《凝血講義》PPT課件.ppt

1、,血 栓 與 止 血 檢 測,血 栓 與 止 血 檢 測,一、止血、凝血和纖溶機(jī)制,二、凝血及纖溶實驗室檢測進(jìn)展,三、血凝質(zhì)控 四、目前開展血凝項目的臨床意義 五、常見分析錯誤的原因分析,血 栓 與 止 血 檢 測,一、止血、凝血和纖溶機(jī)制,（一）血管壁的作用,1 . 血管的收縮（神經(jīng)反射；內(nèi)皮素、血管 緊張素；TXA2、5-HT）。 2. 血小板的激活（表達(dá)并釋放血管性血友病因 子vWf，導(dǎo)致血小板在損傷部位黏附和聚集）。 3. 啟動內(nèi)、外源凝血（因子的激活和組織因子 TF的釋放）。 4. 局部血黏度增高。,血 栓 與 止 血 檢 測,（二）血小板的作用,1. 形成血小板血栓(白色血栓)，機(jī)

2、械性修復(fù)受 損血管。 2.血管受損GPb 經(jīng)vWf 粘附 3. 釋放血小板第三因子（PF3）直接參與凝血反 應(yīng)。 4. 活化血小板在前激肽釋放酶及高分子量激肽 原存 在的條件下，直接激活F及F。 5. ADP(來自紅細(xì)胞)、凝血酶、膠原血小板GPb/a 結(jié)合Fg,血 栓 與 止 血 檢 測,（三）凝血因子的作用,(目前至少有14種),包括12個經(jīng)典的凝血因子（因子I-XIII,除因子VI)以及激肽釋放酶原（PK）、高分子量激肽原(HMWK). 除因子IV（Ca2+）外，其他均為蛋白質(zhì) 除因子III(TF)外，其他均存在于血漿中 整個凝血過程分三期： 凝血活酶形成期 凝血酶形成期 纖維蛋白形成期

3、,血 栓 與 止 血 檢 測,（三）凝血因子的作用,1 .外源性凝血途徑,2 .內(nèi)源性凝血途徑,3 .凝血共用途徑,注意, 12個凝血因子除F、F、和 部分 F外，主要產(chǎn)生于肝臟。 F、F、F、F是維生素K依賴因子 血友病（甲、乙、丙）三種分別缺少F、 F、F，均影響內(nèi)源性凝血途徑。,Intrinsic XII,XI,IX,VIII (APTT),Extrinsic-VII (PT),Prothrombin Thrombin,Fibrinogen Fibrin,Common Path (TT) FX FXa,XIIIa,XIII,Thrombin,Fibrin (strong),Fibrino

4、gen,Fibrin (weak),IX,XI,XIa,IXa,Xa,Va,XIIa,Prothrombin,TF-VIIa,(Prothrombinase),PL,PL,(Tenase),VIIIa,PL,X,Intrinsic Pathway,HKa,Extrinsic Pathway,TF Pathway,Protein C, Protein S, Antithrombin III,血 栓 與 止 血 檢 測,（四）抗凝血系統(tǒng)的作用,1.細(xì)胞抗凝作用：包括單核巨噬細(xì)胞、肝細(xì) 胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞,2.體液抗凝作用,抗凝血酶 （AT-）,肝素介導(dǎo)下,滅活凝血酶、Fa、Fa、Fa、Fa,滅活TF

5、/a、Fa,TFPI,蛋白C和蛋白S,滅活Fa、Fa 激活纖溶系統(tǒng),血 栓 與 止 血 檢 測,（五）纖維蛋白溶解（纖溶）系統(tǒng)的作用,組織型纖溶 酶原激活物 （t-PA）,尿激酶型纖 溶酶原激活物 (u-PA),激活,纖溶酶原 （PLG）,纖溶酶 （PL）,抗纖 纖溶酶 （ 2-AP）,纖溶酶原激活抑 抑制物PAI、 PAI2,降解,降解,纖維蛋 白原,纖維 蛋白,凝血 因子,降解為X、Y、D、E等碎片，生成D-D、r-r二聚體。上述碎片多聚體統(tǒng)稱為FDP,抗血小板聚集及抗血液凝固作用,二、凝血及纖溶實驗室檢測進(jìn)展,血液凝固是一個復(fù)雜的生理生化代謝過程 實質(zhì)是通過一系列酶促反應(yīng)，使血漿中呈液態(tài)

