工業(yè)微生物學實驗多媒體課件(十個實驗).ppt

1、微生物學實驗,實驗一,培養(yǎng)基的制備和滅菌,一、目的要求,學習和掌握各種培養(yǎng)基的制備方法，其中包括培養(yǎng)基的配制，包扎及滅菌技術。,二、基本原理,培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質。其中含有碳源、氮源、無機鹽、生長因子以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長繁殖還必須在最適酸堿度范圍內才能表現它們最大生命力，因此不同種類的微生物應將培養(yǎng)基調到一定pH值范圍。培養(yǎng)基種類很多，不同的微生物所需培養(yǎng)基不同。按其組成可分合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。按其物理狀態(tài)可分固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。按其特殊用途可分加富培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。,培養(yǎng)基配制后還必須進行

2、滅菌。滅菌和消毒是二個不同含義的名詞。消毒是指消滅病原菌或有害微生物，而滅菌則是殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物。,消毒與滅菌的方法很多，但總的可分為物理法與化學法兩大類。物理法包括加熱滅菌（干熱滅菌與濕熱滅菌），過濾滅菌、紫外線滅菌等?；瘜W方法主要是利用有機或無機的化學藥品對實驗室用具和其它物體表面進行滅菌與消毒。,三、實驗材料,每組同學需要準備以下材料（2人/組）： 小試管：12支（15*150mm） 培養(yǎng)皿：12套（9cm） 吸管：3支（1ml） 三角玻扒：2支 燒杯：1套（50ml，100ml，250ml，500ml） 量筒：1個（100ml） 玻棒：1支 分液漏斗：1套 藥匙：2把

3、剪刀：1把 鐵絲：數支 標簽貼紙：1張 鉛筆：1支 10ML玻璃吸管：1支,四、實驗內容,（一）、培養(yǎng)基的配制： 同學們先將試管貼好標簽。注明培養(yǎng)基名稱，組別，日期。標簽粘貼位置在離管口1/3管身處。 注意：標簽用鉛筆書寫，以防高溫滅菌時蒸汽模糊字跡。 操作圖示：,培養(yǎng)基配方：,四、實驗內容,肉湯培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉汁1g 自來水50ml PH7.2 麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁5g 自來水50ml 自然PH 固體培養(yǎng)基：由液體培養(yǎng)基加2瓊脂,1配制肉湯斜面培養(yǎng)基50 mL 將小燒杯置天平上，用藥匙取營養(yǎng)肉湯干燥培養(yǎng)基，稱取1 g先加少量自來水，溶解徹底再轉移到量筒，定容至50ml，然后倒在250 mL燒杯

4、里，加入瓊脂1g（2%），浸泡于液體培養(yǎng)基里，液面位置做好標記，在電爐上加熱融化后（注意補充蒸發(fā)的水分以保持原體積不變），用分液漏斗分裝6支小試管，每支5 mL左右（約試管高度的1/5左右）， 用硅膠塞塞好試管口，再用防潮紙和棉繩將試管塞罩住扎成一捆。 圖4-10 用漏斗分裝培養(yǎng)基及擺斜面 2配制麥芽汁斜面培養(yǎng)基（方法同上）,四、實驗內容,3注意事項： 本實驗使用調配好的“干燥培養(yǎng)基”，這種培養(yǎng)基是將新鮮配制的液體培養(yǎng)基用噴霧干燥法，真空干燥法，低溫干燥法或蒸發(fā)干燥法等將培養(yǎng)基內所含的水分去掉；或將培養(yǎng)基內的各種固形成分，經適當處理，充分混勻，便成干燥粉末而成。使用時只要按比例加入一定量的水，

5、經溶解，無需調pH，分裝，高壓蒸汽滅菌，即可使用。 “干燥培養(yǎng)基”成品很容易吸潮，在稱量時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再取另一種藥品。瓶蓋也不要蓋錯。 在燒杯融化瓊脂的過程中，人要在電爐旁看著，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出燒杯。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。注意帶上棉紗手套防止燙傷。 分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。,四、實驗內容,（二）培養(yǎng)基滅菌 培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮紙，便可滅菌。滅菌的時間和溫度按各培養(yǎng)基規(guī)定進行，以保證滅菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。培養(yǎng)基經滅菌后，可放在

6、37恒溫箱培養(yǎng)24小時，無菌者方可使用。 在實驗室里用得最多的加熱滅菌法是高壓蒸汽滅菌和干熱滅菌。一般培養(yǎng)基和滅菌水等用高壓蒸汽滅菌，而玻璃器皿常用干熱滅菌。蒸汽滅菌為105-121，15-20分鐘，干熱滅菌為160-170，1-2小時。目的都是使細菌體內蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。 在同一溫度下，濕熱殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質易于凝固，同時濕熱穿透力強，而且當蒸汽與被滅菌物體接觸凝成水分時，又可放出熱量，使溫度迅速增高，從而增加滅菌效力。,四、實驗內容,（三）包扎 1培養(yǎng)皿：以舊報紙密密包緊，一般以6套做一包，待滅菌。 2吸管：在距其粗頭頂端約0.5cm處

7、，塞一小段1.5cm長的棉花。棉花要塞得松緊恰當（過緊，吹吸液體太費勁；過松，吹氣時棉花會下滑），然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報紙條的的近左端，與報紙約呈60角，并將右端多余的報紙打一小結。 3三角玻扒：跟包扎吸管相似，將三角部分斜放在報紙條的近左端，與報紙約呈45角，并將右端多余的報紙打一小結。,四、實驗內容,五、實驗報告,思考題： 培養(yǎng)基應具備哪些條件? 在培養(yǎng)基配制操作過程中應注意什么問題?為什么? 培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng) 基是無菌的? 高壓蒸汽滅菌的關鍵為什么是高溫而不是高壓?高壓蒸汽滅菌 前為什么要將滅菌鍋內的冷空氣排盡?滅菌完畢后什么情況下 才可以

