色譜分析概論[1].ppt---盧佩章院士.ppt

1、色譜分析概論,第一節(jié) 色譜法概述,一、色譜法的定義和用途 二、色譜法的特點(diǎn) 三、色譜法的起源 四、色譜法的分類 五、色譜法的發(fā)展,一、色譜法的定義及用途,定義：色譜法 (chromatography)，是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。 原理：利用物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，使混合物中的各組分分離。 以前學(xué)過(guò)的分離方法有： 1.沉淀法 是利用物質(zhì)溶解度的不同而進(jìn)行分離。 2. 蒸餾法 是利用有機(jī)物沸點(diǎn)的差異進(jìn)行分離。 3. 萃取法 是利用組分在水相和有機(jī)相（互不相溶）中的分配素?cái)?shù)不同進(jìn)行而分離。,色譜法的用途,用途：色譜法已廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域，是多組分混合物首選的分離分析方法。以中國(guó)

2、藥典2005版為例，一部收載中藥1146個(gè)品種，用薄層色譜進(jìn)行鑒別或含量測(cè)定的有1523項(xiàng)，用高效液相色譜進(jìn)行定量分析的有479種518項(xiàng)，用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)的有47種。二部收載的有1967個(gè)品種，采用高效液相色譜法的品種有848種?，F(xiàn)在色譜法已形成一門專門的科學(xué)。,二、色譜法的起源,1創(chuàng)立：1906年，俄國(guó)植物學(xué)家Tsweet 植物色素分離見(jiàn)圖示 2現(xiàn)狀：一種重要的分離、分析技術(shù) 分離混合物各組分并加以分析,還可以進(jìn)行制備 固定相除了固體，還可以是液體 流動(dòng)相液體或氣體 色譜柱各種材質(zhì)和尺寸 被分離組分不再僅局限于有色物質(zhì),碳酸鈣 （固定相）,色素混合液,石油醚 (流動(dòng)相）,1906年，Ts

3、weet發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象,色譜柱,植物色素分離圖示,三、色譜法的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣”,缺點(diǎn)：,高選擇性、高效能 、高靈敏度、分析速度快、應(yīng)用范圍廣,對(duì)未知物分析的定性專屬性差 需要與其他分析方法聯(lián)用(GC-MS,LC-MS),四、色譜法的分類,1按兩相分子的聚集狀態(tài)分類,流動(dòng)相 固定相 類型,超臨界流體色譜法流動(dòng)相為超臨界流體,色譜法分類（續(xù)前）,2按固定相的固定方式分類,3按分離機(jī)制分類,分配色譜 吸附色譜 離子交換色譜 空間排阻色譜 毛細(xì)管電詠法 毛細(xì)管電色譜法,毛細(xì)管電泳,色譜法分類（圖示）,色譜法簡(jiǎn)單分類,毛細(xì)管電泳法,五、色譜法的發(fā)展,1、歷史 30年代 茨維特分

4、離綠葉色素，產(chǎn)生固液吸附色譜 40年代 液液分配色譜法 、TLC、紙色譜 50年代 GC出現(xiàn)使色譜具備分離和在線分析功能 60年代 推出了色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS） 70年代 HPLC出現(xiàn)使色譜分析范圍進(jìn)一步擴(kuò)大 80年代 出現(xiàn)了超臨界流體色譜法、毛細(xì)管電泳法 90年代 崛起的電色譜法，兼有毛細(xì)管電泳法與微 微填充柱色譜法的優(yōu)點(diǎn) 21世紀(jì) 色譜科學(xué)將在生命科學(xué)等的前沿發(fā)揮他不可替代的重要作用,2、展望,新型固定相和檢測(cè)器 手性固定相、浸透限制性固定相、灌注色譜固定相、生物色譜固定相等；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 色譜新方法的研究 超臨界流體色譜法、毛細(xì)管電詠法、毛細(xì)管電色譜法 色譜聯(lián)用技術(shù) GC-M

