基因工程技術(shù).ppt

1、基因工程技術(shù),Jackson, Symons, and Berg (1972) generated first recombinant DNA molecules Cohen and Boyer (1973) produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host,The Nobel Prize in Chemistry 1980,定義：,基因工程（gene engineering） 重組DNA技術(shù)（recombinant DNA technique）：是指在各種酶的作用下，將細(xì)胞外的核

2、酸片斷（目的基因）在體外與病毒、細(xì)菌或其它載體通過入工剪切、連接構(gòu)成重組DNA分子，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞并使之無性繁殖（稱之為“克隆”）和 表達(dá)，這種有目的的應(yīng)用分子克隆技術(shù)，人為地改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程，總稱為基因工程。,應(yīng)用：,克隆感興趣基因進(jìn)行序列分析，研究其組織結(jié)構(gòu)。 轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體，進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)合成，生產(chǎn)多肽產(chǎn)品。 轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體，導(dǎo)入細(xì)胞，研究其功能，表達(dá)調(diào)控機(jī)制等,基因工程基本步驟：,基因工程流程示意圖,構(gòu)建重組分子（連接）,原料：,目的基因：研究對(duì)象 載體：目的基因的運(yùn)載工具 工具酶：連接酶、限制性內(nèi)切酶,目的基因片段來源：,基因組DNA（非編碼序列） PCR

3、 方法擴(kuò)增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它克隆構(gòu)建或從商品化的cDNA文庫擴(kuò)增） 通過RT-PCR 方法得到目的基因cDNA 人工合成基因片段（價(jià)錢昂貴）,目的基因來源選擇：,取決于解決什么問題？ 基因功能研究,cDNA,RT-PCR,基因表達(dá)調(diào)控的研究,基因組DNA,PCR,PCR：,引入合適的酶切位點(diǎn)，一個(gè)/兩個(gè)。 加保護(hù)堿基，1-3個(gè)。 加上想要的標(biāo)簽，如 Flag, Myc, His, HA。 啟始及終止密碼子。,高保真聚合酶：HF，Pfu，Probest 等。,片斷的回收與純化,載體：,載體(Vector)是目的基因的運(yùn)載工具，其作用是將目的基因帶入受體細(xì)胞中，并使目的基因

4、擴(kuò)增和表達(dá)。 種類：,按來源分： 質(zhì)粒載體(plasmid vector)、噬菌體載體(phage vector)、 柯氏質(zhì)粒載體(cosmid vector)、病毒載體(virus vector ). 按作用分：克隆載體(cloning vector )、表達(dá)載體(expression vector)、穿梭載體(shuttle vector),克隆載體(cloning vector) 用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。主要由細(xì)菌質(zhì)?；蚺c其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的DNA重組構(gòu)建（pBR322）。 表達(dá)載體(expression ve

5、ctor) 使目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)的載體?？蓪⒅亟M體DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載荷的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯（pcDNA3）。,穿梭載體(shuttIe vector),能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來穿梭的載體。 其可同時(shí)具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和真核生物可識(shí)別的 復(fù)制原點(diǎn)或酵母菌的自主復(fù)制序列（ARS），它即能在 原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)。主要用 于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。,質(zhì)粒載體,具有復(fù)制起始點(diǎn)，這是質(zhì)粒自我增殖的必要條件。 具有較小的分子量，較高的拷貝數(shù)，是一個(gè)松弛型的質(zhì)粒。 具有某種選擇性標(biāo)記以區(qū)別轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。大多是一些抗菌素抗性基因

6、，賦予受體細(xì)胞對(duì)某些抗生素的抗性，為轉(zhuǎn)化子選擇提供便利。（Ampr；Tetr） 具有若干限制性內(nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)，便于外源基因插入。,是細(xì)菌染色體外能夠自我復(fù) 制的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子。,克隆載體: pBR322,特點(diǎn)： 分子量小，4.3kb，便于操作。 有兩個(gè)抗性基因，便于轉(zhuǎn)化子篩選。 有幾個(gè)常用的限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)，分布在抗性基因上，7種位于四環(huán)素選擇標(biāo)記上，4種位于Amp抗性基因上。外源基因的插入將破壞抗性基因的完整性，導(dǎo)致抗性基因插入失活，這種特性可用于區(qū)分重組和非重組分子。 松弛性質(zhì)粒，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)有較高的拷貝數(shù)，當(dāng)細(xì)菌蛋白質(zhì)合成停止時(shí)，它仍能繼續(xù)復(fù)制。,TA 克隆,A,A

