基因工程 第七章 酵母基因表達(dá)體系(55P).ppt

1、酵母基因表達(dá)系統(tǒng)，發(fā)展過(guò)程1974年rlarckwalker和Miklos發(fā)現(xiàn)大多數(shù)釀酒酵母中存在質(zhì)粒。 1978年Hmnen將來(lái)自一個(gè)釀酒酵母的leu 2基因?qū)肓硪粋€(gè)釀酒酵母中，彌補(bǔ)后者的leu 2缺陷，顯示了酵母表達(dá)系統(tǒng)的確立。 1981年Hinnen等人在酵母基因表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了人干擾素。 我國(guó)也是1983年首次在酵母菌中發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒表面抗原基因。 1996年在全世界的科學(xué)家的協(xié)助下，完成了最初的真核生物釀酒酵母的全染色體組的序列決定。 酵母菌是外源基因最成功的真核生物表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)，安全無(wú)毒，無(wú)病原而有更明確的遺傳背景，易于引入遺傳操作的運(yùn)載體DNA。 優(yōu)化了DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，

2、許多酵母菌可以得到高轉(zhuǎn)化率。 培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易高密度發(fā)酵5 .具有能把外來(lái)基因表達(dá)產(chǎn)物分泌細(xì)胞培養(yǎng)基中的類(lèi)似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾功能。 缺陷是表達(dá)效率相對(duì)較低2 .酵母的密碼子偏差較多，真核基因在其中表達(dá)時(shí)需要人工修正。 酵母菌作為基因工程接納體的特點(diǎn)，有酵母菌的基因工程、酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)，全染色體組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控反應(yīng)歷程較明確，遺傳操作簡(jiǎn)便，可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌細(xì)胞培養(yǎng)基，有不可與原核細(xì)菌匹敵的真核蛋白質(zhì)翻譯后加工系統(tǒng)， 大規(guī)模發(fā)酵歷史長(zhǎng)、技術(shù)成熟、技術(shù)簡(jiǎn)單、成本低廉的美國(guó)FDA被認(rèn)定為安全，基因工程接納體系統(tǒng)(Generally Recognized As Sa

3、fe GRAS )，酵母菌為最簡(jiǎn)單的真核模式生物，酵母染色體組特點(diǎn)是與真核生物染色體組相比，啤酒酵母染色體組較小，有16條酵母細(xì)胞球可以作為單倍體存在，也可以作為二倍體存在。 這克服了在另一個(gè)真核生物中難以檢測(cè)出隱性基因控制的形狀的缺陷。 酵母菌的宿主系統(tǒng)是表達(dá)外源基因的酵母宿主菌提高重組異源蛋白的收率變異宿主菌抑制超糖基化作用的變異宿主菌4 .減少泛蛋白因子依賴(lài)型蛋白分解作用的變異宿主菌廣泛應(yīng)用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌目前廣泛應(yīng)用于外源基因表達(dá)的研究酵母菌如下： 巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因是理想的，提高重組異源蛋白的收率的突然變異宿主菌可提高啤酒酵母中的異源蛋白的收率，抑制品質(zhì)改善的突然變

4、異，抑制超糖基化作用的突然變異宿主菌的多種真核生物蛋白質(zhì)在其天門(mén)冬酰胺側(cè)鏈連接寡核苷酸，對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性影響很大。 整個(gè)糖單位由糖核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。 盡管酵母菌普遍具有完整的糖基化系統(tǒng)，但由于野生型釀酒酵母難以控制異源蛋白的糖基化反應(yīng)，呈超糖基化趨勢(shì)，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。泛蛋白因子依賴(lài)型蛋白分解作用的變異減少宿主菌泛素介導(dǎo)的蛋白分解作用，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物在酵母菌中對(duì)泛蛋白依賴(lài)型分解作用有易感性，可按以下方法使該分解作用最小化的第二種方法是在可誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子調(diào)控下， 由于異源蛋白短期集中表達(dá)，分子數(shù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的表達(dá)產(chǎn)物可以逃脫泛蛋白因子的束縛，減少分解效果造成的損

5、失的第三種方法是，在使用泛蛋白因子的生物合成缺陷的變異株作為外源基因表達(dá)的接納體細(xì)胞球的釀酒酵母中， 搖鏡頭蛋白因子的主要來(lái)源是多搖鏡頭蛋白基因UBI4的表達(dá)，雖然UBI4突變株能正常生長(zhǎng)，但其細(xì)胞球內(nèi)游離的搖鏡頭蛋白因子濃度遠(yuǎn)低于野生型菌株，因此該缺陷株是理想的外源基因表達(dá)接納體。 查詢(xún)密碼泛蛋白激活酶催化劑e-1的基因也可以作為突然變異的靶基因，在包含該突變型基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞球內(nèi)，幾乎沒(méi)有檢測(cè)出泛蛋白外來(lái)蛋白的共價(jià)鍵產(chǎn)物。 釀酒酵母查詢(xún)密碼E1蛋白的基因UBA1為留守基因，UBA1突變株致死性，但查詢(xún)密碼UBA1蛋白等位基因可減少泛素因子依賴(lài)性同源蛋白的降解作用。 另外，上述6個(gè)UBC基