5、S、LC-MS、GC-FTIR 色譜專家系統(tǒng) 是一種色譜計(jì)算機(jī)聯(lián)用技術(shù),第二節(jié) 色譜過(guò)程和基本原理,一、色譜過(guò)程、分離原理及特點(diǎn) 二、色譜流出曲線和有關(guān)概念 三、分配系數(shù)與色譜分離,一、色譜過(guò)程、分離原理及特點(diǎn),色譜過(guò)程 指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過(guò)程,以吸附色譜為例見(jiàn)圖示 吸附 解吸再吸附 再解吸 反復(fù)多次洗脫被測(cè)組分分配系數(shù)不同 差速遷移 分離,圖示,分配系數(shù)的微小差異吸附能力的微小差異 微小差異積累較大差異吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強(qiáng)的組分后流出back,續(xù)前,色譜分離原理 色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異 平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來(lái)衡量,色譜分離特點(diǎn) 1不

6、同組分通過(guò)色譜柱時(shí)的遷移速度不等 提供了分離的可能性 2各組分沿柱子擴(kuò)散分布峰寬 不利于不同組分分離,二、色譜流出曲線和有關(guān)概念,色譜流出曲線和色譜峰,流出曲線(色譜圖)：電信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線 基線： 無(wú)樣品時(shí)的電信號(hào)，反映儀器噪音的情況 色譜峰：流出曲線上突起部分,圖172,續(xù)前,對(duì)稱因子,正常峰（對(duì)稱） 非正常峰 前沿峰 拖尾峰,色譜峰,fs=0.951.05,fs0.95,fs1.05,（二）保留值：色譜定性參數(shù),1.保留時(shí)間（tR)：從進(jìn)樣開(kāi)始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所需時(shí)間，即組分通過(guò)色譜柱所需要的時(shí)間 2.死時(shí)間（t0）：不被固定相溶解或吸附的組分的保留時(shí)間。即，分配系數(shù)為零的組

7、分。,3.調(diào)整保留時(shí)間（ tR）：組分的保留時(shí)間與死時(shí)間之差值，即組分在固定相中滯留的時(shí)間,圖片,4.保留體積（VR）：從進(jìn)樣開(kāi)始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所消耗的流動(dòng)相的體積,5.死體積 (V0) ：由進(jìn)樣器至檢測(cè)器的流路中未被固定相占有的空間。,6.調(diào)整保留體積VR：保留體積與死體積之差，即組分停留在固定相時(shí)所消耗流動(dòng)相的體積,7.相對(duì)保留值ri,s(選擇性系數(shù))：調(diào)整保留值之比,8.保留指數(shù)Ix,指將待測(cè)物的保留行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保留行為(已知范圍內(nèi)組分的定性參數(shù)),Ix: 待測(cè)組分的保留指數(shù)，z與z+n為一對(duì)正構(gòu)烷烴的含C數(shù)，一般n為1。tR(X) 應(yīng)介于t R(Z)和 t R(Z

8、+n)之間,（三）色譜峰高和峰面積,2.峰面積A：指色譜曲線與基線間包圍的面積,1.峰高h(yuǎn)：指組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)的檢測(cè)信號(hào)，即色譜峰頂至基線的距離,（四）色譜峰區(qū)域?qū)挾龋荷V柱效參數(shù),3.峰寬W：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點(diǎn)切線與基線相交的截距,1.標(biāo)準(zhǔn)差：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點(diǎn)距離的一半 對(duì)應(yīng)0.607h處峰寬的一半 注：小，峰窄，柱效高 2.半峰寬W1/2：峰高一半處所對(duì)應(yīng)的峰寬,注：除了用于衡量柱效，還可以計(jì)算峰面積,圖示,（五）分離度R(分辨率),相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍,衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù),討論：,三、分配系數(shù)與色譜分離,分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù),1.

