工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)多媒體課件(十個(gè)實(shí)驗(yàn)).ppt

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)一,培養(yǎng)基的制備和滅菌,一、目的要求,學(xué)習(xí)和掌握各種培養(yǎng)基的制備方法，其中包括培養(yǎng)基的配制，包扎及滅菌技術(shù)。,二、基本原理,培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。其中含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖還必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才能表現(xiàn)它們最大生命力，因此不同種類的微生物應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)到一定pH值范圍。培養(yǎng)基種類很多，不同的微生物所需培養(yǎng)基不同。按其組成可分合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。按其物理狀態(tài)可分固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。按其特殊用途可分加富培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。,培養(yǎng)基配制后還必須進(jìn)行

2、滅菌。滅菌和消毒是二個(gè)不同含義的名詞。消毒是指消滅病原菌或有害微生物，而滅菌則是殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物。,消毒與滅菌的方法很多，但總的可分為物理法與化學(xué)法兩大類。物理法包括加熱滅菌（干熱滅菌與濕熱滅菌），過(guò)濾滅菌、紫外線滅菌等?；瘜W(xué)方法主要是利用有機(jī)或無(wú)機(jī)的化學(xué)藥品對(duì)實(shí)驗(yàn)室用具和其它物體表面進(jìn)行滅菌與消毒。,三、實(shí)驗(yàn)材料,每組同學(xué)需要準(zhǔn)備以下材料（2人/組）： 小試管：12支（15*150mm） 培養(yǎng)皿：12套（9cm） 吸管：3支（1ml） 三角玻扒：2支 燒杯：1套（50ml，100ml，250ml，500ml） 量筒：1個(gè)（100ml） 玻棒：1支 分液漏斗：1套 藥匙：2把

3、剪刀：1把 鐵絲：數(shù)支 標(biāo)簽貼紙：1張 鉛筆：1支 10ML玻璃吸管：1支,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（一）、培養(yǎng)基的配制： 同學(xué)們先將試管貼好標(biāo)簽。注明培養(yǎng)基名稱，組別，日期。標(biāo)簽粘貼位置在離管口1/3管身處。 注意：標(biāo)簽用鉛筆書寫，以防高溫滅菌時(shí)蒸汽模糊字跡。 操作圖示：,培養(yǎng)基配方：,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,肉湯培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉汁1g 自來(lái)水50ml PH7.2 麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁5g 自來(lái)水50ml 自然PH 固體培養(yǎng)基：由液體培養(yǎng)基加2瓊脂,1配制肉湯斜面培養(yǎng)基50 mL 將小燒杯置天平上，用藥匙取營(yíng)養(yǎng)肉湯干燥培養(yǎng)基，稱取1 g先加少量自來(lái)水，溶解徹底再轉(zhuǎn)移到量筒，定容至50ml，然后倒在250 mL燒杯

4、里，加入瓊脂1g（2%），浸泡于液體培養(yǎng)基里，液面位置做好標(biāo)記，在電爐上加熱融化后（注意補(bǔ)充蒸發(fā)的水分以保持原體積不變），用分液漏斗分裝6支小試管，每支5 mL左右（約試管高度的1/5左右）， 用硅膠塞塞好試管口，再用防潮紙和棉繩將試管塞罩住扎成一捆。 圖4-10 用漏斗分裝培養(yǎng)基及擺斜面 2配制麥芽汁斜面培養(yǎng)基（方法同上）,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,3注意事項(xiàng)： 本實(shí)驗(yàn)使用調(diào)配好的“干燥培養(yǎng)基”，這種培養(yǎng)基是將新鮮配制的液體培養(yǎng)基用噴霧干燥法，真空干燥法，低溫干燥法或蒸發(fā)干燥法等將培養(yǎng)基內(nèi)所含的水分去掉；或?qū)⑴囵B(yǎng)基內(nèi)的各種固形成分，經(jīng)適當(dāng)處理，充分混勻，便成干燥粉末而成。使用時(shí)只要按比例加入一定量的水，

5、經(jīng)溶解，無(wú)需調(diào)pH，分裝，高壓蒸汽滅菌，即可使用。 “干燥培養(yǎng)基”成品很容易吸潮，在稱量時(shí)動(dòng)作要迅速。另外，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再取另一種藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。 在燒杯融化瓊脂的過(guò)程中，人要在電爐旁看著，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出燒杯。同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。注意帶上棉紗手套防止?fàn)C傷。 分裝過(guò)程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（二）培養(yǎng)基滅菌 培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮紙，便可滅菌。滅菌的時(shí)間和溫度按各培養(yǎng)基規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，可放在