6、的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成固態(tài)的纖維蛋白絲，因而凝血是屬于生理生物化學(xué)范疇的課題 涉及血液學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等諸多領(lǐng)域由于這些相關(guān)學(xué)科研究的日益深入，不斷地給凝血的理論和實踐注入新的內(nèi)容，因此，在測定方法學(xué)上也由過去精密度低的方法過渡到精密度高的方法。,凝血及纖溶檢測方法,凝血及纖溶檢測項目越來越多， 目前應(yīng)用的實驗大體分為：篩篩選試驗 和確證試驗 方法學(xué)上又可分為三大類： 功能測定 免疫學(xué)測定 化學(xué)測定,功能測定,即傳統(tǒng)的最終以出現(xiàn)纖維蛋白作為判斷依據(jù)的方法 如凝血酶原時間（PT）、活化的部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT），以及用各種缺乏因子血漿測定某一凝血因子含量的方法等,功能測

7、定,PT測定是檢測凝血因子、的過篩試驗，要用統(tǒng)一標(biāo)有國際敏感指數(shù)(ISI)的凝血活酶試劑，在抗凝治療監(jiān)控和決定用藥劑量時，一定要用國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)報告 APTT是公認(rèn)較好的檢測“內(nèi)源性”凝血因子缺陷的過篩試驗，基本上可用于代替了過去的凝血時間測定，凝血時間的測定不管是玻片法還是試管法，都過于粗糙，敏感性太差。以前用于個別凝血因子缺乏的一些“糾正”試驗以及所謂的“凝血活酶生成”試驗，都因操作繁瑣，敏感性不高，已經(jīng)淘汰,免疫學(xué)測定,是近年來發(fā)展最快的檢測方法，其原理是以純化的被檢物質(zhì)為抗原，制備相應(yīng)的抗體，然后用抗原抗體反應(yīng)原理對被檢物質(zhì)進(jìn)行定性或定量測定 其方法采用ELISA、膠乳微粒凝

8、集、火箭電泳等方法。對許多新發(fā)現(xiàn)的抗凝因子，纖溶和纖溶抑制因子，纖維蛋白原裂解，纖維蛋白原和纖維蛋白降解產(chǎn)物，凝血酶原活化等過程中被切下的小肽，如我們目前開展的FDP、D-二聚體等的測定，基本上都用免疫學(xué)方法檢測,免疫學(xué)測定,從理論上講，免疫學(xué)測定不可能全部取代功能測定。因為免疫學(xué)測定的僅是該因子的抗原性，只能表明體內(nèi)存在該因子，但卻不能說明其是否有生物活性，而功能測定則是測該因子在凝血或纖溶中的生理生化功能。,化學(xué)測定,理論根據(jù)是：許多凝血、抗凝及纖溶因子本身是水解酶，可以用人工合成含有該酶酶切位點并帶有色原（指示劑）的寡肽作為底物，用常規(guī)的生化比色法加以測定。國內(nèi)外已有一些合成的底物用于測

9、定，諸如AT、凝血酶、F、Fa，以及纖溶酶等等。,三、凝血及纖溶實驗質(zhì)控,質(zhì)量是醫(yī)學(xué)檢驗工作的生命線，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)檢驗工作中的關(guān)鍵問題 凝血與纖溶檢驗質(zhì)量，關(guān)鍵在于診斷試劑。 以往，大量凝血檢測試劑由于各實驗室自行制備，手工操作難以達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和全國、全球標(biāo)準(zhǔn)化，也難以達(dá)到室內(nèi)、室間質(zhì)控的要求 為此WHO和血栓和止血委員會（ICTH）制定了一些標(biāo)準(zhǔn)或提供少數(shù)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品供各國校準(zhǔn)各種試劑和方法。國內(nèi)市場上能購到的商品試劑來源，國外主要有美國、法國；國內(nèi)有天津、上海、北京、福建等。,凝血及纖溶實驗質(zhì)控,我們臨床檢驗工作者都要從方法學(xué)與試劑的標(biāo)準(zhǔn)化等方面嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，全面系統(tǒng)地掌握新的知識動態(tài)，