8、開鍋蓋取出滅菌物品? 玻璃器皿為什么在滅菌前要先行干燥? 對含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培養(yǎng)基進行高壓蒸汽滅菌時， 應采用多大壓力，多長時間滅菌為宜? 加熱蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌所要求的溫度低、時間短？ 干熱滅菌完畢后，在什么情況下才可開箱取物？為什么？,實驗二,微生物的接種,一、目的要求,訓練微生物接種的基本技能 基本建立無菌操作的概念,二、基本原理,接種技術是微生物學實驗及研究中的一項最基本的操作技術。接種是將純種微生物在無菌操作條件下移植到已滅菌并適宜該菌生長繁殖所需要的培養(yǎng)基中。為了獲得微生物的純種培養(yǎng)（指一株菌種或一個培養(yǎng)物中所有的細胞或孢子都是由一個細胞分裂、繁殖而產生的后代），要

9、求接種過程中必須嚴格進行無菌操作，一般是在無菌室內，超凈工作臺火焰旁或實驗室火焰旁進行。,根據不同的實驗目的及培養(yǎng)方式可以采用不同的接種工具和接種方法。常用的工具有接種環(huán)、接種針、接種鏟、玻璃涂棒，移液管及滴管等。常用的方法有斜面接種，液體接種，穿刺接種和平板接種，這些方法在后面的實驗一一進行訓練。,三、實驗材料,1各組所需的物品 接種用具：接種環(huán)（針、鉤），酒精燈，鑷子，消毒棉球，打火機， 標簽貼紙，廢物杯，一次性口罩，紙巾。 準備移植的菌種：參考下列接種菌名（由老師提供） 斜面培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基（6支），麥芽汁培養(yǎng)基（6支） 為下次實驗制備培養(yǎng)基的工具：參考實驗一 2注意事項： 酒精不足的

10、酒精燈請自行添加！注意：添加量不得超過容量的2/3。 將所有空白斜面貼好標簽，注明接入菌種的名稱，接種班別，接種組別， 接種日期。 接種前請將臺面用抹布清潔，擦干；雙手用洗手液清潔，擦干。 斜面接種，分清菌臺和培養(yǎng)基，挑取少量菌種，切勿劃破培養(yǎng)基。 接種時要關閉門窗，風扇，人不要隨意走動，端坐，平緩呼吸。 不同的菌種，不同的接種方式，使用不同的接種工具（針，鉤，環(huán)，吸管）。,四、實驗內容,1微生物的斜面接種技術： 從已長好微生物的菌種管中挑取少許菌苔接種至空白斜面培養(yǎng)基上的過程。 斜面接種的操作方法： （1）操作前，先用75%酒精擦手，作表面消毒，待酒精揮發(fā)后才能點燃 酒精燈。（可通常是點燃酒

11、精燈再用酒精擦手。） （2）用斜面接種時，將菌種管和斜面管握在左手的大拇指和其他四指之 間，使斜面和有菌種的一面向上，并處在水平位置。 （3）先將菌種管和斜面管的試管塞旋轉一下，以便接種時便于拔出。 （4）右手拿接種環(huán)，拿的方式與普通日常拿筆一樣。將要伸入試管部分 的金屬柄和金屬絲在酒精燈火焰上灼燒滅菌。 （5）用右手小指、無名指或手掌將菌種管和斜面管的試管塞同時拔出， 并把塞子握住，不得任意放在桌上或與其他物品接觸，再以火焰燒 管口。 轉下頁,（6）將上述在火焰上滅菌過的接種環(huán)伸入菌種管內，使接 種環(huán)在接種菌種前先在試管內壁上或空白培養(yǎng)基接觸 一下，使接種環(huán)充分冷卻，以免燙死菌種然后用接種

12、環(huán)在菌落上輕輕地接觸，刮取少許后將接種環(huán)自菌種 管內抽出。抽出時勿與管壁相碰，也勿使再通過火焰。 （7）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入斜面培管中，在斜面上， 自下而上劃線，使菌種沾附在培養(yǎng)基上，劃線時勿用 力，否則會使培養(yǎng)基表面劃破。 （8）接種完畢后將接種環(huán)抽出，灼燒管口，塞上試管塞。塞 試管塞時勿要用試管口去迎試管塞，以免試管在移動時 侵入雜菌。 （9）接種環(huán)在放回原位前，要經火焰灼燒滅菌。同時須將試 管塞進一步塞緊以免脫落。,接種菌名及接種劃線方式、接種工具： 細菌：枯草桿菌，大腸桿菌，單球菌，谷氨酸菌，假單孢桿 菌，巨大芽孢桿菌（6支） （接種方式：“之”字劃線，接種工具：接種環(huán)） 霉菌：

13、黑曲霉，黃曲霉，根霉（3支） （接種方式：點植或劃直線，接種工具：接種鉤或接種環(huán)） 酵母菌：面包酵母菌，古巴酵母菌，假絲酵母菌（3支） （接種方式：劃直線，接種工具：接種環(huán)）,圖4 11 各種無菌操作接種技術示意圖,圖4 11 各種無菌操作接種技術示意圖,圖2-1 各種無菌操作接種技術示意圖,圖2-2 穿刺接種操作過程示意圖,將接種好的斜面試管置最適合該菌種生長的恒溫培養(yǎng)箱里。 一般細菌于37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2d 一般霉菌和酵母菌于32恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3d,2生物的培養(yǎng)技術 培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)法,3. 為下次實驗準備平板培養(yǎng)基： 各組同學先三角瓶貼好標簽。注明培養(yǎng)基名稱，組別，日期。標簽粘貼位

14、置在離瓶口1/3瓶身處。注意：標簽用鉛筆書寫，以防高溫滅菌時蒸汽模糊字跡。 培養(yǎng)基配方：肉湯培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉汁2g 自來水100 mL PH7.2 麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁10g 自來水100 mL 自然PH 固體培養(yǎng)基：由液體培養(yǎng)基加2瓊脂 (1)配制肉湯平板培養(yǎng)基100 mL 將小燒杯置天平上，用藥匙取營養(yǎng)肉湯干燥培養(yǎng)基，稱取2 g加少量自來水，溶解徹底轉移到量筒，定容至100 mL，再裝入250 mL三角瓶，加入瓊脂2 g，浸泡于液體培養(yǎng)基里，用棉塞塞好瓶口，再用防潮紙和棉繩將棉塞罩住扎好。 (2)配制麥芽汁平板培養(yǎng)基（方法同上） 配制好的培養(yǎng)基進行滅菌！,五、實驗報告,1觀察記錄實驗結果:微

