肝湯瓊脂扁瓶培養(yǎng)基上37培養(yǎng)27d(或液體通氣培養(yǎng)36h), 用0.5%石炭酸
11、生理鹽水洗下生長良好的培養(yǎng)物,在7080水浴中加熱滅菌lh, 離心沉淀去上清,菌體懸浮于0.5%石炭酸生理鹽水中,再離心沉淀洗一次。 菌體懸浮于0.5%硫酸水溶液中,使懸液濃度大致為布魯氏菌試管凝集抗原液的2倍,盛于玻璃瓶中,121加熱3040min,促使菌體水解。,制造要點,室溫或冰箱放置1224h,吸取上清液,用NaOH液調(diào)整為pH6.87.0, 再靜置沉淀未水解部分。 上清液用蔡氏濾器過濾后7580 加熱, 凱氏法測定總氮量(用標準水解素作對照),用滅菌蒸餾水稀釋濾液,使其最終總氮量為0.40.5mg/ml(或與標準的水解素相同)。,3質(zhì)量標準,除按成品檢驗的有關(guān)規(guī)定進行外,須做如下檢驗
12、: 安全檢驗:取體重1822g小鼠6只,腹腔注射水解素0.5m1,觀察10d,應全部健活。,效力檢驗:,取體重350-500g豚鼠10只,皮下接種適量布魯氏菌令其感染致敏, 經(jīng)30-40d,用標準水解素1:10稀釋液0.1ml接種于臀部皮內(nèi), 經(jīng)24h和48h觀察反應面積在100mm以上,即可用作正式試驗。,正式試驗,然后剃去合格豚鼠腹部兩側(cè)的被毛, 被檢水解素和標準水解素分別作5和10倍稀釋, 一側(cè)腹部皮內(nèi)注射0.1ml被檢水解素, 另側(cè)注射同量的標準水解素, 同時用兩只未致敏的健康豚鼠,依前述方法和劑量注射被檢水解素,和標準水解素作為對照, 經(jīng)24h和48h各觀察一次,被檢水解素腫脹面積的
13、總和應與標準水解素腫脹面積的總和一致,或比值不超過0.1,對照豚鼠無反應為合格。,二、診斷抗體,診斷抗體包括診斷血清和單克隆抗體等。 診斷血清簡稱抗血清(antiserum),是指利用血清反應以鑒別微生物、鑒定病原血清型或診斷傳染病的一種含已知的特異性抗體的血清。 通常以抗原免疫接種動物制成。有些血清則需再經(jīng)吸收除去非特異性抗體成分后供診斷用。,分類和定義,含有多種血清型抗體的血清稱為多價診斷血清,只對一個型的稱為單價診斷血清或稱因子血清。 單含鞭毛抗體成分的血清稱為H血清, 單含菌體成分的血清稱為O血清。 針對菌毛和針對莢膜的均稱為K血清。 血清中的抗體一般是由多個抗原決定簇刺激不同B細胞克
14、隆而產(chǎn)生的,故稱之為多克隆抗體(polyclonal antibody)。 由一個B細胞克隆所分泌的抗體為單克隆抗體(monoclonal antibody)。,三、標記抗體,具有示蹤效應的化學物質(zhì)與抗體結(jié)合后,仍保持其示蹤活性和與相應抗原特異結(jié)合能力,此種結(jié)合物稱為標記抗體。 可借以示蹤和檢測抗原的存在及其含量,多用于鑒定抗原和診斷疾病。 常用的標記物有熒光素、酶和放射性同位素。,(一)熒光素標記抗體技術(shù),將提純的抗體球蛋白用冷pH7.2 PBS稀釋成10-20mg/ml的濃度,按蛋白量的1/80和1/100加入異硫氰酸熒光黃(FITC), 先用pH9.5 0.5M碳酸鹽緩沖液溶解FITC,
15、 于5min內(nèi)滴加到抗體球蛋白溶液中, 最后補加碳酸鹽緩沖液,使其總量為抗體球蛋白溶液量的1/10;,標記,在4攪拌標記1215h(2025 12h): 用大量的pH7.2 PBS透析4h, 用Sephadex G-50凝膠濾除標記抗體中游離熒光素,通過DEAE纖維素層析除去過高標記和未標記的蛋白分子; 最后測定效價和特異性,分裝保存。 標本染色分直接染色法和間接染色法,(二)酶標記抗體技術(shù),常用方法有戊二醛一步法、戊二醛二步法和過碘酸鈉氧化法三種。本文只介紹過碘酸鈉氧化法。 其原理是辣根過氧化物酶(HRP)含18%碳水化合物,過碘酸鈉將酶分子表面的多糖鏈氧化為醛基,用硼氫化鈉中和多余的過碘酸