6、因的變異也是建構(gòu)重組異源蛋白穩(wěn)定表達(dá)宿主系統(tǒng)的選擇方案，廣泛蛋白因子依賴(lài)型蛋白分解作用的變異宿主菌泛素分解途徑衰減的釀酒酵母UBI4缺陷型：在釀酒酵母菌中，泛素主要在UBI4基因表達(dá)，UBI4變異株正常生長(zhǎng)， 細(xì)胞球內(nèi)游離泛素分子濃度低于野生株的UBA1缺陷型： UBA1查詢(xún)密碼萬(wàn)神廟活化酶催化劑E1、UBA1突變株的致死性，但其等位基因缺陷是非致死性的，也能減弱經(jīng)萬(wàn)神廟的蛋白分解. Ubc4-ubc5雙突變型： 7個(gè)泛素連接酶催化劑基因的突變對(duì)衰減蛋白分解作用也有效。 酵母菌運(yùn)載體系運(yùn)載體的一般結(jié)構(gòu)選擇標(biāo)識(shí)牌復(fù)制子表達(dá)盒啟動(dòng)子序列終止子有用的蛋白結(jié)構(gòu)域1酵母菌中的野生型質(zhì)粒2酵母菌愛(ài)沙尼亞克

7、朗表達(dá)質(zhì)粒的建構(gòu)，酵母菌種的野生型質(zhì)粒，釀酒酵母中的雙環(huán)狀質(zhì)粒，大部分釀酒酵母含有雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，復(fù)制數(shù)為50-100個(gè)Irs反向重復(fù)序列600bp、重組FLP查詢(xún)密碼產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)Irs的同源重組REP查詢(xún)密碼產(chǎn)物調(diào)控質(zhì)粒的穩(wěn)定性STB REP的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合酵母屬中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1及克魯維酵母屬中的pKD1質(zhì)粒等，具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。 2u質(zhì)粒，大多數(shù)釀造酵母菌株存在6318bp大小的野生型2u雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，宿主細(xì)胞核內(nèi)的復(fù)制數(shù)維持在50-100之間，呈核小體結(jié)構(gòu)，其復(fù)制調(diào)控模式與染色體DNA完全相同。 2u質(zhì)粒包含相互隔開(kāi)的兩個(gè)599bp長(zhǎng)反復(fù)序列(IRs )，它們可在某些條件

8、下發(fā)生同源重組定，形成兩種不同的形態(tài)(a和b )。 該質(zhì)粒有4個(gè)基因： FLP、REP1、REP2和d中FLP基因的查詢(xún)密碼產(chǎn)物催化2個(gè)IRS序列之間的同源重組，使質(zhì)粒以a和b 2種形態(tài)感受態(tài)，REP1、REP2和d基因就是調(diào)控質(zhì)粒穩(wěn)定性的反作用因子查詢(xún)密碼基因2u質(zhì)粒還包含3個(gè)順式作用元件，其中單個(gè)自主復(fù)制子結(jié)構(gòu)(ARS )位于一個(gè)IRs的邊界上，而REP3(STB )區(qū)REP1和REP2蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn)在質(zhì)粒的細(xì)胞球有絲分裂時(shí)的均勻分配中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)RT在2個(gè)IRs序列中宿主細(xì)胞球內(nèi)的極穩(wěn)定性主要由兩個(gè)因素決定：第一，2u質(zhì)粒在細(xì)胞分裂時(shí)可將其復(fù)制副本分為母細(xì)胞球和子細(xì)胞球； 第二，

9、當(dāng)細(xì)胞球中的質(zhì)?？截悢?shù)由于某種原因減少時(shí)，2u質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)自放大自動(dòng)調(diào)節(jié)其拷貝數(shù)水平。 這些個(gè)2個(gè)復(fù)制特性均與FLP蛋白的作用密切相關(guān)，這是2u質(zhì)粒在有限復(fù)制次數(shù)下可獲得高拷貝的主要反應(yīng)歷程。 酵母菌種的野生型質(zhì)粒、乳酸克魯維酵母中的線(xiàn)狀質(zhì)粒、乳酸克魯維酵母中含有2種不同的雙點(diǎn)畫(huà)線(xiàn)狀質(zhì)粒pGKL1和pGKL2，拷貝數(shù)為50-100個(gè)，分別具有K1和K2種能致死宿主細(xì)胞球的毒素蛋白基因。 酵母菌的運(yùn)載體系統(tǒng)包括質(zhì)粒載體整合運(yùn)載體(integrating vector )人工染色體酵母質(zhì)粒載體和酵母加性質(zhì)粒(yeast episomal plasmid，YEp )酵母復(fù)制型質(zhì)粒(yeast repl