15、生物瓊脂斜面上的生長狀況。 2思考題: 接種環(huán)(針)接種前后灼燒的目的是什么?為什么在接種前一定要將其冷卻？如何判斷灼燒過的接種環(huán)已冷卻? 培養(yǎng)不同種類微生物能否用同一種培養(yǎng)基?為什么?細菌、酵母菌、霉菌通常用什么培養(yǎng)基培養(yǎng)？,實驗三,微生物的分離純化技術,一、目的要求,學習從混雜的微生物群體中分離與純化微生物 菌種的方法。 綜合練習微生物學實驗的各種無菌操作技術,二、基本原理,自然界中各種微生物混雜生活在一起，即使取很少量的樣品也是許多微生物共存的群體。人們要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。 微生物的分離、純化技術是指從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的

16、過程。微生物的平板分離純化技術自1880年被發(fā)明以來以有100多年的歷史，該技術的建立和發(fā)展為人類獲得豐富的微生物資源以及在工、農、醫(yī)、環(huán)境、動物細胞培養(yǎng)等方面的應用作出了巨大的貢獻。平板稀釋涂布、平板稀釋混合、平板劃線法是分離和純化微生物的常規(guī)方法。 分離純化技術其實是進行平板接種，即用接種環(huán)將菌種接至平板培養(yǎng)基上，或用移液管、滴管將一定體積的菌液移至平板培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)。平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)，分離純化菌種，活菌計數及在平板上進行各種實驗時采用的一種接種方法。 本實驗是利用分離純化技術來獲得三大類微生物的平板純培養(yǎng)物，為下次實驗微生物的形態(tài)觀察提供菌落形態(tài)的部分（形態(tài)觀察主要包括群

17、體形態(tài)（菌落形態(tài)）和個體形態(tài)觀察兩個方面。,三、實驗材料,1、各組所需物品： 無菌培養(yǎng)皿：兩包，12套 無菌三角玻扒：1支 無菌吸管：3支 接種器具：酒精燈，鑷子，消毒棉球，打火機，標簽貼紙，圓珠筆， 一次性口罩，紙巾。 制平板的培養(yǎng)基：肉湯瓊脂培養(yǎng)基（1瓶）, 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（1 瓶） (于殺菌鍋里保溫) 2、平板的制備： 將融化的瓊脂培養(yǎng)基,冷卻至50左右(以手背能忍受的溫度為準)溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于45時，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。 平板的制作應在酒精燈火焰旁進行，右手掌心握住三角瓶的底部，左手打開三角瓶棉塞，以右手的無名指和末指夾持瓶塞，灼燒瓶口。左手拿培養(yǎng)皿

18、，用左手的大拇子將皿蓋掀開一縫，至瓶口剛好伸入，向皿內注入培養(yǎng)基（約15 mL,厚度約0.5 mL左右），迅速蓋好皿蓋。 左手持培養(yǎng)皿稍加旋轉搖動，使培養(yǎng)基均勻分布于整個培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即為平板。,四、實驗內容,1. 平板混合分離法：大腸桿菌，枯草桿菌，單球菌（3皿） 將菌液分離樣品搖勻，用無菌移液管取1 ml的菌液移至無菌培養(yǎng)皿中，然后將融化，涼至50左右的培養(yǎng)基，在每個培養(yǎng)皿內各倒入約15 ml，搖勻，凝固，制成平板。 圖3-1 混合倒平板操作法示意圖,四、實驗內容,2. 平板劃線分離法：（3皿） 將菌液分離樣品搖勻，以無菌操作用接種環(huán)直接取試管中待分離純化的菌液

19、，將菌液點種在平板邊緣一處，取出接種環(huán)，燒去多余的菌種。將接種環(huán)再次通過稍打開皿蓋的縫隙（約30）伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻,然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線，劃線時平板面與接種環(huán)面成30-40，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線,接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內劃破培養(yǎng)基,線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊，劃線完畢，關上皿蓋.灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置接種架上。,圖3-2 平板劃線分離操作法示意圖,圖3-3 平板劃線菌落分離效果圖,3. 平板涂布分離法(3皿)：面包酵母菌，古巴酵母菌，假絲酵母菌 將菌液分離樣品搖勻，將0.1ml菌懸液小心地滴在平板

20、培養(yǎng)基表面中央位置。右手拿無菌三角玻扒在平板培養(yǎng)基表面上,將菌懸液先沿一條直線輕輕地來回推動,使之分布均勻，然后改變方向沿另一垂直來回推動,平板內邊緣處可改變方向用三角玻扒再涂布幾次。,四、實驗內容,圖3-4 涂布平板操作法示意圖,四、實驗內容,4. 平板點殖：黑曲霉，黃曲霉，根霉 （3皿） 一般用于觀察霉菌的菌落。在無菌操作下， 用接種針從斜面或孢子懸液中取少許孢子，輕輕 點種于平板上。,四、實驗內容,5. 生物的培養(yǎng)技術：培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)法 細菌于37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2d，平板倒置培養(yǎng)。 霉菌和酵母菌于32恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3d，平板 倒置培養(yǎng)。,五、實驗報告,1、觀察記錄實驗結果：微生物

21、的菌落特征 注:菌落特征描寫方法參考如下： 大?。捍?，中,小,針尖狀 形態(tài)：圓形，不規(guī)則等 干濕情況：干燥，濕潤，粘稠 高度：扁平，隆起，凹下 透明度：透明度，半透明，不透明 顏色：黃色，金黃色，灰色，乳白色，紅色，粉紅色，黑色等 邊緣：整齊，不整齊,2、思考題: 如何確定平板上某單個菌落是否為純培養(yǎng)？請寫出實驗的主要步驟. 你所做的涂布平板法和劃線法是否較好地得到了單菌落?如果不是,請分析其原因。 在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)微生物時為何培養(yǎng)皿需倒置?,五、實驗報告,實驗四,微生物的制片技術及基本形態(tài)的觀察,一、目的要求,識別各種細菌、酵母菌及霉菌的菌落特征 2. 學會細菌、酵母菌及霉菌的一般制片方法