16、。酶上的醛基很活潑,可與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合。,標記步驟:, 取5mg HRP溶于1.0ml新配制的0.3mo1 pH8.2的NaHCO3,溶液中。 滴加0.1ml l% 2,4二硝基氟苯(FDNB)無水乙醇溶液,室溫避光輕輕攪拌1h。加入1.0m1 0.06M過碘酸鈉(NaIO4)水溶液,室溫輕攪30min。,標記步驟:,加入lml 0.16M乙二醇,室溫避光輕攪,然后裝人透析袋中。 于1000ml pH9.5 0.01M碳酸鈉緩沖液中,4C透析過夜,其間換液3次。 吸出透析袋中液體,加入每毫升含IgG 5mg的pH9.5 0.01M碳酸鈉緩沖液1m1,室溫避光輕輕攪拌2-3h。 加硼氫化鈉(N
17、aBH4)5mg,置4 3h或過夜。,標記步驟:,逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液,置41h后,4000r/min離心15min,棄上清,沉淀。再用50%飽和硫酸銨沉淀2次。沉淀物溶于少量pH7.4 0.01M磷酸緩沖鹽水液,裝人透析袋,以同樣緩沖鹽水液充分透析至無銨離子,l0000rpm離心30min,上清液即為酶標記抗體。 該類制劑主要用于ELISA試驗。,(三)放射性同位素標記抗體技術(shù),目前多使用同位素碘作標記。125I半衰期較長(60d)、同位素豐度大、輻射損傷小和計數(shù)率較高。先將提純的免疫抗體 IgG與同位素125I置試管中,再加入氯胺T。由于碘化反應進行很快,故碘及氯胺T必須在攪拌下加入
18、,以免碘化不均勻,約5min后加入還原劑偏重亞硫酸鈉,阻斷氯胺T作用以終止碘化反應,再加入碘化鉀作為碘離子的載體,以減少蛋白分子吸附試劑中數(shù)量不穩(wěn)定的放射性碘離子。最后用過葡聚糖G-50柱等方法將游離碘及其他放射性雜質(zhì)與標記抗體分開。 該類標記抗體可用于檢測相應的抗原。,第六節(jié) 治療用生物制品制造技術(shù),一、概 述 治療用生物制品是指用于治療動物傳染病的制品。一般是利用微生物及其代謝產(chǎn)物等作為免疫原,經(jīng)反復多次注射同一動物體,所生產(chǎn)的一類含高效價抗體,主要包括高度免疫血清、卵黃抗體和牛奶抗體等。 高度免疫血清簡稱“高免血清”(hyperimmune serum),又稱免疫血清(immune se
19、rum)或抗血清(antiserum)。可分為抗病血清和抗毒素兩類。該類制劑治療或預防某些相應的疾病,具有很高的特異性。也用作被動免疫,緊急預防和治療相應傳染病。,(一)作用機理,含有特異性的免疫球蛋白抗體輸入動物體后,動物即可被動地獲得了抗體,從而形成免疫力,即所謂的人工被動免疫。 當動物己感染某種病原微生物發(fā)生傳染病時,注射大量的抗病血清后,由于抗體的作用,可抑制動物體內(nèi)的病原體繼續(xù)繁殖,并協(xié)助體內(nèi)正常防御機能,消滅病原微生物,使病畜逐漸恢復健康。 該作用具有很強的特異性,一種血清只對相應的一種病原微生物或毒素起作用。,(二)應用,用作緊急預防注射,通常是在已經(jīng)發(fā)生傳染病或受到傳染病威脅的