10、icating plasmid ) 的3種YRp )酵母著絲粒質(zhì)粒(yeast centromere plasmid，YEp )，酵母加成型質(zhì)粒來(lái)源于野生型酵母質(zhì)粒，該質(zhì)粒存在于多種啤酒酵母株系，功能不良。 但一個(gè)重要特征是，該質(zhì)粒被長(zhǎng)約599bp的反復(fù)序列分為兩個(gè)部分，每個(gè)部分含有一個(gè)啟動(dòng)子和在其啟動(dòng)子控制下的兩個(gè)基因。 一個(gè)基因是FLP，查詢(xún)密碼位點(diǎn)特異性重組酶催化劑，該酶催化劑催化反復(fù)序列間的遺傳重組。 酵母加成型質(zhì)粒是在該質(zhì)粒中加入酵母核DNA序列和大腸菌群pMB9的部分序列而成。 可以用酵母或大腸菌群復(fù)制。 酵母菌中天然存在的自主復(fù)制型質(zhì)粒很少，且相當(dāng)部分野生型質(zhì)粒是隱蔽型的，因此目

11、前用于克隆復(fù)制和表達(dá)外源基因的運(yùn)載體質(zhì)?？珊Y選野生型質(zhì)粒和宿主染色體DNA上的自主復(fù)制子結(jié)構(gòu)(ARS )、中心粒序列(CEN )、端粒序列(TEL )及感受態(tài)子在云同步中加入酵母染色體的自主復(fù)制序列。 該質(zhì)粒一般不與酵母染色體重組，感受態(tài)酵母的轉(zhuǎn)化率高，但不能穩(wěn)定遺傳。 酵母著絲粒：來(lái)自酵母染色體著絲粒周?chē)膌eu2和cdc10之間的1.6kb的序列。 具有這種著絲粒序列的質(zhì)粒在酵母中的行為類(lèi)似于微小染色體，可穩(wěn)定遺傳，均勻分配給子細(xì)胞球，同時(shí)在宿主細(xì)胞球中的拷貝數(shù)少。 但是含有著絲粒質(zhì)粒的酵母細(xì)胞球生長(zhǎng)非常慢，降低了細(xì)胞球的生存能力。 整合載體：由于不含酵母自主復(fù)制序列而不能獨(dú)立復(fù)制到酵母中

12、的載體。 這樣的運(yùn)載體如果不編入酵母染色體，就不能穩(wěn)定地表達(dá)其中所含的基因。 啤酒酵母含有3040個(gè)拷貝的可轉(zhuǎn)移基因(Ty )，其結(jié)構(gòu)包含2個(gè)長(zhǎng)OFR和2個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR )，Ty可整合到宿主細(xì)胞球的染色體上。 在Ty的OFR2的3端和LTR的3端之間插入外源基因，外源基因就可以和Ty一起合并到酵母染色體中。 酵母菌愛(ài)沙尼亞克朗表達(dá)質(zhì)粒的建構(gòu)，含ARS的YRp和YEp質(zhì)粒及其建構(gòu)ARS是酵母菌中的自主復(fù)制序列，大小為0.8-1.5Kb，染色體上每30-40bp有一個(gè)ARS元件。 染色體ARS組成的質(zhì)粒稱(chēng)為Yrp，2質(zhì)粒組成的雜質(zhì)粒稱(chēng)為Yep。 兩種這些個(gè)質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)

13、200個(gè)，但經(jīng)過(guò)數(shù)代培養(yǎng)，質(zhì)粒的丟失率可達(dá)50%至70%，主要是由于分配不均勻所致。 將酵母菌愛(ài)沙尼亞克朗表達(dá)質(zhì)粒的建構(gòu)、含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的建構(gòu)、大腸菌群質(zhì)粒整合酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)識(shí)牌基因，將建構(gòu)質(zhì)粒稱(chēng)為YIp。 目的基因表達(dá)盒通常被插入染色體DNA的鑒定、序列中，使目的基因能夠有效地整合到酵母菌的特定染色體DNA區(qū)域中。酵母菌愛(ài)沙尼亞克朗表達(dá)質(zhì)粒的建構(gòu)、含CEN的YCp質(zhì)粒的建構(gòu)CEN是與酵母菌染色體DNA上染色體均勻分配有關(guān)的序列。 將CEN插入ARS質(zhì)粒，得到的新運(yùn)載體稱(chēng)為YCp。 YCp質(zhì)粒的有絲分裂穩(wěn)定性高，但拷貝數(shù)通常只有15個(gè)。 利用酵母菌愛(ài)

