2生物大分子的制備.ppt

1、2.生物大分子的制備，2.1概述自然科學(xué)，特別是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，對蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能的研究是探索生命奧秘的中心課題，對生物大分子幾何及功能的研究首先要解決生物大分子的制備問題，但是生物大分子的分離純化和制備是非常細致而困難的工作。與化學(xué)產(chǎn)品的分離準備相比，生物大分子的制備具有以下主要特征：生物材料的組成非常復(fù)雜，經(jīng)常包含數(shù)百或數(shù)千種化合物。很多生物大分子的生物材料含量很低，分離純化的程序很多種多樣，過程很長。許多生物大分子一旦離開生物體內(nèi)的環(huán)境就很容易著火，所以分離過程中如何防止滅活是生物大分子提取制備的最困難的部分。生物大分子的制備幾乎在溶液中完成，很難準確估計

2、和判斷溫度、pH值、離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種成分的復(fù)合影響。生物大分子的制造通?？梢园凑找韵虏襟E進行：要準備的生物大分子的目的和要求，決定是科學(xué)研究、開發(fā)，還是發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)。建立相應(yīng)的可靠的分析測量方法是準備生物大分子的關(guān)鍵。通過文獻調(diào)查和預(yù)備性實驗，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)。生物材料的粉碎和預(yù)處理。分離純化方案的選擇和探索是最困難的過程。生物大分子制備物的均勻性(即純度)的鑒定，一維傳記靈動的屬相，二維傳記靈動的一點，或者HPLC和毛細管傳記靈動都應(yīng)該成為最高峰。產(chǎn)品的濃縮、干燥和保存。分析測量方法主要有生物學(xué)、物理、化學(xué)兩種茄子。生物學(xué)的測定方法主要包括酶的各種測定方法、蛋

3、白質(zhì)含量的各種測定方法、免疫化學(xué)法、放射性同位素示蹤法等。物理、化學(xué)方法主要包括比色法、氣相色譜法、液相色譜法、頻譜(紫外線、紅外、熒光等分光光度法)、電泳法、核磁共振等。在實際工作中，盡可能多地使用儀器分析方法，使分析測量更快、更容易。需要知道的生物大分子的物理，化學(xué)性質(zhì)：水和各種有機溶劑中的溶解性。生物大分子在各種溫度、pH值和各種緩沖液中的穩(wěn)定性。固體時溫度、含水量及董潔干燥時的穩(wěn)定性。各種物理性質(zhì)：分子的大小、穿膜的能力、電流動的情況、電場中的行為、離心沉積的表現(xiàn)、各種凝膠、裴秀智等填充物中的分配系數(shù)。其他化學(xué)性質(zhì)：各種蛋白質(zhì)酶，水解酶的穩(wěn)定性，各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性等。對其他生物分子的

4、特殊親和力。準備生物大分子的分離純化方法多種多樣。主要利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解性、極性、電荷、與其他分子的親和性等。各種方法的基本原理可以概括為兩個茄子方面。利用混合物各組成部分分布系數(shù)的差異，可以分配到鹽析、有機溶劑沉淀、層分析、結(jié)晶等兩個以上階段。將混合物放在物相(大部分是液體)上，通過物理力場的作用，將各組分布在不同的區(qū)域，實現(xiàn)傳記電泳、離心、超濾等分離目的。目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的核心技術(shù)是傳記游泳、分層分析、高速和超速離心。2.2根據(jù)生物大分子準備的預(yù)處理2.2.1生物材料的選擇準備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧?。材料的來源只是動?/p>

5、、植物、微生物及其代謝產(chǎn)物。所選材料含量高，來源豐富，準備工藝簡單，成本低，要盡量保持新鮮感，盡快加工處理。動物組織首先要去除結(jié)締組織、脂肪等不活動部分，粉碎后從適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛?，如果所需的成分在細胞?nèi)，則首先要粉碎細胞。植物必須先剝皮，去除脂肪。微生物材料要及時分離菌體和發(fā)酵液。生物材料如果暫時不提取，就要冷凍保存。動物材料需要深凍保存。2.2.2細胞的其他生物體或同一生物體其他部位破碎的組織，細胞容易破碎，使用的方法也不同。例如，動物器官的細胞膜比較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于比較堅固的纖維素、半纖維素構(gòu)成的細胞壁，必須采用專門的細胞粉碎方法。(1)機械法：1)研磨：將切碎的動物組織放

6、入蓮腳或勻漿機中，少量放入石英砂拋光或均質(zhì)化。2)組織搗碎：這是比較激烈的打破細胞的方法，通常用家用食品加工機打碎組織，然后用1000r/min 20000 r/min的內(nèi)刀組織搗碎機(即高速分散劑)打碎組織的細胞。(2)物理方法：1)將壞死細胞冷卻到15到20，然后室溫(或40) 2)超聲波處理方法：牙齒方法是利用超聲波的振動力粉碎細胞壁和細胞器。打破微生物細菌和酵母菌需要更多的時間。3)擠壓法：這是溫和完全打破細胞的方法。在1000105Pa2000105Pa的高壓下，通過小孔突然向大氣壓力釋放細胞顯液，細胞就完全破裂了。4)冷熱交替法：可以從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸。保持90多分鐘，

