那他霉素發(fā)酵工藝的研究(本科畢業(yè))

1、那霉素發(fā)酵工藝研究摘要：牙齒實驗以鈉霉素為菌種進行了一系列發(fā)酵，通過其單因素實驗和正交實驗確定了最佳培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件：葡萄糖3.5%，大豆蛋白1.85%，酶粉0.40%，初始pH值7.0，接種3%，50毫升。結果在牙齒配方和發(fā)酵條件下，納他霉素產(chǎn)量可達1.2g/L。關鍵詞：納他霉素培養(yǎng)基的發(fā)酵最優(yōu)化前言納他霉素也稱為鏈霉素，是天然聚烯烴類抗生素1。納塔爾鏈霉素牙齒發(fā)酵的次代謝產(chǎn)物，有效抑制酵母菌和絲霉菌的生長和真菌毒素的產(chǎn)生，被廣泛用于食品防腐和真菌引起的疾病治療2。目前國際許可的生物防腐劑只有乳酸鏈球菌素、納他霉素、聚賴氨酸三種茄子3。我國目前允許的只有乳酸鏈球菌素和納他霉素。鈉霉素是一

2、種新型防腐劑，具有高效殺菌效果和無毒無害的安全保障，各行業(yè)都偏愛4。近年來，隨著世界經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們的生活水平全面提高，對無毒無害食品的偏好越來越高，各行業(yè)開始尋找這種防腐劑。鈉慶大霉素的高效殺菌效果和無毒無害安全，導致慶大霉素鈉誕生。目前有30多個國家使用慶大霉素鈉作為天然食品添加劑和防腐劑。1材料和方法1.1材料1.1.1株生產(chǎn)菌株：棕色黃浦鏈菌S. S.giLvosPoreus，ATCC13326。1.1.2主要藥物無水葡萄糖分析純上海生物工程有限公司麥芽粉RT天津化學試劑廠瓊脂粉末生化試劑5化學股份有限公司牛肉蛋白胨微生物培養(yǎng)基北京化學試劑公司大豆蛋白胨生化試劑北京海淀區(qū)微生物培養(yǎng)

3、基產(chǎn)品廠酵母浸出粉生化試劑成都彭縣立春化工廠糊精分析純北京海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基產(chǎn)品廠水溶性淀粉分析純天津市化學試劑批發(fā)部流通麥芽糖生化試劑天津化學試劑廠蔗糖分析純天津化學試劑批發(fā)部教練氯化鈉分析純天津化學試劑廠MgSO4分析純天津市塘沽化學試劑廠HCl分析純天津化學試劑部教練磷酸分析純天津化學試劑三廠1.1.3主要裝置LDS 10離心機上海安廷科學儀器廠TGL 16B高速臺式離心機北京醫(yī)用離心機廠電熱恒溫培養(yǎng)箱湖北省黃石市醫(yī)療器械廠。DFG801傳記鼓風機天津實驗設備廠HKCB-1-3恒控磁攪拌器gransie電子分析天平瑞士超純北京通用儀器有限責任公司微波爐溫州市醫(yī)療電氣廠初順工作臺燒酒凈化設

4、備廠。1.1.4培養(yǎng)基活化液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15g蛋白5g麥芽浸液8g酵母粉7g PH7.0斜面保存培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15g酵母粉4g蛋白5克瓊脂粉10g麥芽浸液2g PH7。o分離培養(yǎng)基(g/L) :葡萄糖20g蛋白5g酵母粉3g麥芽浸液2g瓊脂粉末10g PH7.0種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20g蛋白6克酵母粉4克NaCl8克PH 7.0發(fā)酵培養(yǎng)基(G數(shù)):大豆分離蛋白20g酵母粉3g PH 7.0葡萄糖(50%葡萄糖單獨殺菌)7克胃培養(yǎng)基滅菌條件：115，滅菌30min1.2測試方法1.2.1菌株的激活在錐蟲病中接種含有10毫升液體的活性培養(yǎng)基，接種于25毫升的三角病，

5、在25，300/min振動下培養(yǎng)48h，在保存坡度后培養(yǎng)25恒溫下培養(yǎng)120h，在斜坡幾乎完全被孢子復蓋的情況下，放入冰箱(4)準備1.2.2菌株的分離將0.3ml孢子懸浮液接種到含有20ml培養(yǎng)基的板上，涂5個板，用25C恒溫培養(yǎng)120 h。然后，根據(jù)群落的形態(tài)、大小等，選擇具有不同典型形態(tài)的單菌，用D=10毫米的沖床打10個孔，將單菌洛川陣地放在D=100毫米的培養(yǎng)皿中，在25 的恒溫下培養(yǎng)板24h，如果邊緣出現(xiàn)明顯的抑制菌圈，用抗生素逆家系測定抑菌圈的大小。選擇菌圈較大的菌群，移至保存坡，用25恒溫培養(yǎng)120h。1.2.3種子培養(yǎng)在包含50毫升種子培養(yǎng)基的250毫升三角瓶中吸收5毫升孢子