10、進(jìn)一步提高質(zhì)量意識，使我國在凝血與纖溶測定總體水平上進(jìn)一步提高，與國際接軌。,凝血及纖溶實驗質(zhì)控,良好的檢測結(jié)果靠三方面來獲得: 精確度儀器：靠保養(yǎng)、靠校準(zhǔn) 可靠的試劑：合格，優(yōu)質(zhì) 規(guī)范的操作：嚴(yán)格按SOP文件,凝血及纖溶實驗質(zhì)控,重復(fù)性-靠什么來保證？ 1、 儀器的重復(fù)性：包括儀器內(nèi)部各個通道自身與各個通道之間的一致性 2、試劑、消耗品的重復(fù)性 只能在穩(wěn)定的儀器上獲得,凝血及纖溶實驗質(zhì)控,準(zhǔn)確性： 是儀器、試劑、消耗品、操作人員的綜合體現(xiàn) 包括：儀器的計算公式、標(biāo)準(zhǔn)曲線 試劑的保存、制備、存放效期 試劑污染來源的控制,質(zhì)控不規(guī)范洗針問題,高濃度清洗液洗針 腐蝕樣品針導(dǎo)致重復(fù)性下降 次氯酸鈉殘

11、留導(dǎo)致干擾結(jié)果 低濃度清洗液洗針 不能有效滅活凝血酶，造成交叉污染結(jié)果不準(zhǔn) 針容易堵塞、半堵塞造成樣本、試劑加樣不準(zhǔn),日常工作中應(yīng)注意的問題,（一）血標(biāo)本應(yīng)注意的問題1. 采血后標(biāo)本在低溫保存時間范圍：有報道在32保存血漿6、12、24h因子活性可分別消失50%、60%、95%，即使保存在4也分別消失5%、55%、70%。V因子活性在32分別消失25%、40%、80%，而在4則僅損失0%、5%、10%。因此測定APTT的血漿在-80至少可保存1個月、4為6h、20為4h、而32僅為2h。測定PT的血漿，在4為24h、20為6h、32為2h。,日常工作中應(yīng)注意的問題,2. 血液與抗凝劑比例：國際

12、血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會（ICSH）、國際血栓與止血委員會（ICTH）推薦使用3.2g/dl（含2H2O）或0.109mol/L的枸櫞鈉作為凝血因子檢查的抗凝劑。血液與抗凝劑按9：1比例混合，實際上是指抗凝劑與正常紅細(xì)胞壓積血液之間的比例而言。因此應(yīng)根據(jù)患者紅細(xì)胞比積（Hct）狀況隨時調(diào)整抗凝劑用量。,（二）實驗操作應(yīng)注意的問題,許多試驗誤差都來源于技術(shù)的錯誤。在實驗技術(shù)、試劑、溫度及pH值上很微小的變化都會導(dǎo)致試驗結(jié)果明顯的變化 離心因素。APTT、PT需乏血小板血漿，一般3000r/min離心10min后分離血漿。離心前注意標(biāo)本量，離心后注意血漿的量（Hct）以保證抗凝劑與標(biāo)本量最適比例 試驗前

13、檢查血漿是否有溶血、黃疸、脂血和出現(xiàn)凝塊。紅細(xì)胞膜含有磷脂，溶血標(biāo)本具有與血小板第因子（磷脂）相似的凝血活性，這種磷脂能縮短溶血血漿的APTT值。標(biāo)本中如果出現(xiàn)凝塊，無論凝塊多么小，均會影響試驗結(jié)果。,四、開展出凝血檢測的內(nèi)容與臨床意義,意義：1出血性疾病進(jìn)行診斷與分型 (血友病，血小板病) 2血栓性疾病的診斷與分型 (易栓癥，高凝狀態(tài)) 3DIC診斷與分期，療效觀察 4藥物治療監(jiān)測 (抗凝、抗血小板、溶栓治療) 5術(shù)前常規(guī)檢查,(一）凝血功能檢測,血漿凝血酶原時間測定(PT) 活化部分凝血活酶時間測定(APTT) 血漿纖維蛋白原測定(Fbg) 凝血時間（CT） 單因子抗原含量,血漿凝血酶原時

14、間（PT）,血漿凝血酶原時間（PT） 原理：該測定是在受檢血漿中加入鈣離子和組織因子后，觀察其凝固時間。 本試驗是反映外源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況的篩選試驗。 為外凝血途徑常用篩選試驗。正常參考范圍為11-13秒，超過3秒以上為異常 PT延長 先天性因子、缺乏癥，DIC，Vitk缺乏癥,肝臟疾病，抗 凝劑使用后 PT縮短 高凝狀態(tài)，血栓性疾病。如DIC早期、心肌梗塞、腦血栓形成、 多發(fā)性骨髓瘤。,INR值：國際標(biāo)準(zhǔn)化比率 計算公式： INR=（測量PT/正常PT）ISI 意義：它不但建立了測量值與正常人的對照，而且，排除了不同實驗室、不同試劑之間的差異，使它的值更具有臨床統(tǒng)一的意義。在