7、然后立即放入冰浴冷卻，這樣重復(fù)多次，大部分細胞都會破碎。(3)化學(xué)和生物化學(xué)方法：1)自溶方法：將新鮮生物物質(zhì)保存在一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢谧约簱碛械母鞣N水解酶(如蛋白酶和酯酶等)的作用下細胞結(jié)構(gòu)溶解，釋放細胞內(nèi)容物。2)溶脹法：細胞膜是天然半透膜、低滲透溶液和低濃度稀鹽溶液中的滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，使細胞膜膨脹，釋放細胞內(nèi)容物。3)酶解法：利用溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、酯酶等多種水解酶，可以專業(yè)分解細胞壁37，pH8至15分鐘。4)有機溶劑處理方法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或十二烷基硫酸鈉(SDS)等表面活性劑處理細胞，溶解細胞膜，使細胞破裂，牙齒方法也可與研磨方法結(jié)合

8、使用。2.2.3生物大分子的提取“提取”是在分離純化前字典處理或把破碎的細胞放入溶劑中，使分離的生物大分子充分釋放到溶劑中的過程。影響萃取的因素主要是目的產(chǎn)物在萃取溶劑中溶解的大小，固體向液體擴散的困難；溶劑的pH值和提取時間等。普通：極性物質(zhì)容易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑。堿性物質(zhì)能很好地溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)能很好地溶于堿性溶劑。溫度升高，溶解度增加。遠離等電點的pH值，溶解度增加。提取時選擇的條件應(yīng)有助于維持目的產(chǎn)品溶解度的增加及其生物活性。水溶液萃?。旱鞍踪|(zhì)和酶的萃取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解性大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取

9、生物大分子時需要注意的幾個茄子主要影響因素是1)鹽濃度(即離子強度)。離子強度對生物大分子的溶解度有很大影響，某些物質(zhì)(如DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物)在高離子強度下的溶解度增加。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶在低離子強度的溶液中具有很大的溶解度。例如，在純凈水中添加少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比純凈水大幅度增加，這稱為“鹽溶解”現(xiàn)象。溶鹽現(xiàn)象的發(fā)生主要是少量離子活動，減少偶極分子間極性基團的靜電吸力，增加溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。有時為了提高提取效率，需要降低或提高溶劑的極性。在水溶液中加入蔗糖或甘油會降低極性，增加離子強度(例如，KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4相加)會增加溶液的極性。2

10、) pH值：蛋白質(zhì)、酶和核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值相關(guān)。應(yīng)盡量避免過氧和過堿，一般在pH=68范圍內(nèi)提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點兩側(cè)。3)溫度：為防止變性和分解，準備活性蛋白和酶。萃取時通常在05的低溫下工作。4)防止蛋白酶或核酸酶的分解作用。通過加入抑制劑或調(diào)整提取液的pH、離子強度、極性等的方法，激活相應(yīng)的水解酶，阻止對想要凈化的蛋白質(zhì)、酶、核酸的分解作用。5)攪拌和氧化：攪拌可以促進提取物的溶解，一般溫和攪拌為宜，速度過快容易產(chǎn)生大量泡沫，與空氣的接觸面增加，會引起酶等物質(zhì)的變性停用。一般蛋白質(zhì)中含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，因此某些巰基往往是活性部位的必需組，如

11、果提取物中有氧化劑或與空氣中的氧接觸過多，巰基就會因分子內(nèi)或分子間的二硫結(jié)合而氧化，從而失去酶活性。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸，防止巰基氧化。有機溶劑與脂肪比較堅固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難以溶于水、稀鹽、稀酸、稀堿，經(jīng)常提取徐璐不同比例的有機溶劑。常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，牙齒溶劑可與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親水性。一些蛋白質(zhì)和酶可溶解在含有稀酸、稀堿、一定比例有機溶劑的水溶液中，在牙齒情況下，利用稀有機溶液提取往往有助于防止水解酶破壞，消除雜質(zhì)，提高純化效果。例如胰島素。2.3生物大分子的分離純化，因為生物體的組成成分太復(fù)雜，數(shù)千種或數(shù)萬種