6、37恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，無(wú)菌者方可使用。 在實(shí)驗(yàn)室里用得最多的加熱滅菌法是高壓蒸汽滅菌和干熱滅菌。一般培養(yǎng)基和滅菌水等用高壓蒸汽滅菌，而玻璃器皿常用干熱滅菌。蒸汽滅菌為105-121，15-20分鐘，干熱滅菌為160-170，1-2小時(shí)。目的都是使細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。 在同一溫度下，濕熱殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固，同時(shí)濕熱穿透力強(qiáng)，而且當(dāng)蒸汽與被滅菌物體接觸凝成水分時(shí)，又可放出熱量，使溫度迅速增高，從而增加滅菌效力。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（三）包扎 1培養(yǎng)皿：以舊報(bào)紙密密包緊，一般以6套做一包，待滅菌。 2吸管：在距其粗頭頂端約0.5cm處

7、，塞一小段1.5cm長(zhǎng)的棉花。棉花要塞得松緊恰當(dāng)（過(guò)緊，吹吸液體太費(fèi)勁；過(guò)松，吹氣時(shí)棉花會(huì)下滑），然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報(bào)紙條的的近左端，與報(bào)紙約呈60角，并將右端多余的報(bào)紙打一小結(jié)。 3三角玻扒：跟包扎吸管相似，將三角部分斜放在報(bào)紙條的近左端，與報(bào)紙約呈45角，并將右端多余的報(bào)紙打一小結(jié)。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,思考題： 培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件? 在培養(yǎng)基配制操作過(guò)程中應(yīng)注意什么問(wèn)題?為什么? 培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng) 基是無(wú)菌的? 高壓蒸汽滅菌的關(guān)鍵為什么是高溫而不是高壓?高壓蒸汽滅菌 前為什么要將滅菌鍋內(nèi)的冷空氣排盡?滅菌完畢后什么情況下 才可以

8、開(kāi)鍋蓋取出滅菌物品? 玻璃器皿為什么在滅菌前要先行干燥? 對(duì)含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌時(shí)， 應(yīng)采用多大壓力，多長(zhǎng)時(shí)間滅菌為宜? 加熱蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌所要求的溫度低、時(shí)間短？ 干熱滅菌完畢后，在什么情況下才可開(kāi)箱取物？為什么？,實(shí)驗(yàn)二,微生物的接種,一、目的要求,訓(xùn)練微生物接種的基本技能 基本建立無(wú)菌操作的概念,二、基本原理,接種技術(shù)是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。接種是將純種微生物在無(wú)菌操作條件下移植到已滅菌并適宜該菌生長(zhǎng)繁殖所需要的培養(yǎng)基中。為了獲得微生物的純種培養(yǎng)（指一株菌種或一個(gè)培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞或孢子都是由一個(gè)細(xì)胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代），要

9、求接種過(guò)程中必須嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，一般是在無(wú)菌室內(nèi)，超凈工作臺(tái)火焰旁或?qū)嶒?yàn)室火焰旁進(jìn)行。,根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康募芭囵B(yǎng)方式可以采用不同的接種工具和接種方法。常用的工具有接種環(huán)、接種針、接種鏟、玻璃涂棒，移液管及滴管等。常用的方法有斜面接種，液體接種，穿刺接種和平板接種，這些方法在后面的實(shí)驗(yàn)一一進(jìn)行訓(xùn)練。,三、實(shí)驗(yàn)材料,1各組所需的物品 接種用具：接種環(huán)（針、鉤），酒精燈，鑷子，消毒棉球，打火機(jī)， 標(biāo)簽貼紙，廢物杯，一次性口罩，紙巾。 準(zhǔn)備移植的菌種：參考下列接種菌名（由老師提供） 斜面培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基（6支），麥芽汁培養(yǎng)基（6支） 為下次實(shí)驗(yàn)制備培養(yǎng)基的工具：參考實(shí)驗(yàn)一 2注意事項(xiàng)： 酒精不足的

10、酒精燈請(qǐng)自行添加！注意：添加量不得超過(guò)容量的2/3。 將所有空白斜面貼好標(biāo)簽，注明接入菌種的名稱，接種班別，接種組別， 接種日期。 接種前請(qǐng)將臺(tái)面用抹布清潔，擦干；雙手用洗手液清潔，擦干。 斜面接種，分清菌臺(tái)和培養(yǎng)基，挑取少量菌種，切勿劃破培養(yǎng)基。 接種時(shí)要關(guān)閉門窗，風(fēng)扇，人不要隨意走動(dòng)，端坐，平緩呼吸。 不同的菌種，不同的接種方式，使用不同的接種工具（針，鉤，環(huán)，吸管）。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,1微生物的斜面接種技術(shù)： 從已長(zhǎng)好微生物的菌種管中挑取少許菌苔接種至空白斜面培養(yǎng)基上的過(guò)程。 斜面接種的操作方法： （1）操作前，先用75%酒精擦手，作表面消毒，待酒精揮發(fā)后才能點(diǎn)燃 酒精燈。（可通常是點(diǎn)燃酒