9、分配系數(shù)K(平衡常數(shù))：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡后，在固定相與流動(dòng)相中的濃度比（色譜過(guò)程的相平衡參數(shù)）,注：K為熱力學(xué)常數(shù) 與組分性質(zhì)、固定相性質(zhì)、流動(dòng)相性質(zhì)及溫度有關(guān) 實(shí)驗(yàn)條件固定，K僅與組分性質(zhì)有關(guān),2.容量因子k (容量比，分配比)：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的質(zhì)量比,3.分配系數(shù)與容量因子的關(guān)系,（二）分配系數(shù)和容量因子與保留時(shí)間的關(guān)系,保留比R：衡量溶質(zhì)分子在色譜柱上相對(duì)移行速度,續(xù)前,設(shè)R為單位時(shí)間內(nèi)一個(gè)分子在流動(dòng)相中出現(xiàn)的幾率,設(shè)1R為單位時(shí)間內(nèi)一個(gè)分子在固動(dòng)相中出現(xiàn)的幾率,續(xù)前,討論： 色譜條件一定時(shí)，tR主要取決

10、K的大小 （色譜法基本的定性參數(shù) ）,K，tR ，組分后出柱 K=0，組分不保留 K ，組分完全保留,（三）色譜分離前提,結(jié)論：各組分分配系數(shù)K或容量因子k不等是分離的前提。選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等而分離.組分一定時(shí)，改變流動(dòng)相、固定相和溫度，可改變K。,第三節(jié) 基本類型色譜法的分離機(jī)制,根據(jù)色譜法的作用機(jī)制不同，有多種類型色譜方法，以下列四種為基本類型：,一、分配色譜法 二、吸附色譜法 三、離子交換色譜法 四、空間排阻色譜法,一、分配色譜法,1.分離原理：將液體均勻地涂漬在惰性物質(zhì)(載體)表面上作為固定相，利用被分離組分在固定相與流動(dòng)相中的溶解度差別所造成的分配系數(shù)差別而被分離

11、。見(jiàn)圖示,狹義分配系數(shù),注：K與組分的性質(zhì)、流動(dòng)相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì) 以及柱溫有關(guān)next,圖示,分離機(jī)制 利用組分在流動(dòng)相和固定相間溶解度差別實(shí)現(xiàn)分離,連續(xù)萃取過(guò)程 back,2.固定相和流動(dòng)相,要求： 固定相機(jī)械吸附在惰性載體上的液體,常用的固定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等強(qiáng)極性溶劑 載 體惰性物質(zhì)，無(wú)吸附性性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)常用的有吸水硅膠、纖維素、多孔硅藻土等。,流動(dòng)相必須與固定相不為互溶石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷及苯等。,3.洗脫順序,正相色譜 固定相極性大于流動(dòng)相極性,主要分離極性樣品.極性弱的組分先被洗脫，極性強(qiáng)的組分后被洗脫。,反相色譜 固定相極

12、性小于流動(dòng)相極性,主要分離非極性樣品和中等極性樣品.極性強(qiáng)的組分先出柱，極性弱的組分后出柱。,1.分離原理 各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心,利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離.經(jīng)過(guò)吸附、解吸、再吸附、再解吸最后混合物得到分離.見(jiàn)圖示 吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,吸附系數(shù),二、吸附色譜法,注：Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動(dòng)相的性質(zhì)及溫度有關(guān)next,（流動(dòng)相的量很大， 常數(shù)）,圖示,a:吸附劑 m:流動(dòng)相 Xm:流動(dòng)相中的組分分子 Xa:固定相中組分的分子 Ym:流動(dòng)相分子 Ya:固定相中溶劑分子,吸附過(guò)程是試樣中組分分子與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中

13、心的過(guò)程。 back,m,2.固定相及其選擇,固定相是表面具有許多吸附中心的吸附劑，常用吸附劑硅膠表面的硅醇基為吸附中心。經(jīng)典液相柱色譜和薄層色譜使用一般硅膠，高效液相色譜常用球型或無(wú)定型全多孔硅膠和堆積硅珠。,（1）對(duì)吸附劑的要求 有大的表面積和足夠的吸附能力； 對(duì)不同的化學(xué)成分有不同的吸附力，能較好地把混合物分開(kāi)； 與流動(dòng)相、溶劑及樣品中各成分不起化學(xué)反應(yīng)； 在所用的溶劑及流動(dòng)相中不溶解； 顆粒均勻，操作過(guò)程中不會(huì)碎裂。,（2）吸附劑的類別,有機(jī)類 淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纖維素等 無(wú)機(jī)類 氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、 硅藻土等,（3）吸附劑的活度 因含水使吸附劑活度，含水量，活性(活度)