7、,TOPO-TA,原核 His-tag: pQE系列(Qiagen), pET22(Novagen) GST-tag: pGEX系列(Pharmacia),表達(dá)載體：帶有調(diào)控基因表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄與翻譯元件，如啟 動(dòng)子等，這些調(diào)控元件應(yīng)與宿主細(xì)胞相適應(yīng)。,pcDNA 3系列 (Invitrogen)，,真核表達(dá)載體：大多是穿梭載體。,pFLAG-CMV系列(Sigma),DNA分子的體外連接：方法,粘性末端：相同的粘性末端互相配對(duì)進(jìn)行連接,兩種情況：,（a）目的基因和載體用同一種限制酶切割后連接。載體 易自身環(huán)化。 用堿性磷酸酶(能除掉DNA兩端的5 磷酸基團(tuán)）處 理載體，可防止載體自身環(huán)化。,

8、（b）目的基因和載體用兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶 切割后連接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。,堿性磷酸酶處理：,平頭末端：,（1）增加連接酶的量 （連接酶對(duì)平末端DNA的Km 約高于粘性末端DNA100倍 ） （2）在末端加上一個(gè)人工接頭，內(nèi)含有一定的限制性內(nèi) 切酶位點(diǎn)，經(jīng)酶切處理產(chǎn)生粘性末端，然后與載體 連接。如加上一個(gè)人工接頭內(nèi)含GAATTC序列，用 EcoRI酶切，產(chǎn)生EcoRI 粘性末端。,Eco R,Eco R,Eco R,連接策略：,pCMV,連接濃度：,片段與載體連接機(jī)率自身環(huán)化 一般計(jì)算公式： 粘性末端： 載體片段含量（ng）/載體長度（kb） 1 DNA片段含量（ng）/

9、 DNA片段長度（kb） 3-5 平末端 1：5 10,連接反應(yīng)：,10ul 體系,H2O Buffer Vector Insert ligase,14過夜,連接反應(yīng)條件 連接酶的活性；DNA的純度；載體與目的基因的比例； PH值7.2-7.8適宜；14(不高于16)過夜,連接酶：兩種,DNA連接酶：連接雙鏈中兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，封閉雙螺旋骨架缺口。需要一條DNA鏈的3-末端具有游離的OH，另一條DNA鏈5-末端的磷酸基團(tuán)-P，吸能反應(yīng)，需ATP存在。也可做DNA修復(fù)。但不能連接兩條單鏈DNA分子和環(huán)化的單鏈DNA分子。而且只能連接粘性末端。 T4 DNA連接酶：是從感染T4噬菌體

10、的Ecoli中分離得到的一種連接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接頭。用途比DNA連接酶廣泛，是分子生物學(xué)研究及基因克隆中較常用的連接酶。,其他酶：末端修飾酶,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase） 簡稱末端轉(zhuǎn)移酶。在合適的反應(yīng)系統(tǒng)中，這種酶使DNA片段平末端的3-OH加上同聚核苷酸，產(chǎn)生具有 poly（A）、或poly（T）、或poly（G）、或poly（C）的粘性末端。 堿性磷酸酶 根據(jù)DNA重組的需要，為防止兩DNA片段末端之間連接，經(jīng)常采用堿性磷酸酶處理，使DNA末端的5-P成為5-OH。目前采用的堿性磷酸酶有兩種，即來源

11、于大腸桿菌的細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和來源于小牛腸的小牛腸堿性磷酸酶（CIP）。CIP的比活性比BAP高出10倍以上，而且對(duì)熱敏感，便于加熱使其失活。,重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞：,把重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增.根據(jù)所用載體的特性選擇適宜的受體細(xì)胞（原核，真核）及選擇適宜的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法。 受體細(xì)胞的要求：必須具備使外源DNA進(jìn)行復(fù)制的能力（提供復(fù)制所需的原料）而且還應(yīng)該能夠表達(dá)由導(dǎo)入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的選擇與鑒定。,重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞：途徑,轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌（感受態(tài)菌）的過程 轉(zhuǎn)染：噬菌體、病毒、或以它作為載體構(gòu)建的重組子主