11、精燈再用酒精擦手。） （2）用斜面接種時(shí)，將菌種管和斜面管握在左手的大拇指和其他四指之 間，使斜面和有菌種的一面向上，并處在水平位置。 （3）先將菌種管和斜面管的試管塞旋轉(zhuǎn)一下，以便接種時(shí)便于拔出。 （4）右手拿接種環(huán)，拿的方式與普通日常拿筆一樣。將要伸入試管部分 的金屬柄和金屬絲在酒精燈火焰上灼燒滅菌。 （5）用右手小指、無(wú)名指或手掌將菌種管和斜面管的試管塞同時(shí)拔出， 并把塞子握住，不得任意放在桌上或與其他物品接觸，再以火焰燒 管口。 轉(zhuǎn)下頁(yè),（6）將上述在火焰上滅菌過(guò)的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，使接 種環(huán)在接種菌種前先在試管內(nèi)壁上或空白培養(yǎng)基接觸 一下，使接種環(huán)充分冷卻，以免燙死菌種然后用接種

12、環(huán)在菌落上輕輕地接觸，刮取少許后將接種環(huán)自菌種 管內(nèi)抽出。抽出時(shí)勿與管壁相碰，也勿使再通過(guò)火焰。 （7）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入斜面培管中，在斜面上， 自下而上劃線，使菌種沾附在培養(yǎng)基上，劃線時(shí)勿用 力，否則會(huì)使培養(yǎng)基表面劃破。 （8）接種完畢后將接種環(huán)抽出，灼燒管口，塞上試管塞。塞 試管塞時(shí)勿要用試管口去迎試管塞，以免試管在移動(dòng)時(shí) 侵入雜菌。 （9）接種環(huán)在放回原位前，要經(jīng)火焰灼燒滅菌。同時(shí)須將試 管塞進(jìn)一步塞緊以免脫落。,接種菌名及接種劃線方式、接種工具： 細(xì)菌：枯草桿菌，大腸桿菌，單球菌，谷氨酸菌，假單孢桿 菌，巨大芽孢桿菌（6支） （接種方式：“之”字劃線，接種工具：接種環(huán)） 霉菌：

13、黑曲霉，黃曲霉，根霉（3支） （接種方式：點(diǎn)植或劃直線，接種工具：接種鉤或接種環(huán)） 酵母菌：面包酵母菌，古巴酵母菌，假絲酵母菌（3支） （接種方式：劃直線，接種工具：接種環(huán)）,圖4 11 各種無(wú)菌操作接種技術(shù)示意圖,圖4 11 各種無(wú)菌操作接種技術(shù)示意圖,圖2-1 各種無(wú)菌操作接種技術(shù)示意圖,圖2-2 穿刺接種操作過(guò)程示意圖,將接種好的斜面試管置最適合該菌種生長(zhǎng)的恒溫培養(yǎng)箱里。 一般細(xì)菌于37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2d 一般霉菌和酵母菌于32恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3d,2生物的培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)法,3. 為下次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備平板培養(yǎng)基： 各組同學(xué)先三角瓶貼好標(biāo)簽。注明培養(yǎng)基名稱，組別，日期。標(biāo)簽粘貼位

14、置在離瓶口1/3瓶身處。注意：標(biāo)簽用鉛筆書寫，以防高溫滅菌時(shí)蒸汽模糊字跡。 培養(yǎng)基配方：肉湯培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉汁2g 自來(lái)水100 mL PH7.2 麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁10g 自來(lái)水100 mL 自然PH 固體培養(yǎng)基：由液體培養(yǎng)基加2瓊脂 (1)配制肉湯平板培養(yǎng)基100 mL 將小燒杯置天平上，用藥匙取營(yíng)養(yǎng)肉湯干燥培養(yǎng)基，稱取2 g加少量自來(lái)水，溶解徹底轉(zhuǎn)移到量筒，定容至100 mL，再裝入250 mL三角瓶，加入瓊脂2 g，浸泡于液體培養(yǎng)基里，用棉塞塞好瓶口，再用防潮紙和棉繩將棉塞罩住扎好。 (2)配制麥芽汁平板培養(yǎng)基（方法同上） 配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌！,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,1觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果:微

15、生物瓊脂斜面上的生長(zhǎng)狀況。 2思考題: 接種環(huán)(針)接種前后灼燒的目的是什么?為什么在接種前一定要將其冷卻？如何判斷灼燒過(guò)的接種環(huán)已冷卻? 培養(yǎng)不同種類微生物能否用同一種培養(yǎng)基?為什么?細(xì)菌、酵母菌、霉菌通常用什么培養(yǎng)基培養(yǎng)？,實(shí)驗(yàn)三,微生物的分離純化技術(shù),一、目的要求,學(xué)習(xí)從混雜的微生物群體中分離與純化微生物 菌種的方法。 綜合練習(xí)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的各種無(wú)菌操作技術(shù),二、基本原理,自然界中各種微生物混雜生活在一起，即使取很少量的樣品也是許多微生物共存的群體。人們要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。 微生物的分離、純化技術(shù)是指從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的