15、口服抗凝劑的監(jiān)測中更有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的臨床意義。,血 栓 與 止 血 檢 測,活化部分凝血活酶時間（APTT）,原 理,參考值,該測定是在受檢血漿中加入APTT試劑（接觸因 子激活劑和部分磷脂）和鈣離子后，觀察其凝固時間。 本試驗是反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝 血狀況的篩選試驗。,手工法：2840秒，較正常對照值延長10秒 以上為異常。,APTT,臨床應(yīng)用：活化部分凝血活酶時間（APTT）是檢查內(nèi)源性凝血因子的一 種過篩試驗，是用來證實先天性或獲得性凝血因子、的缺陷或是否存在它們相應(yīng)的抑制物，同時，APTT也可用來激肽釋放酶原(PK)和高分子量激肽釋放酶原(HMWK)是否缺乏，由于APTT的高

16、度敏感性和肝素的作用途徑主要是內(nèi)源性凝血途徑，所以APTT成為監(jiān)測普通肝素首選指標(biāo)，前后之比1.5-2.5為佳。 APTT縮短：DIC高凝期，血栓性疾病等。,E,XII,XI,Ca+,Ca+,Ca+,I,VII,II,X,V,IX,VIII,Ca+,纖維蛋白原（Fg）測定,正常凝血反應(yīng)的最終結(jié)果為纖維蛋白原反應(yīng)生成纖維蛋白，所以，纖維蛋白原的檢測也十分重要。參考值：2-4g/L 增高 見于糖尿病、急性心肌梗塞、急性感染、 結(jié)締組織病、急性腎炎、燒傷、多發(fā)性 骨髓瘤、休克、大手術(shù)、妊高癥、惡性 腫瘤、血栓前狀態(tài)、放射治療 .減低 見于DIC、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎和肝 硬化、先天性纖維蛋白原缺乏

17、癥,（二）抗凝血功能檢測,1.凝血酶時 檢查Fg有無異常 間測定(TT) 檢查循環(huán)血中有無抗凝物 共同途徑異常標(biāo)志 2.抗凝血酶 AT-活性增高出血 AT-活性降低血栓形成 3.血漿蛋白細(xì)胞抗原測定(PC) 必須轉(zhuǎn)換成活化的蛋白細(xì)胞(APC)才發(fā)揮抗凝作用 減低: 見于先天或獲得性PC缺乏癥，后者鑒于 DIC、肝病,血 栓 與 止 血 檢 測,血漿凝血酶時間,參考值,1618s，受檢TT值延長超過正常對照3s以上為延長,臨床意義,延長見于: 低（無）纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋 白原血癥；血中FDP增高（如DIC）；血 中有肝素或類肝素物質(zhì)存在（如肝素治 療中、SLE和肝臟疾病等。） 縮短：高F

18、IB血癥 鈣離子存在時或標(biāo)本有微 小凝結(jié)塊及PH呈酸性,抗凝血酶-3（AT-）,AT-是一種單鏈糖蛋白，屬于2球蛋白，主要由肝臟合成。AT-是依賴肝素的絲氨酸蛋白酶抑制物，故肝素作用于AT-的賴氨酸殘基，可使AT-的抗凝血酶作用增強(qiáng)1000倍。 AT-除對凝血酶有抑制作用外，對Xa、a、a、a、纖溶酶（血漿素），胰蛋白酶也有抑制作用，而且它對因子a的親和力大于凝血酶，所以對因子,抗凝血酶-3（AT-）,AT-活性增高：見于某些出血性疾病，如血友病、再生障礙性貧血、心瓣膜?。ㄐ牧λソ吒文[大者）AT-活性增高。腎臟疾病尿毒癥腎移植后12年內(nèi)個別AT-活性不增高者可因肺栓塞而死亡。服肝素類抗凝藥物后

