四)液相色譜柱子使用及保養(yǎng)-0702.ppt

1、液相色譜實(shí)用技術(shù) 色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱的選擇,非極性或極性較小的樣品可用一般的C18柱 酸堿性的化合物建議選用填料經(jīng)封尾鈍化過的C18柱，PH范圍2-9（12） 糖類，氨基酸，有機(jī)酸，多環(huán)芳烴，GPC有專用柱,鍵合相色譜柱,以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上作為固定相。這種固定相要占所有柱填料的60-70% 優(yōu)點(diǎn) 固定相穩(wěn)定，不易流失 應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑 消除硅羥基的不良影響 缺點(diǎn) pH值不能小于2或大于8 同樣填料，各種牌號色譜柱不盡相同,反相HPLC柱（C18）的性能,常規(guī)C18填料的穩(wěn)定性 硅膠基質(zhì)填料 pH范圍：2-8 pH值大于7時鍵合相粉

2、碎或溶解 pH值小于2時鍵合相的化學(xué)鍵斷裂 經(jīng)常用緩沖液 固定相降解 填料新的鍵合技術(shù) - PH范圍 2-12 - 穩(wěn)定性好，使用壽命長,良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣,拿到一根新色譜柱時，先測柱效 保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄條件 定期檢測柱效,色譜柱的使用及操作,流動相的轉(zhuǎn)換 特別是GPC柱 流速(壓力)的變化幅度 溫度的變化幅度 專用色譜柱樣品及溶劑的要求,色譜柱的保養(yǎng)（一）,樣品方面 除去微粒及雜質(zhì) 了解樣品在流動相中的溶解度 如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出 了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用,樣品準(zhǔn)備,為什么溶劑和樣品要過濾?,溶劑和樣品過濾非

3、常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對分析結(jié)果的影響。 色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。 儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。 樣品過濾頭的類型： 30mm 內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.2m 和0.45m 兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。 13mm 內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2m 和0.45m 兩種規(guī)格,材料為纖維素。 3mm 內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.2m 和0.45m 兩種規(guī)格。處理樣品體積為7

4、l。,色譜柱的保養(yǎng)（二）,流動相方面 除去微粒 純度的要求 超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低（建議走空白檢驗(yàn)） 緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi) 緩沖液（鹽）的濃度 溶劑：色譜純，并與填料相匹配 溶劑中的雜質(zhì)含量 注意溶劑的相容性，避免使用不相容的溶劑 流動相對樣品的溶解度 有機(jī)溶劑或水的比例,溶劑過濾-除去微粒,不干凈的溶劑或在溶劑瓶中長菌的溶劑會阻塞溶劑過濾器以及色譜柱。 遵從下列建議可以提高性能，延長溶劑過濾器和色譜柱的壽命： 使用無菌溶劑瓶避免溶劑長菌。 用濾膜過濾溶劑去除微生物。 每兩天更換或過濾溶劑。 避免溶劑瓶直接日照。 向溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化鈉。

5、,溶劑準(zhǔn)備：過濾,選擇合適的濾膜,聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。 醋酸纖維濾膜：適用于水基溶劑，不適用于有機(jī)溶劑，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)的樣品。 尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸、70%乙醇、二氯甲烷、不適用于DMF二甲基甲酰胺 再生纖維素濾膜：具有蛋白質(zhì)吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑。 注意：1）每張濾膜只能用一次。 2）水相和有機(jī)相不要搞混。,溶劑的相溶性,溶劑信息,避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑： 鹵化物堿金屬溶液和相應(yīng)的酸溶液。 高濃度的無機(jī)酸例如：硝酸和硫酸。 能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。 含有過氧化物的色

6、譜級醚必須用氧化鋁干燥劑。 在有機(jī)溶劑中的有機(jī)酸溶液。 含有強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液。 四氯化碳和異丙醇或THF混合液。,溶劑截止波長,溶劑準(zhǔn)備：脫氣,流動相使用前為什么要脫氣？,流動相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會造成熒光猝滅。,常用的脫氣方法比較：,氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)

7、雜，且有毒性揮發(fā)污染 抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。 超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。 在線真空脫氣法：LC 真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。,典型的流速,流動相的保存,有機(jī)溶劑流動相: 室溫下密封,避光保存 緩沖鹽流動相: 當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用 低溫下密封保存,一般不超過3天 防止長菌 有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相: 低溫密封保存 防止有機(jī)相的揮發(fā) 選用適宜的容器,分,保存于聚乙烯瓶中的超純水,測試條件 水樣: 40ml trace enrichment 2.0

8、 ml/min 色譜柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 線性 100% 水 100% 乙腈 波長: 254 nm,保存于標(biāo)準(zhǔn)棕色玻璃瓶中的超純水,測試條件 水樣: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min 色譜柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 線性 100% 水 100% 乙腈 波長: 254 nm,色譜柱日常使用,過濾所有的溶劑和樣品 使用保護(hù)柱 不要把柱接頭上得太緊，損壞接頭螺紋易滲液 開機(jī)時，流速和柱壓要逐漸增加 進(jìn)樣前檢查色譜系統(tǒng)的各個接頭是否有漏液 注意色譜柱的pH值使用范圍 不要高溫下過長時間使用硅膠鍵合相柱子 關(guān)機(jī)前先用水沖洗整個