16、過(guò)程。微生物的平板分離純化技術(shù)自1880年被發(fā)明以來(lái)以有100多年的歷史，該技術(shù)的建立和發(fā)展為人類獲得豐富的微生物資源以及在工、農(nóng)、醫(yī)、環(huán)境、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等方面的應(yīng)用作出了巨大的貢獻(xiàn)。平板稀釋涂布、平板稀釋混合、平板劃線法是分離和純化微生物的常規(guī)方法。 分離純化技術(shù)其實(shí)是進(jìn)行平板接種，即用接種環(huán)將菌種接至平板培養(yǎng)基上，或用移液管、滴管將一定體積的菌液移至平板培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)。平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)，分離純化菌種，活菌計(jì)數(shù)及在平板上進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)時(shí)采用的一種接種方法。 本實(shí)驗(yàn)是利用分離純化技術(shù)來(lái)獲得三大類微生物的平板純培養(yǎng)物，為下次實(shí)驗(yàn)微生物的形態(tài)觀察提供菌落形態(tài)的部分（形態(tài)觀察主要包括群

17、體形態(tài)（菌落形態(tài)）和個(gè)體形態(tài)觀察兩個(gè)方面。,三、實(shí)驗(yàn)材料,1、各組所需物品： 無(wú)菌培養(yǎng)皿：兩包，12套 無(wú)菌三角玻扒：1支 無(wú)菌吸管：3支 接種器具：酒精燈，鑷子，消毒棉球，打火機(jī)，標(biāo)簽貼紙，圓珠筆， 一次性口罩，紙巾。 制平板的培養(yǎng)基：肉湯瓊脂培養(yǎng)基（1瓶）, 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（1 瓶） (于殺菌鍋里保溫) 2、平板的制備： 將融化的瓊脂培養(yǎng)基,冷卻至50左右(以手背能忍受的溫度為準(zhǔn))溫度過(guò)高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于45時(shí)，培養(yǎng)基易于凝固而無(wú)法制作平板。 平板的制作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行，右手掌心握住三角瓶的底部，左手打開(kāi)三角瓶棉塞，以右手的無(wú)名指和末指夾持瓶塞，灼燒瓶口。左手拿培養(yǎng)皿

18、，用左手的大拇子將皿蓋掀開(kāi)一縫，至瓶口剛好伸入，向皿內(nèi)注入培養(yǎng)基（約15 mL,厚度約0.5 mL左右），迅速蓋好皿蓋。 左手持培養(yǎng)皿稍加旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即為平板。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,1. 平板混合分離法：大腸桿菌，枯草桿菌，單球菌（3皿） 將菌液分離樣品搖勻，用無(wú)菌移液管取1 ml的菌液移至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，然后將融化，涼至50左右的培養(yǎng)基，在每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)各倒入約15 ml，搖勻，凝固，制成平板。 圖3-1 混合倒平板操作法示意圖,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,2. 平板劃線分離法：（3皿） 將菌液分離樣品搖勻，以無(wú)菌操作用接種環(huán)直接取試管中待分離純化的菌液

19、，將菌液點(diǎn)種在平板邊緣一處，取出接種環(huán)，燒去多余的菌種。將接種環(huán)再次通過(guò)稍打開(kāi)皿蓋的縫隙（約30）伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻,然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線，劃線時(shí)平板面與接種環(huán)面成30-40，以手腕力量在平板表面輕巧滑動(dòng)劃線,接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基,線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊，劃線完畢，關(guān)上皿蓋.灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置接種架上。,圖3-2 平板劃線分離操作法示意圖,圖3-3 平板劃線菌落分離效果圖,3. 平板涂布分離法(3皿)：面包酵母菌，古巴酵母菌，假絲酵母菌 將菌液分離樣品搖勻，將0.1ml菌懸液小心地滴在平板

20、培養(yǎng)基表面中央位置。右手拿無(wú)菌三角玻扒在平板培養(yǎng)基表面上,將菌懸液先沿一條直線輕輕地來(lái)回推動(dòng),使之分布均勻，然后改變方向沿另一垂直來(lái)回推動(dòng),平板內(nèi)邊緣處可改變方向用三角玻扒再涂布幾次。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,圖3-4 涂布平板操作法示意圖,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,4. 平板點(diǎn)殖：黑曲霉，黃曲霉，根霉 （3皿） 一般用于觀察霉菌的菌落。在無(wú)菌操作下， 用接種針從斜面或孢子懸液中取少許孢子，輕輕 點(diǎn)種于平板上。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,5. 生物的培養(yǎng)技術(shù)：培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)法 細(xì)菌于37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2d，平板倒置培養(yǎng)。 霉菌和酵母菌于32恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3d，平板 倒置培養(yǎng)。,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,1、觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果：微生物