14、級(jí)別，活性,（4）吸附劑的選擇,a 硅膠：為首選吸附劑。本身具微酸性，適用于分離酸性及中性物質(zhì)，如有機(jī)酸、氨基酸、甾體等。next b 氧化鋁：氧化鋁具有分離能力強(qiáng)、活性可以控制等優(yōu)點(diǎn)。 堿性氧化鋁 pH 910 適于分析堿性、中性物質(zhì) 中性氧化鋁 pH 7.5 適于分析酸性堿性和中性物質(zhì) 酸性氧化鋁 pH 45 適于分析酸性、中性物質(zhì) C 聚酰胺: 氫鍵作用,氫鍵能力強(qiáng)，組分越后出柱,分離極性小的物質(zhì)，一般選用活性大些的吸附劑；反之，分離極性大的物質(zhì)，選用活性小的吸附劑。next,硅膠（SiO2H2O）,結(jié)構(gòu)：內(nèi)部硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)多孔結(jié)構(gòu) 表面有硅醇基氫鍵作用吸附活性中心,特性： 1）與極性物質(zhì)

15、或不飽和化合物形成氫鍵 物質(zhì)極性，吸附能力強(qiáng)極性吸附中心，不易洗脫 吸附活性次序：活潑型束縛型游離型 2）吸水失活105110OC烘干30分鐘(可逆失水)吸附力最大 500OC烘干(不可逆失水)活性喪失，無(wú)吸附力,適用：分析酸性或中性物質(zhì) back,3.流動(dòng)相及其選擇,（1）要求 應(yīng)使用較純?cè)噭?，含雜質(zhì)會(huì)影響洗脫能力 與樣品或吸附劑不發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 能溶解樣品中各成分，且各被分離組分有不同的K值 粘度小，易流動(dòng),（2）流動(dòng)相 流動(dòng)相的洗脫能力主要由其極性決定，極性強(qiáng)的流動(dòng)相分子占據(jù)極性中心的能力強(qiáng)，洗脫能力就強(qiáng)。流動(dòng)相的選擇要依據(jù)樣品的極性、吸附劑的活性而定。,（3）常用溶劑的極性,石油醚環(huán)己烷

16、二硫化碳四氯化碳三氯乙烷苯甲苯二氯甲烷乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇吡啶酸水,（4）流動(dòng)相的選擇 用硅膠或氧化鋁作色譜分離時(shí)，如被測(cè)成分極性較大，用活性較低的吸附劑，極性較大的沖洗劑；被測(cè)成分極性較小，選用活性較強(qiáng)的吸附劑，極性較小的沖洗劑,4.洗脫順序,吸附弱的組分先被洗脫，吸附強(qiáng)的組分后被洗脫。吸附的強(qiáng)弱與組分的性質(zhì)(極性、取代基的類型和數(shù)目、構(gòu)型）有關(guān)。一般規(guī)律是： 非極性化合物，吸附弱。 基本母核相同，分子中取代基的極性越強(qiáng)，或極性基團(tuán)越多，分子極性越強(qiáng)(但要考慮其他因素的影響)，吸附能力越強(qiáng)。 分子中雙鍵數(shù)越多，則吸附力越強(qiáng)。 能形成分子內(nèi)氫鍵的化合物，其吸附能力降低。,常見(jiàn)化合