22、 3. 觀察并掌握細菌、酵母菌及霉菌的個體形態(tài)及生長繁殖方式 4. 熟練掌握顯微鏡低倍、高倍物鏡及油鏡的使用技術,二、基本原理,微生物的形態(tài)觀察包括個體形態(tài)觀察和群體形態(tài)觀察（菌落特征觀察）。 微生物的個體形態(tài)都很小，必須借助顯微鏡，如相差顯微鏡，電子顯微鏡，光學顯微鏡才能看清。一般實驗室常用普通光學顯微鏡。 細菌細胞小而透明，如果菌體和背景沒有較大的明暗度差別，是很難看清它們的形態(tài)的，更不易于識別其結構，所以，觀察細菌時，往往要將細菌進行染色，借助顏色的反襯作用，可以更清楚地觀察到細菌的形狀及某些細胞結構。因此，微生物的染色及形態(tài)結果的觀察是微生物學實驗中十分重要的基本技術。微生物細胞染色的

23、的基本原理是根據物理因素和化學因素的作用。物理因素包括細胞及細胞質對染料的毛細現象、滲透、吸附、吸收作用等。化學因素則是根據細胞物質和染料的不同性質而發(fā)生的化學反應。一般酸性成分對堿性染料較易吸附，而且較穩(wěn)定。同樣，堿性成分對酸性染料也較易吸附，而且也較穩(wěn)定。 轉下頁,二、基本原理,酵母菌是不運動的單細胞真核微生物，大多數以出芽方式進行無性繁殖，本實驗通過美藍染液水浸片來觀察酵母的形態(tài)。美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變成為無色的還原型。因此，具有還原能力的酵母活細胞是

24、無色的，而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞則呈藍色或淡藍色，借此即可對酵母菌的死細胞和活細胞進行鑒別。 霉菌的菌絲體及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據。觀察霉菌的形態(tài)有多種方法，本實驗讓同學練習直接制片觀察法，再介紹載片培養(yǎng)觀察法。直接制片法是將培養(yǎng)物置于乳酸石炭酸液中，制成霉菌制片鏡檢。制成的霉菌制片的特點是：細胞不變形；具有防腐作用，不易干燥，能保持較長時間；能防止孢子飛散。載片培養(yǎng)方法是用無菌操作將培養(yǎng)基瓊脂薄層置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng)，霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內沿蓋玻片橫向生長。,三、實驗材料,1. 菌種：細菌，酵母菌，霉菌各3種，由上次實驗提供（同學們自

25、制的12皿平板） 2. 每組制片用具：接種工具1套，載玻片9片，蓋玻片6片，玻片架3個，吸水紙（或紙巾），一次性口罩，一次性手套，保鮮袋，吹風筒，顯微鏡 3. 染色劑1套：革蘭氏A、B液，沙黃，乙醇，無菌水，乳酸石炭酸，二甲苯，美藍，沖洗蒸餾水1瓶,四、實驗內容,觀察上次實驗結果記錄：細菌、酵母菌、 霉菌的菌落特征。 顯微鏡的構造、性能和使用方法。,圖4-1 普通光學顯微鏡,圖4-2 普通光學顯微鏡的構造,圖4-3 研究型(相差、熒光)顯微鏡,圖4-4 相差顯微鏡的成像原理,圖4-5 顯微鏡的光路,圖4-6 大腸桿菌,圖4-7 黑霉,圖4-8 正在分裂的細菌,圖4-9 孢子與酵母,四、實驗內容

26、,細菌、酵母菌、霉菌的制片技術及 個體形態(tài)觀察： （戴上一次性口罩） 革蘭氏染色法（各1片）：枯草桿菌，大腸桿菌 和單球菌 美藍染色（各1片）：面包酵母菌，古巴酵母菌 和假絲酵母菌 乳酸石炭酸浸片（各1片）：根霉，黃曲霉和 黑曲霉,A. 加小滴水,B. 涂成薄層,C. 固定菌體,圖4-10 涂片制備過程,四、實驗內容,革蘭氏染色注意載玻片要潔凈，滴無菌水和取菌不宜過多，涂片要均勻，不宜過厚；熱固定溫度不宜過高，（以玻片背面不燙手為宜），否則會改變甚至破壞細胞形態(tài)；水洗時不要直接沖洗涂面，而應使水從載玻片的一端流下，水流不宜過急，過大，以免涂片薄層脫落。 革蘭氏染色結果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏

27、染色操作的關鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染為陰性菌。 美藍染色注意染液不宜過多或過少，否則在蓋上蓋玻片的時,菌液會溢出或出現大量氣泡而影響觀察；同樣，蓋玻片的不宜平著放下，以免產生氣泡影響觀察。 霉菌直接制片注意挑菌和制片時要小心，盡可能保持霉菌的自然生長狀態(tài)，加蓋玻片時勿壓入氣泡，以免影響觀察。,4 注意事項：,五、實驗報告,1繪圖說明你所觀察到的細菌，酵母菌，霉菌的個體形態(tài)特征（共9個） 繪圖示例： 枯草桿菌G+ 放大倍數：10100,五、實驗報告,2思考題： 你認為哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭氏染色結果的正確性？其中最關鍵的環(huán)節(jié)是什么？ 現有一株細菌寬度明顯大于大腸

28、桿菌的粗壯桿菌，請你鑒定其革蘭氏染色反應。你怎樣運用大腸桿菌為對照菌株進行涂片染色，以證明你的染色結果正確性。 你的染色結果是否正確？如果不正確，請說明原因。 進行革蘭氏染色時，為什么特別強調菌齡不能太老，用老齡細菌染色出現什么問題？ 革蘭氏染色時，初染前能加碘液嗎?乙醇脫色后復染之前，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應分別是什么顏色?你認為革蘭氏染色中，哪一個步驟可以省去而不影響最終結果？在什么情況下可以采用？,實驗五,微生物生長，數量及大小的檢測,一、目的要求,學會用血球計數器測定酵母菌細胞數 學習和掌握用測微尺測量微生物細胞大小的方法,二、基本原理,微生物個體生長的時間較短，很快進入分裂繁殖階

29、段，個體生長難以測定。它們的生長一般以繁殖即群體生長作為微生物生長的指標。群體生長表現為細胞數目的增加或細胞物質的增加。測定數目的方法有顯微鏡直接計數法、平板計數法、光電比濁法等。 顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。 微生物細胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據之一。微生物大小的測定，需要在顯微鏡下，借助于特殊的測量工具即測微尺，包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺。,三、實驗材料,酵母菌液 顯微鏡、血球計數器、目鏡測微尺、鏡臺測微尺 3. 載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、膠頭吸管等,圖5-1 Tho