21、的菌落特征 注:菌落特征描寫方法參考如下： 大?。捍?，中,小,針尖狀 形態(tài)：圓形，不規(guī)則等 干濕情況：干燥，濕潤(rùn)，粘稠 高度：扁平，隆起，凹下 透明度：透明度，半透明，不透明 顏色：黃色，金黃色，灰色，乳白色，紅色，粉紅色，黑色等 邊緣：整齊，不整齊,2、思考題: 如何確定平板上某單個(gè)菌落是否為純培養(yǎng)？請(qǐng)寫出實(shí)驗(yàn)的主要步驟. 你所做的涂布平板法和劃線法是否較好地得到了單菌落?如果不是,請(qǐng)分析其原因。 在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)微生物時(shí)為何培養(yǎng)皿需倒置?,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,實(shí)驗(yàn)四,微生物的制片技術(shù)及基本形態(tài)的觀察,一、目的要求,識(shí)別各種細(xì)菌、酵母菌及霉菌的菌落特征 2. 學(xué)會(huì)細(xì)菌、酵母菌及霉菌的一般制片方法

22、 3. 觀察并掌握細(xì)菌、酵母菌及霉菌的個(gè)體形態(tài)及生長(zhǎng)繁殖方式 4. 熟練掌握顯微鏡低倍、高倍物鏡及油鏡的使用技術(shù),二、基本原理,微生物的形態(tài)觀察包括個(gè)體形態(tài)觀察和群體形態(tài)觀察（菌落特征觀察）。 微生物的個(gè)體形態(tài)都很小，必須借助顯微鏡，如相差顯微鏡，電子顯微鏡，光學(xué)顯微鏡才能看清。一般實(shí)驗(yàn)室常用普通光學(xué)顯微鏡。 細(xì)菌細(xì)胞小而透明，如果菌體和背景沒(méi)有較大的明暗度差別，是很難看清它們的形態(tài)的，更不易于識(shí)別其結(jié)構(gòu)，所以，觀察細(xì)菌時(shí)，往往要將細(xì)菌進(jìn)行染色，借助顏色的反襯作用，可以更清楚地觀察到細(xì)菌的形狀及某些細(xì)胞結(jié)構(gòu)。因此，微生物的染色及形態(tài)結(jié)果的觀察是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中十分重要的基本技術(shù)。微生物細(xì)胞染色的

23、的基本原理是根據(jù)物理因素和化學(xué)因素的作用。物理因素包括細(xì)胞及細(xì)胞質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附、吸收作用等?；瘜W(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。一般酸性成分對(duì)堿性染料較易吸附，而且較穩(wěn)定。同樣，堿性成分對(duì)酸性染料也較易吸附，而且也較穩(wěn)定。 轉(zhuǎn)下頁(yè),二、基本原理,酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物，大多數(shù)以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)美藍(lán)染液水浸片來(lái)觀察酵母的形態(tài)。美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無(wú)色。用美藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變成為無(wú)色的還原型。因此，具有還原能力的酵母活細(xì)胞是

24、無(wú)色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，借此即可對(duì)酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。 霉菌的菌絲體及孢子的形態(tài)特征是識(shí)別不同種類霉菌的重要依據(jù)。觀察霉菌的形態(tài)有多種方法，本實(shí)驗(yàn)讓同學(xué)練習(xí)直接制片觀察法，再介紹載片培養(yǎng)觀察法。直接制片法是將培養(yǎng)物置于乳酸石炭酸液中，制成霉菌制片鏡檢。制成的霉菌制片的特點(diǎn)是：細(xì)胞不變形；具有防腐作用，不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間；能防止孢子飛散。載片培養(yǎng)方法是用無(wú)菌操作將培養(yǎng)基瓊脂薄層置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng)，霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內(nèi)沿蓋玻片橫向生長(zhǎng)。,三、實(shí)驗(yàn)材料,1. 菌種：細(xì)菌，酵母菌，霉菌各3種，由上次實(shí)驗(yàn)提供（同學(xué)們自

25、制的12皿平板） 2. 每組制片用具：接種工具1套，載玻片9片，蓋玻片6片，玻片架3個(gè)，吸水紙（或紙巾），一次性口罩，一次性手套，保鮮袋，吹風(fēng)筒，顯微鏡 3. 染色劑1套：革蘭氏A、B液，沙黃，乙醇，無(wú)菌水，乳酸石炭酸，二甲苯，美藍(lán)，沖洗蒸餾水1瓶,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,觀察上次實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄：細(xì)菌、酵母菌、 霉菌的菌落特征。 顯微鏡的構(gòu)造、性能和使用方法。,圖4-1 普通光學(xué)顯微鏡,圖4-2 普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造,圖4-3 研究型(相差、熒光)顯微鏡,圖4-4 相差顯微鏡的成像原理,圖4-5 顯微鏡的光路,圖4-6 大腸桿菌,圖4-7 黑霉,圖4-8 正在分裂的細(xì)菌,圖4-9 孢子與酵母,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