6、懸浮液，通過25C，300 r/min振動培養(yǎng)48h，使菌體快速到達生長期。1.2.4奶昔燒瓶發(fā)酵培養(yǎng)以3%的接種量接種種子液，用含50毫升液量的250毫升三角瓶，25C，300 r/min旋轉搖針發(fā)酵120 h。1.2.5生產(chǎn)細菌的測定-干重量法6首先將濾紙放在100C烤箱下，烘烤到恒重，稱重并記錄數(shù)據(jù)，然后放入布氏漏斗。取10ml發(fā)酵液，3000r/min離心30min，倒入上面的清液，收集沉淀物，用無菌水清洗兩次，將洗好的沉淀物沖洗到布氏漏斗中，將濾紙和菌體從50C烤箱干燥到恒重，測量和計算菌體的干重。2結果和討論2.1徽章最優(yōu)化2.1.1種子培養(yǎng)基的最優(yōu)化表1種子徽章(g/100ml)

7、種子培養(yǎng)基1#2#3#增長狀態(tài)比較差通常最好的如上表所示，#3種子培養(yǎng)基配方提高了種子液的菌絲濃度，使生長狀態(tài)更好。因此，種子培養(yǎng)基為：淀粉1.0%，酪蛋白陳0.6%，玉米果肉0.6%，葡萄糖1.0%，豆粉1.0%，七水硫酸鎂0.1%，磷酸二氫鉀0.05%，碳酸鈣0.5%，氯化鈉0.2%2.1.2傾斜徽章的最優(yōu)化傾斜培養(yǎng)基的優(yōu)化主要考察了碳源、氮源等因素對納他霉素產(chǎn)生菌生長的影響。早期傾斜培養(yǎng)基配方為：葡萄糖1.0%，酵母提取物為0.3%，麥芽提取物為1.0%，瓊脂為0.5%，pH7.0。在牙齒培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)菌落不夠厚，孢子量也比較小，為了得到更多的孢子，設計下一個6茄子斜面培養(yǎng)基進行實

8、驗最合理。表2傾斜徽章(g/100ml)培養(yǎng)基1#2#3#4#5#6#增長狀態(tài)幾乎沒有幾乎沒有生長生長比較好更深更好在上表中，添加可溶性淀粉和黃豆粉的斜面培養(yǎng)基中孢子的生長情況明顯好轉，6#配方的培養(yǎng)基中孢子生長情況最好，因此最終確定的培養(yǎng)基配方為3360淀粉1.0%，葡萄糖1.0%，豆粉1.0%，酵母提取物0.3%，麥芽提取物0.3%。斜面放在25 的生化培養(yǎng)箱里培養(yǎng)5天。2.2發(fā)酵條件的最優(yōu)化2.2.1疫苗接種對發(fā)酵結果的影響圖3早期接種對慶大霉素鈉生產(chǎn)的影響上圖顯示，接種量從3%增加到12%時，納他霉素產(chǎn)量也急劇增加，接種量為12%的產(chǎn)量是接種量為2%時的4倍。此后，如果繼續(xù)增加菌種的接

9、種量，納他霉素產(chǎn)量反而迅速減少。菌種接種量為20%時，納他霉素的產(chǎn)量下降了近60%。接種量為3% 12%時，菌體干重量的變化不大，保持約30.0g/L。但是隨著接種量的增加，菌體的干重反而減少到了20.0g/L。從上面的圖表中還可以看出，隨著接種量的增加，糖的利用率先增加，然后減少的變化。接種量為12%時，糖的利用率最高，超過90%。溶解氧對2.2.2發(fā)酵的影響圖4溶解氧對nasodium mycin產(chǎn)量的影響如上第一張圖所示，對負載量的楊怡產(chǎn)物合成有很大影響，負載量從10毫升增加到30毫升，納他霉素的產(chǎn)量增加了近70.2%。此時，如果繼續(xù)增加液體裝載量，納他霉素的產(chǎn)量反而開始減少。液體量為5

10、0毫升時，納他霉素產(chǎn)量達到了最小值。假絲菌劑(cnaddiin)、白肉新菌(cnadihxeni)、肉毒桿菌(cnadicidin)等多烯環(huán)內(nèi)酷類抗生素的生物合成都對氧濃度敏感。裝載量為10-30毫升時，裝載量對菌體生長影響不大。菌間干量約為35g/L，但如果裝載量增加到50mL，菌間干重量反而下降到最小值20g/L。如上圖所示，糖的利用率表現(xiàn)為隨著裝載量的增加(即隨著溶解氧濃度的減少)先增加，然后減少的現(xiàn)象。裝載量為30毫升，消費率接近100%，裝載量為50毫升，消費率只有50%左右。這可能是由于液體量太大，溶解氧濃度迅速下降的原因。據(jù)調(diào)查，發(fā)酵液的溶解氧濃度下降到臨界氧濃度以下，糖代謝會受