20、情況下使用,其優(yōu)點是注射后立即產(chǎn)生免疫。 但是這種免疫力維持時間較短,一般僅23周,因此,在注射血清后23周仍需再注射一次疫苗,才能獲得較長時間的抗傳染能力。,舉例,抗炭疽血清、 破傷風抗毒素、 抗羔羊痢疾血清、抗氣腫疽血清、 抗豬瘟血清、 抗小鵝瘟血清、 抗傳染性法氏囊病血清; 抗犬瘟熱血清等, 其中,破傷風抗毒素血清的效果最佳,應用最廣。,二、制造高免血清用動物的選擇與管理,(一) 動物的選擇 1. 動物的品種 用于制備免疫血清的動物有馬、牛、山羊、綿羊、豬、兔、犬、雞和鵝等。 制備抗菌和抗毒素血清多用異種動物,通常用馬和牛等大動物制備。如破傷風抗毒素多用青年馬制備,抗豬丹毒血清多用牛制備
21、。 抗病毒血清的制備多用同種動物,如犬瘟熱血清用犬制備,抗豬瘟血清用豬制備。 總的來看,制備免疫血清用馬較多,因為血清滲出率較高,外觀顏色較好。也可使用多種動物制備一種抗毒素血清,以避免發(fā)生過敏反應或血清病。選定動物應有一定的數(shù)量,一個批次應用多頭動物。,2. 動物的年齡及健康情況,通常選擇體型較大、性情溫馴、體質(zhì)強健的青壯年動物為宜。馬以年齡38歲、體重350kg以上者為宜;牛以310歲、體重300400kg以上為宜;豬以50kg以上,年齡612月齡為宜;家免體重需達2kg以上為好。 供制造免疫血清的動物,必須從非疫區(qū)選購,經(jīng)過嚴格檢疫,并經(jīng)隔離觀察,每日測溫兩次,觀察二周以上,確認健康者方
22、可應用。最好自繁自養(yǎng)動物,或由專門飼養(yǎng)場提供標準化的SPF或其他級別的動物。 對某些購進動物進行必要的和對制備抗血清無影響的預防免疫接種。,(二)動物的管理,符合要求的動物:動物應在隔離條件下飼養(yǎng),杜絕高免時強毒及發(fā)病時散毒。應詳細登記每頭動物的來源、品種、性別、年齡、體重、特征及營養(yǎng)狀況、體溫記錄和檢疫結(jié)果等,建立制造血清動物的檔案。 嚴格的管理制度。:由專人負責喂養(yǎng)和精心管理。加強日常飼養(yǎng)管理,喂以營養(yǎng)豐富的飼料,并加喂多汁飼料,最好能經(jīng)常喂給一些胡蘿卜,還須喂給適量的食鹽和含鈣的補充飼料。 在高免和采血期間,每日要檢測體溫兩次,隨時觀察其健康情況。每日至少運動4h。在生產(chǎn)過程中,若發(fā)現(xiàn)健
23、康狀況異?;蛴谢疾】梢蓵r,應停止注射抗原和采血,并進行隔離治療。 動物采血前1d,禁食喂水,避免血中出現(xiàn)乳糜。,三、免疫原,良好的免疫原應具備3個條件: 異物性、結(jié)構(gòu)的復雜性和一定的物理性狀。 一般來說,顆粒性抗原較可溶性抗原的抗原性強,球形分子的蛋白質(zhì)較纖維形分子的免疫原性強,聚合狀態(tài)的蛋白質(zhì)較單體狀態(tài)的蛋白質(zhì)免疫原性強。 分子量較小和抗原性較低的蛋白質(zhì)應吸附于載體上,才可獲得較高的免疫原性。,制造抗病血清所用的免疫抗原,要根據(jù)病原微生物的培養(yǎng)特性,采用不同的方法生產(chǎn)。免疫原提純和濃縮十分必要。 根據(jù)需要,有時可加合適的免疫佐劑。,1.抗細菌免疫血清制備,基礎(chǔ)免疫用抗原多為疫苗或死菌,而高度
24、免疫的抗原,一般選用毒力較強的毒株。 菌種接種于最適生長的培養(yǎng)基,按常規(guī)方法進行培養(yǎng)。通?;罹乖栌眯迈r培養(yǎng)菌液,并按規(guī)定的濃度使用,培養(yǎng)時間較死菌抗原稍短為好,多用1618h 培養(yǎng)物,經(jīng)純粹檢查,證明無雜菌者,即可作為免疫抗原。,抗細菌免疫血清制備,在固體培養(yǎng)基上繁殖,加適量滅菌生理鹽水或緩沖鹽水洗下菌苔,制成均勻的菌懸浮液; 用液體培養(yǎng)基培養(yǎng),應在生長菌數(shù)高峰期(對數(shù)期)收獲;為減少由培養(yǎng)基帶來的非特異性成分,可通過離心,棄上清,再將菌體制成一定濃度的細菌懸浮液,作為免疫原。,2.抗病毒免疫血清制備,以病毒為免疫原,須通過反復凍融或超聲裂解方法,將病毒從細胞中釋放出來,并盡可能地提高病毒