12、動(dòng)或被動(dòng)被導(dǎo)入細(xì)胞的過程。 感染：以病毒為載體的重組子，在體外包裝成具有感染力的病毒顆粒，通過感染受體細(xì)胞，然后整合到受體細(xì)胞基因組上。,轉(zhuǎn)化,受體細(xì)胞：大腸桿菌，基因工程中最常用的宿主細(xì)胞 轉(zhuǎn)化機(jī)理：細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)特性由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變。 轉(zhuǎn)化效率： 只有很少比例的細(xì)胞有能力摻入質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化時(shí)大約在1000個(gè)DNA分子中，只有一個(gè)DNA分子獲得成功。一般每微克完整的pBR322DNA產(chǎn)生105-107 轉(zhuǎn)化細(xì)胞,感受態(tài)菌制備,感受態(tài)：細(xì)菌細(xì)胞處于一個(gè)容易吸收外源DNA狀態(tài)，這種狀態(tài)的細(xì)菌稱為感受態(tài)菌。 氯化鈣法： 氯化鎂法： 電轉(zhuǎn)法：,氯化鈣法：原理,快速生長的細(xì)菌用低

13、滲低濃(50 100mM) 的氯化鈣（CaCl2)處理，使細(xì)胞腫脹成球形 加入質(zhì)粒后，即于細(xì)胞表面形成抗DNAase的羥基-磷酸鈣復(fù)合物 經(jīng)42熱休克后，復(fù)合物被細(xì)胞吸收。 非選擇性培養(yǎng)基上生長數(shù)小時(shí)，球狀細(xì)胞復(fù)原開始增殖,抗生素基因表達(dá)。,重組子的篩選：,根據(jù)重組體 的表型篩選,抗性基因插入失活：生存或是毀滅？,互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑篩選,LacZ-受體菌編碼 半乳糖苷酶羧基端（C 端）片斷,載體編碼一半乳糖 苷酶氨基端（N端）的肽,插入失活：,互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑篩選,4290s,+900ul LB,37 45min,3*1ml菌液,沉淀+0.5mlCaCl2,6000rpm 5min,冰浴30mi

14、n,6000rpm 5min,沉淀+0.1mlCaCl2,+10 ul 連接產(chǎn)物,+10 ulPBR322,陰性對(duì)照,A+T,A+T,陽性對(duì)照,Amp,Tet,冰浴30min,陽性克隆的鑒定：,挑菌落，小抽質(zhì)粒，電泳,菌落PCR,94 10 min 30s 40s 1min 72 8min 4 hold,X 30,堿裂解法,堿裂解法,原理：pH值介于12.0-12.5范圍內(nèi)，線形的DNA和環(huán)狀的質(zhì)粒DNA變性，中間的氫鍵短裂，線狀DNA變性后互相分開，而環(huán)狀分子雙螺旋主鏈骨架彼此盤繞，互補(bǔ)兩條鏈緊密合在一起。變性處理的質(zhì)粒DNA和染色體DNA通過致冷或恢復(fù)中性pH，開始復(fù)性。環(huán)狀分子由于本身合

15、在一起，所以復(fù)性迅速而準(zhǔn)確。線狀DNA變性時(shí)彼此分開，復(fù)性慢而不準(zhǔn)確，互相之間聚集形成較大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，與變性蛋白質(zhì)和RNA一道沉淀下來，上清液中留存下的主要是環(huán)狀DNA分子和少量的可溶性蛋白質(zhì)和部分的RNA，這些可溶性蛋白質(zhì)和部分的RNA可 通過苯酚抽提及RNA酶處理去除。,試劑作用：,溶液I-葡萄糖、Tris.HCL、EDTA。低滲，細(xì)胞變的脆弱而易于裂解，EDTA螯和金屬離子，防止DNA降解。 溶液II- NaOH、SDS。 NaOH使細(xì)胞裂解，釋放出質(zhì)粒DNA和染色體DNA。 溶液III-醋酸鉀。降低反應(yīng)pH值，起中和作用。,Protocol:,1ml菌液,沉淀+S1 250ul,12000rpm 1min,徹底重懸,+S2 250ul,+S3 350ul,上清轉(zhuǎn)移至回收柱,+500ul W1,12000rpm 10min,輕柔顛倒4-6次 5min內(nèi),顛倒混勻,12000rpm 1min 棄去廢液,12000rpm 1min 棄去廢液,+700ul W2,+700ul W2,12000rpm 1min 棄去廢液,12000rpm 1min,12000rpm 1min