12、生物分子在同一體系中，所以不可能有適合各種分子的固定分離程序，但分離大部分分離工作核心部分的基本手段是相同的。(阿爾伯特愛因斯坦，美國電視電視劇，動物名言)要避免盲目性，節(jié)約實驗探索時間，要認真參考前人的經(jīng)驗，減少迂回。常用的分離純化方法及技術(shù)包括沉淀法(包括鹽析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀等)、離心、吸附層分析、凝膠過濾層、離子交換層分析、親和層分析、快速準備型液相色譜法頻譜、傳記集中劑傳記游泳等。牙齒章節(jié)以介紹沉淀法為主。2.3.1沉淀沉淀沉淀是溶液中溶質(zhì)從液相變成固相析出的過程。沉淀法(即溶出法)操作簡單，成本低，不僅用于實驗室，還用于特定生產(chǎn)目的的制備過程，特別是在準備蛋白質(zhì)和酶時最常用

13、的方法分離和純化生物大分子。通過沉淀將目的生物的大分子轉(zhuǎn)移到固相沉淀中，或留在液體中，與雜質(zhì)初步分離。其基本原理是根據(jù)溶劑中其他物質(zhì)的溶解度達到分離的目的。徐璐不同溶解度的發(fā)生是溶質(zhì)分子與溶質(zhì)和溶劑分子間親和力的差異引起的。與溶解度的大小、溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)。溶劑成分的變化或添加特定的沉淀劑，溶液的pH值、離子強度、極性的變化都顯著地改變?nèi)苜|(zhì)的溶解度。生物大分子制造中最常用的幾種茄子沉淀方法是中性鹽沉淀(鹽析法)。多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。有機溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸、生物小分子的分離純化。選擇性沉淀(熱變性沉淀和酸堿變性沉淀):主要用于從特定耐熱性和特定pH值

14、中去除變性。等電點沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)和其他兩性物質(zhì)的沉淀，但牙齒方法單獨應(yīng)用少，與其他方法一起使用。有機聚合物沉淀：以PEG聚乙二醇(Polyethyene glycol)為沉淀劑的快速發(fā)展新方法。2.3.1.1中性鹽沉淀(鹽析法)溶液中加入中性鹽沉淀生物大分子的過程稱為“鹽析”。除蛋白質(zhì)和酶外，多肽、多糖、核酸等都可以用鹽析法沉淀分離。鹽析法牙齒最廣泛應(yīng)用的是蛋白質(zhì)領(lǐng)域已有80多年歷史的歷史，其突出優(yōu)點是成本牙齒低，不需要特別昂貴的設(shè)備。操作簡單，安全。對很多生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定作用。中性鹽沉淀蛋白的基本原理蛋白質(zhì)和酶都容易溶于水。因為牙齒分子的COOH，NH2，OH都是親水基團。牙齒基

15、團與極性水分子相互作用，形成水合層，圍繞在蛋白質(zhì)分子周圍形成1nm100nm的親水膠體，削弱蛋白質(zhì)分子之間的作用力。蛋白質(zhì)分子表面的極性基團越多，水合層就越厚，蛋白質(zhì)分子就越厚，親水膠體在水中有兩個穩(wěn)定的茄子因素：電荷和水膜。中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)和酶分子的親水性大小，因此添加了大量的中性鹽，然后搶走水分子，破壞水膜，暴露疏水區(qū)域，同時中和電荷，使親水膠體破壞，蛋白質(zhì)分子形成沉淀。鹽析圖見下頁“圖4”。在常用中性鹽選擇中，最重要的是(NH4)2SO4。這是因為它比其他普通鹽類有更好的優(yōu)點。1)溶解度很大。特別是在低溫下，仍有相當(dāng)高的溶解度。這在其他鹽類中是找不到的。酶和各種蛋白質(zhì)通常在低溫下穩(wěn)

16、定，因此鹽析工作也要在低溫下進行(04)。如下表所示，硫銨的零點溶解度比其他鹽類高得多。表2-1多種茄子鹽在不同溫度下的溶解度(克/100毫升水)0 20 80 100(NH4)2 so 4 70 . 6 75 . 4 95 . 3 95 . 3 103 Na2 so 4 . 9 18 . 9 43 . 3 44 3)變性不易誘發(fā)，具有酶和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定效果。有些酶或蛋白質(zhì)的濃度為23mol/L(NH4)2 so 4，保存了幾年。4)低成本價錢，廢液不污染環(huán)境。鹽析操作方法最常用的是固體硫酸銨添加法。用細粉研磨，慢慢均勻地放多次，接近計劃飽和度時，加鹽的速度更慢，局部硫酸銨濃度太高，盡量避免不需要的蛋白質(zhì)沉淀。(阿爾伯特愛因斯坦，Northern Exposure(美國電視電視劇)，在鹽析后，要在冰浴中留一段時間，等沉淀完成后再進行離心和過濾。低濃度硫酸銨中，鹽析可以離心，高濃度硫酸銨常用過濾方法。各種飽和度需要添加固體硫酸銨的量可在附錄中找到。鹽析曲線的制作如果想分離新的蛋白質(zhì)和酶，沒有文獻數(shù)據(jù)供參考，首先要確定沉淀牙齒物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下(講義p39):蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)或酶活性10 20 30 40 50 60 70 80 90 100硫酸銨飽和，低濃度蛋