30、ma血球計數板 A.正面圖 B.縱切面圖 1.血球計數板 2.蓋玻片 3.計數室,16小格 25大格計數室,25小格 16大格計數室,圖5-2 計數室的兩種刻度形式,四、實驗內容,一.酵母菌數量的檢測 1. 顯微鏡直接計數法（每人1片） 注意事項: 取樣時先要搖勻菌液;加樣時計數室不可有氣 泡產生。 B. 調節(jié)顯微鏡光線的強弱適當。 2. 平板菌落計數法 (實驗八),四、實驗內容,二.酵母菌大小的檢測 注意事項：觀察時光線不宜過強,否則難以找到鏡臺測微尺的刻度;換高倍鏡和油鏡校正時,務必十分小心,防止接物鏡壓壞鏡臺測微尺和損壞鏡頭。 1.測微尺的校正（標定）： 兩重合線間鏡臺測微尺格數10 目

31、鏡測微尺每格長度(m)= 兩重合線間目鏡測微尺格數 2酵母菌大小的測定： 利用制好的血球器浸片，用高倍鏡測出寬和長各占目鏡測微尺的格數，再將測到的格數乘以目鏡測微尺（用高倍鏡時標定的）每格所代表的長度，即為酵母菌的實際大小。,四、實驗內容,三.準備下次實驗的培養(yǎng)基和玻璃器皿 淀粉平板培養(yǎng)：6瓶，100ml/瓶（肉湯培養(yǎng)基+可溶性淀粉） 明膠液化培養(yǎng)基：30支，5ml/支（肉湯培養(yǎng)基+明膠12%-18%） 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基(加杜氏小管)：30支，5ml/支 蛋白胨水：30支，5ml/支 培養(yǎng)皿：36皿，包成6包，6皿/包,五、實驗報告,1、結果記錄： (1)將計數結果記錄下表。A表示五個中方格中的

32、總菌數。B稀釋倍數為102。,注:1 mL菌液總數=A/525104B=5107A,五、實驗報告,（2）將目鏡測微尺校正結果填入下表: 接目鏡放大倍數：-10-,五、實驗報告,(3)將酵母菌大小測定結果填入下表：,五、實驗報告,2.思考題： 根據你的體會，說明用血球計數板計數的誤差主要來自哪些方 面？應如何盡量減少誤差，力求準確？ 某單位要求知道一種干酵母粉的活菌存活率，請設計1-2種可行 的檢測方法。 比較平板菌落計算法和顯微鏡下直接計算法的優(yōu)缺點幾應用。 在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數的物鏡來測 定同一細菌的大小時，其測定結果是否相同？為什么？ 為什么更換不同放大倍率目鏡和物

33、鏡時，必須用鏡臺測微尺重 新對目鏡測微尺進行校正？,實驗六,微生物的生理生化反應,一、目的要求,了解不同細菌對含氮及含碳化合物的分解和 利用情況 進一步掌握微生物的接種方法,二、基本原理,微生物代謝與其他生物代謝有著許多相似之處，也有不同之處。微生物代謝重要特征之一，就是代謝類型的多樣性，因此使得微生物在自然界的物質循環(huán)中起著重要的作用，同時也為人類開發(fā)利用微生物資源提供更多的機會與途徑。人們在微生物的分類鑒定工作中，常利用其生理生化反應作用作為重要依據。 本實驗分別安排微生物對生物大分子的分解利用（淀粉水解實驗水解試驗、明膠液化試驗），對含碳化合物的分解利用（糖發(fā)酵試驗）以及對含氮化化合物的

34、分解利用（吲哚試驗），讓同學們對微生物的代謝類型多樣性有一個初步和感性的了解，同時學習利用微生物形態(tài)、結構以及生化反應的特征對某些細菌進行初步的分類。 本實驗進一步學習平板接種法、穿刺接種法、液體接種法。,三、實驗材料,1培養(yǎng)基： 淀粉水解培養(yǎng)基：2皿 明膠液化培養(yǎng)基：2支 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基：4支 蛋白胨水培養(yǎng)基：2支 2. 接種用具：接種環(huán)（針、鉤），酒精燈，鑷子，消毒棉球，打火機，標簽貼紙，廢物杯，一次性口罩，紙巾，油性筆。 3. 實驗菌種：枯草桿菌、大腸桿菌、單球菌 4. 配置培養(yǎng)基的工具：1套,四、實驗內容,圖6-1 糖類發(fā)酵試驗,四、實驗內容,操作步驟： 1. 淀粉水解試驗：（2皿）

35、（1）翻轉平板使底皿背面向上，用油性筆在其背面玻璃上畫上三 個圓圈。 （2）用接種環(huán)在圓圈中間以點植的方式接上菌種。一皿接枯草桿 菌，另一皿接大腸桿菌。 （3）將接完種的平板倒置于37恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。 （4）觀察結果時，可打開皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕 旋轉，是碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現無色透明 圈，則說明淀粉已被水解，為陽性。透明圈的大小，說明該 菌水解淀粉能力的強弱，即產生胞外酶活力的高低。（以 “+”、“”表示有無透明圈）,四、實驗內容,（1）以穿刺接種法分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于明膠培 養(yǎng)基中。 （2）接種后置于20恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2-5d。 （3）觀察結果

36、時，注意培養(yǎng)基有無液化現象。（以“+”、 “”表示有無液化現象） 注意： 如果細菌在20時不能生長，則必須培養(yǎng)在所需的最適溫度下，觀察結果時需將試管從恒溫箱里取出，置于冰浴中，才能觀察液化程度。,2. 明膠液化試驗：（2支）,四、實驗內容,（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于 同種糖類培養(yǎng)基中，以作比較。 （2）接種后置于37恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。 （3）觀察結果時，看各管顏色變化及杜氏小管有無氣 泡。產酸產氣用“”表示；只產酸不產氣用“+”表 示；不產酸也不產氣用“”表示。,3. 糖類發(fā)酵試驗：（4支）,四、實驗內容,（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于蛋 白胨