26、,細(xì)菌、酵母菌、霉菌的制片技術(shù)及 個(gè)體形態(tài)觀察： （戴上一次性口罩） 革蘭氏染色法（各1片）：枯草桿菌，大腸桿菌 和單球菌 美藍(lán)染色（各1片）：面包酵母菌，古巴酵母菌 和假絲酵母菌 乳酸石炭酸浸片（各1片）：根霉，黃曲霉和 黑曲霉,A. 加小滴水,B. 涂成薄層,C. 固定菌體,圖4-10 涂片制備過(guò)程,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,革蘭氏染色注意載玻片要潔凈，滴無(wú)菌水和取菌不宜過(guò)多，涂片要均勻，不宜過(guò)厚；熱固定溫度不宜過(guò)高，（以玻片背面不燙手為宜），否則會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)；水洗時(shí)不要直接沖洗涂面，而應(yīng)使水從載玻片的一端流下，水流不宜過(guò)急，過(guò)大，以免涂片薄層脫落。 革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏

27、染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽(yáng)性菌，脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌。 美藍(lán)染色注意染液不宜過(guò)多或過(guò)少，否則在蓋上蓋玻片的時(shí),菌液會(huì)溢出或出現(xiàn)大量氣泡而影響觀察；同樣，蓋玻片的不宜平著放下，以免產(chǎn)生氣泡影響觀察。 霉菌直接制片注意挑菌和制片時(shí)要小心，盡可能保持霉菌的自然生長(zhǎng)狀態(tài)，加蓋玻片時(shí)勿壓入氣泡，以免影響觀察。,4 注意事項(xiàng)：,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,1繪圖說(shuō)明你所觀察到的細(xì)菌，酵母菌，霉菌的個(gè)體形態(tài)特征（共9個(gè)） 繪圖示例： 枯草桿菌G+ 放大倍數(shù)：10100,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,2思考題： 你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？ 現(xiàn)有一株細(xì)菌寬度明顯大于大腸

28、桿菌的粗壯桿菌，請(qǐng)你鑒定其革蘭氏染色反應(yīng)。你怎樣運(yùn)用大腸桿菌為對(duì)照菌株進(jìn)行涂片染色，以證明你的染色結(jié)果正確性。 你的染色結(jié)果是否正確？如果不正確，請(qǐng)說(shuō)明原因。 進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，為什么特別強(qiáng)調(diào)菌齡不能太老，用老齡細(xì)菌染色出現(xiàn)什么問(wèn)題？ 革蘭氏染色時(shí)，初染前能加碘液?jiǎn)?乙醇脫色后復(fù)染之前，革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色?你認(rèn)為革蘭氏染色中，哪一個(gè)步驟可以省去而不影響最終結(jié)果？在什么情況下可以采用？,實(shí)驗(yàn)五,微生物生長(zhǎng)，數(shù)量及大小的檢測(cè),一、目的要求,學(xué)會(huì)用血球計(jì)數(shù)器測(cè)定酵母菌細(xì)胞數(shù) 學(xué)習(xí)和掌握用測(cè)微尺測(cè)量微生物細(xì)胞大小的方法,二、基本原理,微生物個(gè)體生長(zhǎng)的時(shí)間較短，很快進(jìn)入分裂繁殖階

29、段，個(gè)體生長(zhǎng)難以測(cè)定。它們的生長(zhǎng)一般以繁殖即群體生長(zhǎng)作為微生物生長(zhǎng)的指標(biāo)。群體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板計(jì)數(shù)法、光電比濁法等。 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。 微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測(cè)定，需要在顯微鏡下，借助于特殊的測(cè)量工具即測(cè)微尺，包括目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。,三、實(shí)驗(yàn)材料,酵母菌液 顯微鏡、血球計(jì)數(shù)器、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺 3. 載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、膠頭吸管等,圖5-1 Tho

30、ma血球計(jì)數(shù)板 A.正面圖 B.縱切面圖 1.血球計(jì)數(shù)板 2.蓋玻片 3.計(jì)數(shù)室,16小格 25大格計(jì)數(shù)室,25小格 16大格計(jì)數(shù)室,圖5-2 計(jì)數(shù)室的兩種刻度形式,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,一.酵母菌數(shù)量的檢測(cè) 1. 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（每人1片） 注意事項(xiàng): 取樣時(shí)先要搖勻菌液;加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣 泡產(chǎn)生。 B. 調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)。 2. 平板菌落計(jì)數(shù)法 (實(shí)驗(yàn)八),四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,二.酵母菌大小的檢測(cè) 注意事項(xiàng)：觀察時(shí)光線不宜過(guò)強(qiáng),否則難以找到鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度;換高倍鏡和油鏡校正時(shí),務(wù)必十分小心,防止接物鏡壓壞鏡臺(tái)測(cè)微尺和損壞鏡頭。 1.測(cè)微尺的校正（標(biāo)定）： 兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)10 目