9、系統(tǒng)，移走緩沖液后再用有機(jī)相沖洗 不要高壓沖洗柱子,色譜柱保護(hù),在線的保護(hù)裝置,給色譜柱提供物理的保護(hù) 除去樣品及流動相中的顆粒 給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù) 防止分析柱被化學(xué)污染 裝置 在線過濾器 自裝填料保護(hù)柱 預(yù)裝保護(hù)柱,新型的保護(hù)柱,特點(diǎn) 高質(zhì)量, 高效填料 - 不損失柱效 增加分析柱效 - 增加適應(yīng)范圍 20mm柱長 - 臟樣品載荷能力大，能延長保護(hù)柱壽命 手可擰緊接頭，安裝時不需要工具 通用柱套 - 適用于所有的HPLC柱(3.9及4.6內(nèi)徑) 整體式- 使用方便，容易 各種不同填料配合色譜柱,色譜柱常見毛病,柱壓過高 多少才算高? 不同色譜柱有差異 不同系統(tǒng)有差異 不同溶劑有差異 柱效

10、低 重復(fù)性差 不出峰，回收率低,柱壓過高,為什么柱壓會過高 微粒堵塞 樣品 流動相 密封墊 柱床膨脹 不可逆吸附 細(xì)菌生長,柱效低,為什么柱效低 色譜柱被污染 過濾片部分堵塞 樣品、流動相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞 色譜柱內(nèi)的死體積 流動相pH值及組成不合適造成固定相流失 流速急劇變化造成固定相物理損壞 機(jī)械震動造成固定相產(chǎn)生裂縫 柱床收縮或干枯,重復(fù)性差、回收率低,實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差 色譜柱被污染 流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失 樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相過強(qiáng)或流動相過弱 非特異性吸附,色譜柱的日常清洗,對所做的樣品要有充分的了解 用對該樣品

11、洗脫能力最強(qiáng)的流動相清洗（如反相C18柱用100%甲醇或乙腈） 硅膠柱的一般方法 先用甲醇洗去極性雜質(zhì)，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 鍵合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗 柱子尺寸 柱子體積 沖洗體積 150 x4.6mm 2.5ml 50ml 200 x4.6mm 3.3ml 65ml 250 x4.6mm 4.2ml 80ml *再有雜質(zhì)嚴(yán)格清洗： 20倍柱體積的水-相同體積的0.05mol/L硫酸，最后用流 動相清洗,色譜柱的清洗-物理阻塞,在安裝柱前后測試壓力差 如果柱壓力太高，反裝色譜柱，并用10-20倍柱體積的 流動相沖洗色

12、譜柱，監(jiān)測壓力變化 若出現(xiàn)沉淀 (如：蛋白凝聚、細(xì)胞物、聚合物) 設(shè)法用相應(yīng)的可溶性溶劑，如 0.1% TFA/ 80% 乙腈, 6M 鹽酸胍, THF, HFIP 若仍無效，應(yīng)考慮更換過濾片,色譜柱頭塌陷的修補(bǔ),柱頭有塌陷可用填料修補(bǔ)： 1）松開柱入口接頭，拆下不銹鋼燒結(jié)過濾器，常見柱頭塌陷，剔掉無規(guī)則床層和帶色填料，使柱床呈白色水平面，滴一滴甲醇，加少許填料使沉降，如此反復(fù)多次后，用刮刀將填料刮平，放上清洗過的不銹鋼燒結(jié)過濾器，裝上柱入口接頭，把柱重新接到LC儀器上慢慢地增加流速，直到操作上限為止。 2）如果柱頭塌陷較深（小于1cm）可逐漸減低流速至零，再次拆下柱子，用填料修補(bǔ)直到塌陷填滿

13、為止。,色譜柱的存放,存放前的處理 除去雜質(zhì)、鹽等，防止細(xì)菌生長 合適的存放溶劑 兩端密封保存，避免色譜柱床干枯 避免機(jī)械震動 注意存放的溫度,色譜柱以外的因素（一）,“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！ 儀器問題：連接不好造成死體積 進(jìn)樣器 檢測器 管路，連接口 保護(hù)柱 在線過濾器堵塞 流動相問題：色譜柱未平衡好 進(jìn)樣量太大,色譜柱與儀器的聯(lián)接,不同公司產(chǎn)品，其接頭不同。處理不當(dāng)時，會造成： 色譜峰展寬（死體積）使柱效下降、或滲漏 解決辦法： 使用“通用”型接頭（錐箍及螺母） 這種錐箍在不銹鋼管上是活動的，因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。PEEK工程塑料的接頭，可用在所有類型的色譜柱上的。,色譜柱以外的因素（二）,柱壓過高問題，不一