37、水培養(yǎng)基中。 （2）接種后置于37恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。 （3）觀察結果時，在培養(yǎng)液中加入乙醚約1毫升（使呈明顯 的乙醚層）。充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片 刻，待乙醚浮于培養(yǎng)液上面時，沿管壁慢慢加入吲哚 試劑10滴。如吲哚存在，則乙醚層呈玫瑰紅色 （注意：加入吲哚試劑后，不可再搖動，否則紅色不明 顯）。以“+”、“”表示有無紅色的玫瑰吲哚。,4. 吲哚試驗：（2支）,四、實驗內容,肉湯培養(yǎng)基：100 mL，裝在250 mL三角瓶（加入1.5%瓊脂） 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：100 mL分裝10支大試管(加杜氏發(fā)酵 管)，10 mL /支 生理鹽水：250 mL,其中225 mL裝在500

38、mL三角瓶(加適量玻 珠)；18 mL分裝2支大試管，9 mL /支，剩余的丟棄 吸管：2支10 mL，5支1 mL 培養(yǎng)皿：6皿,準備實驗七的培養(yǎng)基和玻璃器皿：,五、實驗報告,1. 細菌對各種生理生化試驗反應的原理：,五、實驗報告,2細菌對各種生理生化試驗反應的結果：,五、實驗報告,（1）淀粉、明膠等生物大分子物質能否不經分解而直接被細菌吸 收？為什么？ （2）接種后的明膠試管可以置于37恒溫培養(yǎng)箱箱中培養(yǎng)，在培 養(yǎng)后你必須做什么才能證明水解的存在？ （3）假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗應該出現什 么結果？ （4）解釋在細菌培養(yǎng)中吲哚試驗的化學原理，為什么在這個試驗 中用吲哚的存

39、在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？,2. 思考題,實驗七,水和食品中微生物的檢測,一、目的要求,了解食品衛(wèi)生微生物學的重要性及其原理 學會水和食品中細菌菌落總數的測定方法和平板活菌計數法 3. 學會水和食品中大腸菌群數的測定方法,二、基本原理,水和食品中的微生物數量主要考慮到的是細菌特別是病原菌的數量。這些細菌主要來源于土壤、垃圾、糞便等，尤其是后者。若飲用水、釀造水和食品中發(fā)現有大腸群細菌，就有可能存在腸道病原菌，可能會危害人們的健康，因此，進行食品衛(wèi)生的微生物學檢驗是十分重要的。 一般情況下，主要是測定水和食品中細菌菌落總數和大腸菌群數。細菌菌落總數是指水中或食品檢樣經處理后，在一

40、定條件培養(yǎng)后，所得1 g或1 mL檢樣中所含細菌菌落的總數，其主要作為判定水和食品被污染程度的標志。大腸菌群是腸道最普遍存在和數量最多的一群細菌、常將其作為人畜糞便污染的標志。水和食品中大腸菌群數是以每100 mL（g）檢樣中大腸菌群最可能數（MPN）表示的。,三、實驗材料,水樣的采?。?池水，河水或湖水應距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中,盛滿后,將瓶塞蓋好,再從水中取出,最好立即檢查,否則需放入冰箱保存,時間不要超過六小時。 2. 其他實驗材料參考實驗講義P47,四、實驗內容,（一）、食品中細菌菌落總數和大腸菌群數

41、的檢測 食品中細菌總數：用平板菌落計數法測定（即菌種分離純化技術的平板混合法） 平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞,取一定量的稀釋液接種到平板上，經過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品的一個單細胞.統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以,長成的一個單菌落也可能來自樣品中2-3或更多個細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數的結果,現在已傾向使用菌落形成的單位(colony-forming units,cfu)而不以絕對菌

42、落數來表示樣品的活菌含量。,四、實驗內容,2食品中大腸菌群數: 用多管發(fā)酵法測定.包括初(步)發(fā)酵試驗,平板分離和復發(fā)酵試驗三個部分(略) 發(fā)酵管內裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基,并倒置一杜氏發(fā)酵小管.乳糖能起選擇作用,因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖,而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產酸產氣.為便于觀察細菌產酸情況，培養(yǎng)基內加有溴甲酚紫作為PH指示劑,細菌產酸后,培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色.溴甲酚紫還有抑制其他細菌如芽孢菌生長的作用。,圖7-1 食品檢樣稀釋及傾注平板示意圖,四、實驗內容,操作圖示：,四、實驗內容,（二）、準備下次實驗培養(yǎng)基（P30-31） (1)肉湯瓊脂培養(yǎng)基：100 mL，裝在250 mL三角

43、瓶(加2%瓊脂) (2)肉湯上層培養(yǎng)基：50 mL，分裝8小試管，每支5 mL（1/4試管） （加0.8%瓊脂） (3)蛋白胨水：30 mL分裝5支小試管,每支4.5 mL (4)吸管：1 mL6支 (5)培養(yǎng)皿：12皿，包成兩包，6個/包 （三）、觀察上次實驗結果記錄,五、實驗報告,1食品微生物學檢測結果的報告(格式)： 微生物學檢測結果的報告 送檢單位:有限公司 送檢樣品: 檢測項目:細菌總數和大腸菌群數 檢測方法: (1)食品中細菌總數: 用平板菌落計數法測定.(根據國標GB47892-94) (2)食品中大腸菌群數: 用多管發(fā)酵法測定.(根據國標GB47893-94) 檢測結果: (1

44、)食品中細菌總數檢測結果: (2)食品中大腸菌群數檢測結果:陽性結果記“+”;陰性結果記“_”。一支管一個記號。 結論: 檢測單位:華工生物工程級 檢測人(報告人): 日期:200-,五、實驗報告,2.思考題 為什么融化后培養(yǎng)基要冷卻至50左右才能倒平板？ 要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個關鍵？為什么？ 試比較平板菌落計數法和顯微鏡直接計數法的優(yōu)缺點及應用。 當你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時， 你認為問題在哪里？ 用傾注平板法和涂布平板法計數，其平板上長出的菌落有何不 同？為什么要培養(yǎng)較長時間（48小時）后觀察結果？ 大腸菌群的定義是什么？ 大腸菌群中的細菌種類，一般并