25、滴度和免疫原性。 如抗豬瘟血清,基礎(chǔ)免疫的抗原,可用豬瘟兔化弱毒疫苗;高度免疫抗原,則用豬瘟血毒或臟淋毒乳劑等強毒。 豬接種豬瘟強毒發(fā)病后57d,當出現(xiàn)體溫升高及典型豬瘟癥狀時,由動脈放血,收集全部血液,經(jīng)無菌檢驗合格后即可作為抗原使用。 接種豬瘟強毒的豬,除血中含有病毒外,脾臟和淋巴結(jié)也有大量的病毒,可采集并制成乳劑,作為抗原使用。,3. 抗毒素血清制備,免疫原可用類毒素、毒素或全培養(yǎng)物(活菌加毒素),但后兩者只有在需要加強免疫刺激的情況下才應用,一般多用類毒素作免疫原。,四、免疫程序,免疫程序分為: 第一階段為基礎(chǔ)免疫,第二階段為高度免疫。 (一)基礎(chǔ)免疫 基礎(chǔ)免疫通常先用本病的疫苗按預防
26、劑量作第一次免疫,經(jīng)13周再用較大劑量的滅活苗或活菌或特制的滅活抗原再免疫13次,即完成基礎(chǔ)免疫。 基礎(chǔ)免疫大多數(shù)13次即可,抗原無須過多過強,可為高度免疫產(chǎn)生有效的回憶應答打下基礎(chǔ)。,(二)高度免疫,高度免疫亦稱加強免疫,一般在基礎(chǔ)免疫后24周開始進行。 注射的抗原采用強毒制造,微生物的毒力越強,一般免疫原性越好。免疫劑量逐漸增加,每次注射抗原間隔時間為310d,多為57d。 高免的注射次數(shù)要視血清抗體效價而定。有的只要大量注射12次強毒抗原,即可完成高度免疫;有的則要注射10次以上,才能產(chǎn)生高效價的免疫血清。,(三)免疫途徑,免疫原注射途徑一般采用皮下或肌肉注射。如果免疫劑量大,應采用多部
27、位注射法,尤其應用油佐劑抗原時。 免疫程序?qū)χ苽涓呙庋宸浅V匾?,掌握抗體消長規(guī)律,適時免疫和采血尤為重要。 不能機械地定期免疫和采血。如有的動物在長期免疫和采血過程中,可能會現(xiàn)抗體達到一定水平后,反而逐漸降低,對免疫原的刺激無應答反應,這可能與免疫劑量、免疫間隔時間和免疫原中混雜免疫抑制物有關(guān)。此時,應給免疫動物足夠時間休息,解除免疫抑制作用,并調(diào)整免疫程序。,五、血液采集與血清提取,按照免疫程序完成免疫的動物,經(jīng)采血檢驗(試血),血清效價達到合格標準時,即可采血。 (一)采血次數(shù)和方法 一般血清抗體的效價高峰在最后一次免疫后的710d。采血可以全放血或部分采血,采血時應盡可能地作到無菌操作
28、。 全放血者,在最后一次高免之后的811d進行放血。 多次采血者,按體重每千克采血約10m1,經(jīng)35d第二次采血,按體重每公斤采810m1。第二次采血后經(jīng)23d,注射足量免疫原。,動物采血,不合格者,再度免疫,多次免疫仍不合格者淘汰。采血前,動物應禁食24h,但需飲水以防止血脂過高 豚鼠由心臟穿刺采血。 家兔可以從心臟采血或頸靜脈、頸動脈放血,少量采血可通過耳靜脈采取。 馬由頸動脈或頸靜脈放血。 羊可以從頸靜脈采血或頸動脈、頸靜脈放血。 家禽可以心臟穿刺采血或頸動脈放血。,(二)血清的分離,采血時一般不加抗凝劑,全血在室溫中自然凝固,在滅菌容器中使之與空氣有較大的接觸面。待血液凝固后進行剝離或
