大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

1、第一部分 :微生物的利用,微生物：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物。通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到單個(gè)生物體，90%以上的微生物是對(duì)人類有益的。,實(shí)驗(yàn)1 大腸桿菌的培養(yǎng)與分離,第一部分 :微生物的利用,大腸桿菌是人和許多動(dòng)物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌，幾占糞便干重的1/3。常隨糞便散布在周圍環(huán)境中。正常棲居條件下不致病。一些特殊基因型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性。繁殖迅速，培養(yǎng)容易，是生物學(xué)上重要的實(shí)驗(yàn)材料 。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng) 2.進(jìn)行大腸桿菌的分離,(一)實(shí)驗(yàn)設(shè)備及用具,1. 250mL三角瓶、封口膜和橡皮圈 2. 培養(yǎng)皿 3.

2、 接種環(huán) 4. 酒精燈 5. 有棉塞的試管 6.恒溫培養(yǎng)箱 、超凈臺(tái)、搖床、滅菌鍋,無(wú)菌操作的一般流程 實(shí)驗(yàn)前 儀器、培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌 實(shí)驗(yàn)中 防止 雜菌污染 實(shí)驗(yàn)后 操作儀器 滅菌 防止菌外泄, 培養(yǎng)基,是由人工方法配制而成的，專供微生物或動(dòng)植物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)液。另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH 、氧氣、二氧化碳及滲透壓的要求。,(二)培養(yǎng)基的配制, LB液體培養(yǎng)基（細(xì)菌通用培養(yǎng)基） 50mL 蛋白胨0.5g,酵母提取物0.25g,氯化鈉0.5g,水50mL LB固體平面培養(yǎng)基 1g瓊脂,1計(jì)算、稱量 2溶化 3調(diào)pH：pH76 4分裝：分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾在試管管口或瓶

3、口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角的量以不超過(guò)三角容積的一半為宜。 5加封口膜 6.滅菌 LB液體和固體培養(yǎng)基用高壓鍋高壓蒸汽滅菌（1211kg/壓力滅菌15分鐘）,培養(yǎng)基配制步驟,封口膜：既通氣又不使菌進(jìn)入,（三）大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和分離的技術(shù),2.倒平板,滅菌后的培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)上，酒精燈火焰附近，倒入4個(gè)培養(yǎng)皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面,紫外燈，過(guò)濾風(fēng)，酒精燈，酒精棉球 在火焰旁右手3指拿錐形瓶，2指拿封口膜 使錐形瓶的瓶口迅速通過(guò)火焰 左手將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋 待平板冷卻凝固后，將平板倒過(guò)來(lái)

4、放置,注意事項(xiàng)： 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60 左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。 2.滅菌及消毒：倒平板前超凈臺(tái)用紫外燈和過(guò)濾風(fēng)滅菌，倒平板時(shí)關(guān)閉紫外燈；桌面及人手用酒精棉球消毒。 3.操作時(shí)右手無(wú)名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開(kāi)上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作。 4.平板冷凝后，要將平板倒置, 可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,4.大腸桿菌的分離,分離方法:劃線分離法和涂布分離法,劃線分離法 無(wú)菌操作臺(tái)上用接種環(huán)取菌后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線.將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體,這就是菌

5、落.,思考,1、為何要將平板倒置？ 平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基 表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng) 基面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠 落培養(yǎng)基，造成污染。,2、如何檢查培養(yǎng)基是否受雜菌的污染？ 將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)，若無(wú)菌落產(chǎn)生 則未受雜菌污染。,3.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？,操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減

6、少，以便得到單個(gè)菌落。,4、在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？ 為什么？,劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,思考,5.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？,劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。,二、無(wú)菌技術(shù),1.無(wú)菌操作的目的,防止培養(yǎng)基被其他微生物污染 (及避免操作者被微生物感染),2、無(wú)菌技術(shù)包括,(1)將實(shí)驗(yàn)器具和培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌,(2)接種環(huán)(針)、試管口: 灼燒 滅菌,(3)實(shí)驗(yàn)操作空間：酒精+紫外線 消毒 （接種室(箱)、超凈工作臺(tái)）,(4) 雙手: 酒精 消毒,