45、非是病原菌，為什么要選用大 腸菌群作為食品被污染的指標？,實驗八,噬菌體效價的測定,一、目的要求,學會噬菌體的檢查及其效價測定方法 學會觀察識別噬菌斑,二、基本原理,噬菌體的效價就是1 mL培養(yǎng)液中所含活噬菌體的數量。效加測定的方法，一般應用雙層瓊脂平板法。由于在含有特異宿主細菌的瓊脂平板上，噬菌體長生肉眼可見的噬菌斑。因此，能進行噬菌體的計數。但因噬菌斑計數方法其實效率難以接近100%（一般偏低，因為有少數活噬菌體可能未引起感染），所以為了準確地表達病毒菌懸液的濃度（效價）一般不用病毒粒子的絕對數量而是用噬菌斑形成單位（plague-forming units，簡寫成pfu）,三、實驗材料,

46、菌種 （1）噬菌體待檢液的制備：參照實驗講義P35 （2）指示菌液的制備：參照實驗講義P35 培養(yǎng)基及玻璃器皿 已在實驗七預先準備 其它器材 水浴鍋、電爐、酒精燈、接種環(huán)等,四、實驗內容,圖8-1 平板點滴法噬檢操作過程,四、實驗內容,圖8-2 單層瓊脂法噬檢操作過程,四、實驗內容,圖8-3 雙層瓊脂法測定噬菌體效價操作過程,四、實驗內容,1、噬菌體的效價 雙層法： (每組做3個稀釋度，每個稀釋度做2皿；另加對照1皿， 共7皿) 注意事項： 噬菌體對溫度極其敏感，一般噬菌體60下5分鐘絕大部分失活.因此加入上層培養(yǎng)基的溫度要嚴格保持50以下，為防止瓊脂凝固,此步操作要快,均勻鋪滿，不能出氣泡。

47、 為保證獲得單一，彼此分離的噬菌斑，培養(yǎng)皿蓋上和培養(yǎng)基表面不得有凝結水滴。正置培養(yǎng)，不能倒置。每皿噬菌體數量不能太多，維持100-300個為宜,否則噬菌斑不能分開而連成一片。 同組同學分工合作協調好，一位稀釋噬菌體同時移噬菌體液以及移指示菌液；一位倒制底層平板同時拿上層試管接好移液。,四、實驗內容,噬菌體效價測定操作圖示:,四、實驗內容,2、準備下次實驗配培養(yǎng)基和玻璃器皿(每實驗臺) 1）完全培養(yǎng)基 2）再生培養(yǎng)基 3）生理鹽水 4）緩沖液 A.0.1mol/L,PH6.0磷酸緩沖液. B.高滲緩沖液,于上述緩沖液中加入0.8mol/L甘露醇 5）原生質體穩(wěn)定液(SMM) 5mol/L蔗糖,2

48、0mol/LMgCl20.02mol/L順丁烯二酸,調PH6.5 6）促融合劑 40%聚乙二醇(PEG-4000)SMM溶液 7）玻璃器皿包扎： A培養(yǎng)皿：18皿，6皿/包，包成3包 B小試管：20支 C吸嘴：1盒（約60個） 3、觀察上次實驗結果,五、實驗報告,1、記錄雙層平板上的噬菌斑數目，計算噬菌體效價,注:噬菌體校價=pfu數稀釋倍數10,五、實驗報告,2、思考題： 測定噬菌體的效價，操作時要注意些什么才能測 定準確？ 計算噬菌體效價時，選擇30-300個pfu的平板計 數較好，為什么？ 如果在你的測定平板上，偶爾出現其他細菌的 菌落，是否影響你的噬菌體效價測定？,大型綜合實驗一,酵母

49、菌原生質體 誘變育種,一、目的要求,1觀察酵母菌子囊孢子的形成及學習酵母單倍體營養(yǎng)細胞 的制備方法； 2學習酵母原生質體的制備過程； 3掌握用化學誘變劑處理原生質體的操作方法； 4學會營養(yǎng)缺陷型篩選和鑒定的一般方法； 5綜合訓練微生物學實驗的操作技能和科研能力。,二、基本原理,在高滲壓溶液中，用酶法將細胞壁分解除掉，剩下由原生質膜包住的球狀胞體，稱為原生質體（Protoplast）。它保持了原細胞的一切活性。 原生質體誘變的原理是利用原生質體因去掉細胞壁屏障而對誘變劑的敏感性強和變異率高的特點來選育人們需要的變異菌株，是菌種選育的一種行之有效的方法。 原生質體可采用物理或化學因素誘發(fā)其基因的突

50、變?；瘜W誘變劑N -甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（簡稱亞硝基胍，NTG）對誘變選育營養(yǎng)缺陷型非常有效。 營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質的能力，必須在其培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成份才能正常生長的變異株。與其相對應的是野生型菌株。營養(yǎng)缺陷型在生產和研究上用途很廣，目前生產氨基酸和核苷酸的菌種大多是各種類型的營養(yǎng)缺陷型。要研究代謝途徑，要進行原生質體融合育種或其它重組育種技術，一般都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為研究材料。 本實驗擬以兩種不同性狀的酵母菌（雙倍體）為出發(fā)菌株，先獲得其單倍體細胞，再分別制備其原生質體。然后采用亞硝基胍進行化學誘變處理，由再生菌落中檢出營養(yǎng)缺陷型，再確定其生

51、長譜。所獲得的精確營養(yǎng)缺陷型可作為原生質體融合育種的親本菌株。,三、實驗材料,（一）出發(fā)菌株 1酵母菌A：耐高溫酒精酵母（雙倍體，能產生子囊孢子） 2酵母菌B：高糖面包酵母（雙倍體，能產生子囊孢子） （二）培養(yǎng)基 已在實驗八預先準備 （三）試劑 1. 緩沖液、生理鹽水及原生質體穩(wěn)定液已在實驗八預先準備 2. 1 mol/L巰基乙醇 3. 蝸牛酶：用高滲緩沖液配成50 mg/mL溶液 4. 1 mg/mL亞硝基胍(NTG)：用緩沖液B配成1 mg/mL溶液 （四）器具 顯微鏡、水浴鍋、培養(yǎng)箱、離心機、搖床、超凈臺、各種常用玻璃器皿,四、實驗內容,（一）酵母子囊孢子的獲得與觀察 1將酵母斜面種接入