31、鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度(m)= 兩重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù) 2酵母菌大小的測(cè)定： 利用制好的血球器浸片，用高倍鏡測(cè)出寬和長(zhǎng)各占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，再將測(cè)到的格數(shù)乘以目鏡測(cè)微尺（用高倍鏡時(shí)標(biāo)定的）每格所代表的長(zhǎng)度，即為酵母菌的實(shí)際大小。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,三.準(zhǔn)備下次實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基和玻璃器皿 淀粉平板培養(yǎng)：6瓶，100ml/瓶（肉湯培養(yǎng)基+可溶性淀粉） 明膠液化培養(yǎng)基：30支，5ml/支（肉湯培養(yǎng)基+明膠12%-18%） 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基(加杜氏小管)：30支，5ml/支 蛋白胨水：30支，5ml/支 培養(yǎng)皿：36皿，包成6包，6皿/包,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,1、結(jié)果記錄： (1)將計(jì)數(shù)結(jié)果記錄下表。A表示五個(gè)中方格中的

32、總菌數(shù)。B稀釋倍數(shù)為102。,注:1 mL菌液總數(shù)=A/525104B=5107A,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,（2）將目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果填入下表: 接目鏡放大倍數(shù)：-10-,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,(3)將酵母菌大小測(cè)定結(jié)果填入下表：,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,2.思考題： 根據(jù)你的體會(huì)，說(shuō)明用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方 面？應(yīng)如何盡量減少誤差，力求準(zhǔn)確？ 某單位要求知道一種干酵母粉的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)1-2種可行 的檢測(cè)方法。 比較平板菌落計(jì)算法和顯微鏡下直接計(jì)算法的優(yōu)缺點(diǎn)幾應(yīng)用。 在不改變目鏡和目鏡測(cè)微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來(lái)測(cè) 定同一細(xì)菌的大小時(shí)，其測(cè)定結(jié)果是否相同？為什么？ 為什么更換不同放大倍率目鏡和物

33、鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重 新對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行校正？,實(shí)驗(yàn)六,微生物的生理生化反應(yīng),一、目的要求,了解不同細(xì)菌對(duì)含氮及含碳化合物的分解和 利用情況 進(jìn)一步掌握微生物的接種方法,二、基本原理,微生物代謝與其他生物代謝有著許多相似之處，也有不同之處。微生物代謝重要特征之一，就是代謝類型的多樣性，因此使得微生物在自然界的物質(zhì)循環(huán)中起著重要的作用，同時(shí)也為人類開(kāi)發(fā)利用微生物資源提供更多的機(jī)會(huì)與途徑。人們?cè)谖⑸锏姆诸愯b定工作中，常利用其生理生化反應(yīng)作用作為重要依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)分別安排微生物對(duì)生物大分子的分解利用（淀粉水解實(shí)驗(yàn)水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)），對(duì)含碳化合物的分解利用（糖發(fā)酵試驗(yàn)）以及對(duì)含氮化化合物的

34、分解利用（吲哚試驗(yàn)），讓同學(xué)們對(duì)微生物的代謝類型多樣性有一個(gè)初步和感性的了解，同時(shí)學(xué)習(xí)利用微生物形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及生化反應(yīng)的特征對(duì)某些細(xì)菌進(jìn)行初步的分類。 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步學(xué)習(xí)平板接種法、穿刺接種法、液體接種法。,三、實(shí)驗(yàn)材料,1培養(yǎng)基： 淀粉水解培養(yǎng)基：2皿 明膠液化培養(yǎng)基：2支 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基：4支 蛋白胨水培養(yǎng)基：2支 2. 接種用具：接種環(huán)（針、鉤），酒精燈，鑷子，消毒棉球，打火機(jī)，標(biāo)簽貼紙，廢物杯，一次性口罩，紙巾，油性筆。 3. 實(shí)驗(yàn)菌種：枯草桿菌、大腸桿菌、單球菌 4. 配置培養(yǎng)基的工具：1套,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,圖6-1 糖類發(fā)酵試驗(yàn),四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,操作步驟： 1. 淀粉水解試驗(yàn)：（2皿）

35、（1）翻轉(zhuǎn)平板使底皿背面向上，用油性筆在其背面玻璃上畫上三 個(gè)圓圈。 （2）用接種環(huán)在圓圈中間以點(diǎn)植的方式接上菌種。一皿接枯草桿 菌，另一皿接大腸桿菌。 （3）將接完種的平板倒置于37恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。 （4）觀察結(jié)果時(shí)，可打開(kāi)皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕 旋轉(zhuǎn)，是碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無(wú)色透明 圈，則說(shuō)明淀粉已被水解，為陽(yáng)性。透明圈的大小，說(shuō)明該 菌水解淀粉能力的強(qiáng)弱，即產(chǎn)生胞外酶活力的高低。（以 “+”、“”表示有無(wú)透明圈）,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（1）以穿刺接種法分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于明膠培 養(yǎng)基中。 （2）接種后置于20恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2-5d。 （3）觀察結(jié)果