19、，AT-的活性會增高，停藥后即可恢復(fù)正常 AT-活性減低：見于彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）、肝硬化、敗血癥、血栓形成性疾?。ㄐ募」Ｈo脈血栓形成等），先天性AT-缺陷，口服避孕藥. 動態(tài)觀察血中AT-含量的變化對監(jiān)護(hù)治療效果及了解預(yù)后情況均是有力的依據(jù),（三）纖維蛋白溶解功能檢測,1.纖溶酶原測定(PLG) 增高 表示纖溶活性 見于血栓前狀態(tài)和血栓 降低 表示纖溶活性 見于原發(fā)繼發(fā)纖溶和 PLG缺乏 2.纖溶酶纖溶酶抑制物復(fù)合體(PIC) 能較快地反映纖溶活性(PIC半衰期6h)，體內(nèi)纖溶情況的指標(biāo) 3.血漿硫酸魚精蛋白副凝試驗(3p試驗) 了解血中FDP.FM.尤其是X片段存在 4.D二聚體

20、測定(D-dimer)鑒別原發(fā)性、繼發(fā)性纖溶癥重要指標(biāo) 5.纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)纖溶亢進(jìn)的標(biāo)志,D-dimers 檢測臨床應(yīng)用,深靜脈血栓 (DVT) 和肺栓塞(PE) 活動性深靜脈血栓形成肺栓塞時，血漿D-D顯著升高；而陳舊性靜脈血栓，D-D往往不增高；動脈血栓性疾病，如冠心病，動脈硬化等，D-D增高不如靜脈血栓顯著。 排除肺栓塞（PE）D-D總體敏感性90-95%，特異性(45%68%), 值得納入診斷標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)D-D陰性, 臨床上中低度可疑PE，并且V/Q造影不確定的患者，可不再進(jìn)一步檢查。,D-dimers 檢測臨床應(yīng)用,彌散性血管內(nèi)凝血 (DIC) 和凝血因子消耗 繼發(fā)的纖

21、溶(與膿血癥，腫瘤，燒傷，先兆子癇等相關(guān)） 纖溶治療,D-dimers 檢測臨床應(yīng)用,D-二聚體不增高見于： 原發(fā)性纖溶癥時，D-二聚體不增高，是與繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)的鑒別要點。 陳舊性血栓形成時，D-二聚體不增高。 短時間內(nèi)的D-二聚體改變，常見于藥物應(yīng)用后。,血 栓 與 止 血 檢 測,血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物測定,參考值,小于5mg/L,臨床意義,增高見于:原發(fā)性纖溶癥、DIC、惡性腫瘤、急性早 幼粒細(xì)胞白血病、肺梗塞、DVT、肝臟疾 病等。 判定纖溶發(fā)展的階段 監(jiān)測外科手術(shù)是否使器官陷于纖溶酶原活 化的高風(fēng)險狀態(tài),D-dimers與FDP聯(lián)合應(yīng)用的意義,1）DIC的診斷：原發(fā)性纖溶亢進(jìn)時

22、，由于無血栓形成，F(xiàn)DP顯著升高，D-D一般不增高；繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)時，血漿D-D顯著升高，二者聯(lián)合檢測有利于提高DIC實驗室診斷的靈敏度和特異性，尤其對早期DIC的診斷更有意義 2）溶栓治療的監(jiān)測 ：溶栓治療深靜脈血栓或急性腦梗后2天內(nèi)D-dimers增高23倍，但FDP升高1013倍，以后逐漸下降；到7天時，D-D已低于溶栓前水平，但FDP仍比溶栓前高5倍。,（四）凝血和抗凝血功能篩選指標(biāo),1、凝血時間測定（CT） 2、活化部分凝血活酶時間測定（APTT） 3、血漿凝血酶原時間測定（PT） 4、血漿纖維蛋白原測定 (Fbg) 5、復(fù)鈣交叉試驗（CRT) 輕癥時過篩試驗可陰性,（五）纖溶活性檢查的篩選試驗,1、優(yōu)球蛋白溶解試驗（ELT) 2、血漿凝血酶時間（TT) 3、血漿硫酸魚精蛋白副凝集試驗（3P) 4、血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物測定 （FDP） 5、D-二聚體檢測,血 栓 與 止 血 檢 測,血小板檢測,（一）血小板計數(shù)（PC或plt）,參考值,（100300）109/L,臨床意義,1。血小板減少：PC低于100 109/L稱為血小 板減少。常見于：,血小板生成障礙,血小板破壞或消耗過多,血小板分布異常,血 栓 與 止 血 檢 測,2。血小板增高：PLT高于400 109/L稱為血小 板增多。常見于：,原發(fā)性增多,反應(yīng)性增多,（二