17、物的吸附能力的順序如下：,烷烴(-CH3、-CH2-)C=O)醛類(-CHO)硫醇(-SH)胺類(-NH2)酰胺(-NHCOCH3)醇類(-OH)酚類(Ar-OH)羧酸類(-COOH),三、離子交換色譜法,要求： 固定相離子交換樹(shù)脂 流動(dòng)相水為溶劑的緩沖溶液 被分離組分離子型的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物 1.分離原理見(jiàn)圖示,選擇性系數(shù),陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 RSO3-H+ + X+ RSO3-X+ + H+,注：Ks與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動(dòng)相性質(zhì)、 離子交換樹(shù)脂性質(zhì)以及溫度有關(guān)next,圖示,分離機(jī)制： 依據(jù)被測(cè)組分與離子交換劑交換能力（親和力） 不同而實(shí)現(xiàn)分離 back,E,離子交換劑,流動(dòng)相,可交

18、換離子,固定離子,2.固定相和流動(dòng)相,固定相是離子交換劑 常見(jiàn)的是離子交換樹(shù)脂，是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)高分子的聚合物。如，苯乙烯和二乙烯苯聚合 ，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑。 交聯(lián)度(degree of cross linking) 指交聯(lián)劑在原料中所占總重量的百分比 理論交換容量(exchange capacity)每克干樹(shù)脂能交換離子的毫摩爾數(shù) 粒度指離子交換樹(shù)脂顆粒的大小，一般以溶脹態(tài)所能通過(guò)的篩孔來(lái)表示。,流動(dòng)相水、緩沖溶液、或加入少量的乙醇、四氫呋喃、乙腈等有機(jī)溶劑，提高選擇性,3影響保留行為的因素,(1)溶質(zhì)離子的電荷和水合半徑：價(jià)態(tài)高，K 大；同價(jià)離子，水合離子半徑增大，K小。 常見(jiàn)陽(yáng)離子

19、在交換樹(shù)脂上的交換順序是： Fe3+A13+Ba2+pb2+Sr2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+C02+Mg2+Zn2+Mn2+Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+,常見(jiàn)陰離子在交換樹(shù)脂上的交換順序通常為： 檸檬酸根P043-S042-I-NO3SCN-NO2-C1-HCO3 - CH3COO- OHF-,續(xù)前,(2)離子交換劑的交聯(lián)度和交換容量：在一定的范圍內(nèi)樹(shù)脂的交聯(lián)度越大，交換容量越大，則組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)。,(3)流動(dòng)相的組成和pH：交換能力強(qiáng)的離子組成的流動(dòng)相有較強(qiáng)的洗脫能力。強(qiáng)離子交換樹(shù)脂的交換容量不隨流動(dòng)相的pH變化，調(diào)節(jié)pH值的主要作用是控制弱電解質(zhì)離解。,（四）

20、空間排阻色譜法,要求： 固定相多孔性凝膠 流動(dòng)相水凝膠過(guò)濾色譜 流動(dòng)相有機(jī)溶劑凝膠滲透色譜 分離機(jī)制見(jiàn)圖示,滲透系數(shù),注：Kp僅取決于待測(cè)分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動(dòng)相的性質(zhì)無(wú)關(guān)。當(dāng)KP=1時(shí)，分子能進(jìn)入所有的孔隙，KP=0時(shí)，分子不能進(jìn)入任何孔隙。 next,圖示,分離機(jī)制： 利用被測(cè)組分分子大小不同、在固定相上選擇性 滲透實(shí)現(xiàn)分離 back,2固定相和流動(dòng)相,固定相 多孔凝膠，主要性能參數(shù)是： 平均孔徑：凝膠孔徑大小。 排斥極限：不能滲透進(jìn)入凝膠的任何孔隙的某分子量(KP=0)。 分子量范圍：排斥極限(KP=0)與全滲透點(diǎn)(KP=1)之間的分子量范圍。 選擇凝膠時(shí)應(yīng)使試樣的分子量落入此范圍。,流動(dòng)相 要選對(duì)樣品的溶解好，又能潤(rùn)濕凝膠。粘度要低的溶劑，否則，會(huì)限制分子擴(kuò)散而影響分離效果。一般水溶性試樣選水溶液，非水溶性試樣選四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