52、麥汁錐瓶中，振蕩培養(yǎng)1824小時， 離心、洗滌、得菌體。 2將菌體大量涂布于醋酸鈉瓊脂斜面上置2528培養(yǎng)3 天以上，使產生子囊孢子。 3鏡檢觀察子囊孢子的形態(tài)和數目。,四、實驗內容,（二）單倍體酵母的分離制備 法一：用高滲緩沖液洗下醋酸鈉斜面上的菌體，加入1蝸牛酶作用4060分鐘。離心得菌體，加入少量硅藻土并用玻璃棒攪磨使子囊孢子分散。加入高滲液，攪勻靜置，取上清液涂布CM平板進行分離培養(yǎng)后選取最小菌落接入CM斜面保存，若在醋酸鈉斜面上不產孢者則為單倍體。 法二：該法是根據子囊孢子比營養(yǎng)細胞更耐熱的特性，用熱處理法分離單倍體菌株的。首先將酵母營養(yǎng)細胞懸液（約 10-6 個/ml )浸于55

53、60恒溫水浴中加熱（不斷振蕩），每隔2分鐘用接種環(huán)醛取菌液接種于平板上。（約需10分鐘）。然后將平板置30培養(yǎng)2天，以確定完全不生長或只有一兩個菌落生長的處理條件。按著，從生孢子斜面上取菌體進行同樣條件的處理，到時間后迅速冷卻，經適當稀釋后進行平板分離培養(yǎng)2天，挑取較小圓錐形菌落保存于斜面，再進行鏡檢純化鑒定。,四、實驗內容,（三）單倍體酵母原生質體的制備 1將單倍體酵母接入CM錐形瓶中，置30 振蕩培養(yǎng)20小時，吸取2 mL菌液接入30 mL新鮮的CM液中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6小時。 2上述菌液于3000轉分離心10分鐘，用無菌生理鹽水洗滌兩次，調整并制成約10-8個/mL的菌懸液。 3于無菌離心

54、管中加入： （1）菌懸液2 mL ； （2）1 mol/ L巰基乙醇0.1 mL； (3）緩沖液C0. 4 mL ； （4）混合鹽液1.6 mL ； （5）蝸牛酶1 mL （濃度1）。置30 水浴中處理約60分鐘，鏡檢。4以3000轉分離心5分鐘去酶，用高滲緩沖液B珠洗滌原生質體兩次，恢復原體積，振蕩分散制成原生質體懸浮液。用血球計數器于顯微鏡下直接觀察并計算原生質體形成率。,四、實驗內容,（四）用亞硝基胍（NTG）誘變處理酵母 原生質體 1吸取上述原生質體懸浮液lml，加入0.2 lml亞硝基胍溶 液（處理濃度為0.150.5mg/ml），于30振蕩處理 3060分鐘。 2用高滲緩沖液B稀釋

55、1000倍中止作用。 3用同樣緩沖液作適當稀釋后涂布在高滲再生培養(yǎng)基平板 上，于30培養(yǎng)數天，觀察再生菌落。,四、實驗內容,（五）營養(yǎng)缺陷型的檢出 1分別制備酵母MM和CM兩種平板，并打格編號。 2用無菌牙簽將上述長出的再生菌落逐一在MM和CM兩種 平板上依次在相應位置上點種，經培養(yǎng)后觀察并檢出營 養(yǎng)缺陷型。 3檢出的缺陷型經再次驗證、分離、直至獲得純種精確的 營養(yǎng)缺陷型。,四、實驗內容,（六）營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定。 1將缺陷型菌株接入CM液振蕩培養(yǎng)、離心、洗滌菌體，制備成細胞懸 浮液。 2取細胞懸液lml，與20m1 MM瓊脂培養(yǎng)基（融化并冷卻至50）混合 后傾注平皿，即為缺陷型平板。 3

56、將15種可能的營養(yǎng)成分，配制成5組不同的營養(yǎng)組合混合液，用濾紙 圈片吸飽后，分別放于上述缺陷型平板的5個區(qū)間上，培養(yǎng)后根據其 生長情況，查表確定其營養(yǎng)要求。 4將確定的營養(yǎng)因子以合適濃度加入MM培養(yǎng)基中制成補充培養(yǎng)基(SM) 同時接種缺陷型菌株于MM和SM上進行缺陷營養(yǎng)因子的確證試驗。 5將選育獲得的營養(yǎng)缺陷型移接于 CM斜面上，培養(yǎng)后注明其遺傳標 記，妥善保存?zhèn)溆谩?大型綜合實驗二,酵母菌原生質體 融合育種,一、目的要求,1掌握原生質體融合育種的基本理論和基本過程； 2掌握酵母原生質體的制備、融合和再生的操作方法； 3，學習融合子的選擇及實用性優(yōu)良菌株的篩選思路和方法； 4培養(yǎng)和訓練學生從事

57、微生物菌種選育的綜合技能，提高學 生從事科學實驗方案的設計與科學研究的素質。,二、基本原理,原生質體融合屬于體細胞之間的無性融合，即用酶法將細胞膜外側的細胞壁除掉，制備成無細胞壁的球狀細胞體原生質體。將兩種來源于微生物細胞A和B的原生質體，在融合誘導劑（或促進劑）聚乙二醇和Ca2+存在下等量混合起來，可使原生質體表面形成電極性，相互之間易于吸引、脫水粘合而形成聚集物，進而使原生質體收縮變形，緊密接觸處的膜先形成原生質橋，逐漸增大而實現融合。融合的原生質體在適當的培養(yǎng)條件下可再生出細胞壁而形成一個新細胞，這個細胞有可能具有A.B兩個原生質體原有的特性或更加優(yōu)良的新的特性。 原生質體融合育種是基因重組育種的一種重要方法，可分為下列幾個步驟： 1帶遺傳標記融合親株的選擇 2原生質體的制備 3原生質體的融合 4原生質體的再生 5融合子的選擇與實用性菌株的篩選,三、實驗材料,（一）菌株 1酵母菌A：耐高溫酒精酵母（單倍體、營養(yǎng)缺陷型）； 2酵母菌B：高糖面包酵母（單倍體、營養(yǎng)缺陷型）； 3酵母菌C：耐高溫酒精酵母（雙倍體、不帶標記、適于