14、沙尼亞克朗表達(dá)質(zhì)粒的建構(gòu)、含TEL的YAC質(zhì)粒建構(gòu)酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元件可建構(gòu)人酵母染色體，愛(ài)沙尼亞克朗放大大片段的外源DNA，這是建構(gòu)YAC運(yùn)載體的基本思路YAC運(yùn)載體載貨量高達(dá)800kb，人類(lèi)基因組文庫(kù)酵母菌的感受態(tài)系統(tǒng)、感受態(tài)質(zhì)粒在酵母細(xì)胞球中的命運(yùn)、酵母菌的感受態(tài)工藝、篩選感受態(tài)子的標(biāo)識(shí)牌基因、酵母菌的感受態(tài)工藝、酵母菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法初期酵母菌的轉(zhuǎn)化全部采用等滲透緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。 在Ca2和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)到生存原生質(zhì)體球總數(shù)的15%。 但是，操作周期長(zhǎng)，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)體再生率的嚴(yán)重制約。 原生質(zhì)體感受態(tài)法的一個(gè)特點(diǎn)是一個(gè)接納

15、體細(xì)胞球可以在云同步中容納多個(gè)質(zhì)粒分子，且經(jīng)共感受態(tài)的原生質(zhì)體占感受態(tài)子總數(shù)的25%至33%。 酵母菌經(jīng)感受態(tài)計(jì)程儀普拉姆堿金屬絡(luò)離子的酵母菌完全細(xì)胞球的感受態(tài)釀酒酵母堿金屬細(xì)胞球經(jīng)堿金屬絡(luò)離子(如Li等)、PEG熱休克處理后，可有效吸收質(zhì)粒DNA，且吸收線(xiàn)性DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍。 共變換現(xiàn)象很少見(jiàn)。 酵母菌的感受態(tài)普拉姆酵母菌的電擊感受態(tài)酵母菌原生質(zhì)體和完全細(xì)胞球可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但該過(guò)程中應(yīng)避免使用PEG，對(duì)電擊細(xì)胞球有很大的負(fù)面作用。 其優(yōu)點(diǎn)是，不依存于接納體細(xì)胞球的遺傳特征及培養(yǎng)條件的適用范圍廣，轉(zhuǎn)化率高，為105感受態(tài)子/gDNA。 酵母細(xì)胞球中

16、感受態(tài)質(zhì)粒的命運(yùn)單鏈DNA均可有效感受態(tài)酵母菌，但單鏈DNA的感受態(tài)率在含有雙鏈10-30倍酵母復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞球時(shí)，可正確感受態(tài)復(fù)制在雙鏈上。 不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞球，可有效同源整合到染色體上，對(duì)體內(nèi)定點(diǎn)變異酵母染色體組極為有利。 同源重組頻率取決于整合子型質(zhì)粒和受體菌染色體組之間的同源程度和同源區(qū)的長(zhǎng)度，一般整合子占感受態(tài)子總數(shù)的50-80%。 用于感受態(tài)子篩選的標(biāo)記基因營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因酵母菌感受態(tài)子篩選的標(biāo)記基因主要有營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩種。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要是氨基酸和核苷酸的生物合成記憶，如Leu、Trp、His、Lys、Ura、Ade。 但對(duì)多倍體酵

17、母來(lái)說(shuō)，篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型接納體是非常困難的。 用于篩選感受態(tài)子的標(biāo)識(shí)牌基因顯性標(biāo)識(shí)牌基因的查詢(xún)密碼產(chǎn)物，僅通過(guò)利用與質(zhì)粒上的營(yíng)養(yǎng)成分生物合成標(biāo)識(shí)牌基因互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型接納體菌，就可在不添加任何篩選試劑的情況下維持感受態(tài)子中質(zhì)粒的存在，但該篩選互補(bǔ)模式仍不穩(wěn)定。 近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的自選系統(tǒng)是克服上述困難的有效方法。 釀酒酵母的一種srb1突變株對(duì)環(huán)境條件極為敏感，只能在含有滲透壓穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，而在通常的復(fù)合培養(yǎng)基中細(xì)胞球就會(huì)自發(fā)分裂。 用含有野生型SRB1基因的自主復(fù)制序列型多拷貝質(zhì)粒感受態(tài)該突變株接納體細(xì)胞球，可使只有感受態(tài)子在不含滲透壓穩(wěn)定劑的正常培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而在任何培養(yǎng)基中都能進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和維持質(zhì)粒的穩(wěn)定。 更好的是，含有SRB1標(biāo)記基因的多拷貝運(yùn)載體可以穩(wěn)定地復(fù)制到受體菌中80代以上。 該自選擇系統(tǒng)對(duì)化學(xué)制劑和營(yíng)養(yǎng)缺陷的互補(bǔ)篩選計(jì)程儀方案具有更高的應(yīng)用價(jià)