29、者將凝血切成若干小塊,并使其與容器剝離。先置于37 12h,然后置于4冰箱過夜,次日離心收集血清。 無菌的血清,組批分裝,保存于之-15半成品庫,待抽檢合格后交成品庫保存出。 如果采集的血量較大時,可采用自然凝固加壓法。即將動物血直接采集于事先用滅菌生理鹽水或PBS液濕潤的玻璃筒內(nèi),置室溫自然凝約24h,有血清析出時,每采血筒中加入滅菌的不銹鋼壓鉈,經(jīng)24h后,用虹吸法將血清吸入滅菌瓶中,加入0.5%石炭酸或0.02%硫柳汞防腐。,六、免疫血清的使用,正確診斷,盡早應用。特別是治療時,應用越早效果越好。 血清的用量根據(jù)動物的體重和年齡不同而確定。預防量,大動物1020m1,中等動物(豬、羊等)
30、510ml。以皮下注射為主,也可肌肉注射。 治療量需要按預防量加倍,并根據(jù)病情采取重復注射。注射方法以靜脈為好,以使其盡速奏效。 靜脈注射血清的量較大時,最好將血清加溫至30左右再注射。 皮下或肌肉注射,當血清量大時,可分幾個部位注射,并加揉壓使之分散。,不同源的血清過敏反應,對不同動物源的血清(異源血清),有時可能引起過敏反應。 如果在注射后數(shù)分鐘或半小時內(nèi),動物出現(xiàn)不安、呼吸急促、戰(zhàn)抖、出汗等癥狀,應立即搶救。 搶救的方法,可皮下注射 1:100腎上腺素,大動物510m1,中小動物25m1,反應嚴重者有時搶救不及時,常造成損失。,七、卵黃抗體的制備,產(chǎn)蛋雞(鴨和鵝)感染某些病原后,其血清和
31、蛋黃內(nèi)均可產(chǎn)生相應的抗體。因此,通過免疫注射產(chǎn)蛋雞,即可由其生產(chǎn)的蛋黃中提取相應的抗體,并可用于相應疾病的預防和治療,該類制劑稱為卵黃抗體(yak antibody)。 近幾年來,卵黃抗體已成為免疫血清的重要替代品。卵黃抗體可以在一定程度上克服血清抗體成本較高、生產(chǎn)周期較長的弱點,并且具有用同批動物連續(xù)生產(chǎn)的優(yōu)點。 但是,卵黃抗體有潛伏野毒的危險,對生產(chǎn)用雞應做認真的檢疫。,(IBD)卵黃抗體液的制備過程,擇健康無病的產(chǎn)蛋雞群,開產(chǎn)前或已開產(chǎn)后,以免疫原性良好的IBD油佐劑滅活苗肌肉注射,2m1/只,以后每隔710d,重復注射一次,疫苗劑量適度遞增,三免后定期檢測卵黃抗體水平,待瓊擴效價達1:
32、128時開始收集高免蛋,4貯存?zhèn)溆谩?瓊擴效價降到1:64時停止收蛋,可再進行加強免疫。高免蛋合格時間大約持續(xù)一個月。,制造,將高免蛋用0.5%新潔爾滅溶液浸泡或清洗消毒,再用酒精棉擦拭蛋殼,打取雞卵分離蛋黃。根據(jù)卵黃抗體瓊擴效價水平加入生理鹽水進行稀釋(稀釋后的卵黃抗體瓊擴效價不低于1:161:32),加青、鏈霉素各1000U (g)/m1,加硫柳汞濃度達1/萬,充分攪拌后分裝于滅菌瓶內(nèi)4 貯存。 每批都進行效價測定、細菌培養(yǎng)和安全檢驗,合格后方可出廠。,一、冷凍真空干燥原理與特點,一、冷凍真空干燥原理與特點 冷凍真空干燥,又稱冷凍干燥(freeze drying),簡稱凍干。它是物質(zhì)干燥的一種方法。冷凍干燥的過程包括:將含有大量水分的生物活性物質(zhì)先行降溫凍結(jié)成固體,再在真空和適度加溫(一般不超過40)條件下使固體水分子直接升華成水汽抽出,最后使生物活性物質(zhì)形成疏松、多孔樣固狀物。,優(yōu)點,能有效地保護熱敏性物質(zhì)的生物活性,如微生物、抗原物質(zhì)、血清制品、酶和激素等經(jīng)冷凍干燥后生物活性影響甚微。 能有效地降低氧分子對微生物和酶等活性物質(zhì)的作用,從而保護物質(zhì)
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