11、到明顯影響。如第二張圖所示，YP/X和YP/S都是隨著裝載量的增加而首先增加，然后減少的變化趨勢。裝載量為25mL時，YP/X和YP/S分別達到了1.98%和0.067%的最大值。但是此后，如果繼續(xù)增加裝載量，都開始明顯下降，如果裝載量為35ml-55ml，YP/X和YP/S沒有太大變化，分別達到了0.671%和0.235%。2.2.3發(fā)酵溫度對發(fā)酵溫度的影響圖5溫度對鈉霉素生產(chǎn)的影響在上面的第一張圖中，可以看到溫度對納他霉素合成的影響比對菌體生長的影響更明顯，有最合適的合成溫度和最合適的生長溫度。在適當?shù)姆秶鷥?nèi)，溫度越低，納他霉素的產(chǎn)量越高，20C到最高1.0 g/L。溫度從20上升到25，

12、菌體干重量比最初增加了20.2%，這可能是由于溫度上升，與菌體生長相關的酶加快了反應速度。但是溫度太高，酶的停用速度加快了。因此，在25130范圍內(nèi)，菌體的干重開始下降。糖利用率在20C，25C時均保持在80%以上，但隨后溫度升高，明顯減少。溫度上升到30，達到最小值，為34.5%。如第二個圖中所示，如果溫度為28-34C，則YP/X和YP/S會隨著溫度的降低而略有增加，但是如果溫度下降到25C，則YP/X和YP/S會快速增加，達到最高3.816%。2.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源對發(fā)酵的影響表6早期碳源對慶大霉素鈉生產(chǎn)的影響納他霉素是典型的微生物次代斯產(chǎn)物，次代謝有兩個茄子生理階段，即菌體生長階段

13、和代謝產(chǎn)物合成階段7。在菌體生長階段快速使用的碳源(如葡萄糖等)的分解產(chǎn)物，阻止了二次代謝酶系的合成，只有在這些限制因素耗盡或消耗一定量時，抑制作用才會解除。菌體從生長階段轉移到次代謝產(chǎn)物合成階段8。如上圖所示，葡萄糖是可以快速利用的碳源，是菌體生長良好的碳源和能源。但是如果早期葡萄糖濃度過高，就會產(chǎn)生分解代謝抑制作用，促進大量合成菌絲體代謝，最終抑制二次代謝產(chǎn)物的合成，反而顯著降低納他霉素產(chǎn)量。但是另一邊的碳源濃度太低，缺乏菌體生長所需的能量供應，就不能產(chǎn)生足夠的納他霉素的菌體，最終影響抗生素的生產(chǎn)。實驗表明，最合適的早期葡萄糖濃度選擇為2%。2.2.5發(fā)酵培養(yǎng)中ph值對發(fā)酵的影響通過將發(fā)酵

14、培養(yǎng)基調(diào)整為酸堿性，將初始PH值分別調(diào)整為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，研究培養(yǎng)基的酸性對產(chǎn)生鏈霉素的影響，從A圖表中可以看出，最適合合成產(chǎn)物的pH值是pH的發(fā)酵過程中菌體對糖的利用在發(fā)酵液的初始pH中性和堿性條件下高達90%左右。但是，當初始pH值為酸性條件時，糖的利用率低于70%。如b圖表所示，YP/X和YP/S在初始pH為7.0時達到最高0.35%，在初始pH為6.0時達到最高0.056%。所以最適合納他霉素發(fā)酵的初始pH值為6.0-8.0。圖7早期ph值對納他霉素生產(chǎn)的影響a圖b圖形2.2.6正交試驗確定最佳飲酒過程發(fā)酵培養(yǎng)基的各成分之間必須有內(nèi)在的關系，發(fā)酵條件之間也可能徐璐影響，因此各種最佳單因素的組合不一定能達到最佳發(fā)酵結果，必須利用正交試驗設計正交表，進行科學分析。因此，在實驗的各要素之間均衡調(diào)配，最終得到最佳的發(fā)酵工藝。牙齒實驗以單因素實驗結果為基礎，分別選擇總氮、發(fā)酵液初始pH值、溶解氧作為考察因素，分別選擇3級、L9(34)正交表，以抑菌圈直徑的大小測量實驗結果的好壞。表8發(fā)酵正式最優(yōu)化方差分析檢查結果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總氮最強，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值和溶解氧都