36、時(shí)，注意培養(yǎng)基有無(wú)液化現(xiàn)象。（以“+”、 “”表示有無(wú)液化現(xiàn)象） 注意： 如果細(xì)菌在20時(shí)不能生長(zhǎng)，則必須培養(yǎng)在所需的最適溫度下，觀察結(jié)果時(shí)需將試管從恒溫箱里取出，置于冰浴中，才能觀察液化程度。,2. 明膠液化試驗(yàn)：（2支）,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于 同種糖類培養(yǎng)基中，以作比較。 （2）接種后置于37恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。 （3）觀察結(jié)果時(shí)，看各管顏色變化及杜氏小管有無(wú)氣 泡。產(chǎn)酸產(chǎn)氣用“”表示；只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣用“+”表 示；不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣用“”表示。,3. 糖類發(fā)酵試驗(yàn)：（4支）,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于蛋 白胨

37、水培養(yǎng)基中。 （2）接種后置于37恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。 （3）觀察結(jié)果時(shí)，在培養(yǎng)液中加入乙醚約1毫升（使呈明顯 的乙醚層）。充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片 刻，待乙醚浮于培養(yǎng)液上面時(shí)，沿管壁慢慢加入吲哚 試劑10滴。如吲哚存在，則乙醚層呈玫瑰紅色 （注意：加入吲哚試劑后，不可再搖動(dòng)，否則紅色不明 顯）。以“+”、“”表示有無(wú)紅色的玫瑰吲哚。,4. 吲哚試驗(yàn)：（2支）,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,肉湯培養(yǎng)基：100 mL，裝在250 mL三角瓶（加入1.5%瓊脂） 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：100 mL分裝10支大試管(加杜氏發(fā)酵 管)，10 mL /支 生理鹽水：250 mL,其中225 mL裝在500

38、mL三角瓶(加適量玻 珠)；18 mL分裝2支大試管，9 mL /支，剩余的丟棄 吸管：2支10 mL，5支1 mL 培養(yǎng)皿：6皿,準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)七的培養(yǎng)基和玻璃器皿：,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,1. 細(xì)菌對(duì)各種生理生化試驗(yàn)反應(yīng)的原理：,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,2細(xì)菌對(duì)各種生理生化試驗(yàn)反應(yīng)的結(jié)果：,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,（1）淀粉、明膠等生物大分子物質(zhì)能否不經(jīng)分解而直接被細(xì)菌吸 收？為什么？ （2）接種后的明膠試管可以置于37恒溫培養(yǎng)箱箱中培養(yǎng)，在培 養(yǎng)后你必須做什么才能證明水解的存在？ （3）假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗(yàn)應(yīng)該出現(xiàn)什 么結(jié)果？ （4）解釋在細(xì)菌培養(yǎng)中吲哚試驗(yàn)的化學(xué)原理，為什么在這個(gè)試驗(yàn) 中用吲哚的存

39、在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？,2. 思考題,實(shí)驗(yàn)七,水和食品中微生物的檢測(cè),一、目的要求,了解食品衛(wèi)生微生物學(xué)的重要性及其原理 學(xué)會(huì)水和食品中細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定方法和平板活菌計(jì)數(shù)法 3. 學(xué)會(huì)水和食品中大腸菌群數(shù)的測(cè)定方法,二、基本原理,水和食品中的微生物數(shù)量主要考慮到的是細(xì)菌特別是病原菌的數(shù)量。這些細(xì)菌主要來(lái)源于土壤、垃圾、糞便等，尤其是后者。若飲用水、釀造水和食品中發(fā)現(xiàn)有大腸群細(xì)菌，就有可能存在腸道病原菌，可能會(huì)危害人們的健康，因此，進(jìn)行食品衛(wèi)生的微生物學(xué)檢驗(yàn)是十分重要的。 一般情況下，主要是測(cè)定水和食品中細(xì)菌菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。細(xì)菌菌落總數(shù)是指水中或食品檢樣經(jīng)處理后，在一

40、定條件培養(yǎng)后，所得1 g或1 mL檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，其主要作為判定水和食品被污染程度的標(biāo)志。大腸菌群是腸道最普遍存在和數(shù)量最多的一群細(xì)菌、常將其作為人畜糞便污染的標(biāo)志。水和食品中大腸菌群數(shù)是以每100 mL（g）檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示的。,三、實(shí)驗(yàn)材料,水樣的采?。?池水，河水或湖水應(yīng)距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去玻璃塞，水即流入瓶中,盛滿后,將瓶塞蓋好,再?gòu)乃腥〕?最好立即檢查,否則需放入冰箱保存,時(shí)間不要超過(guò)六小時(shí)。 2. 其他實(shí)驗(yàn)材料參考實(shí)驗(yàn)講義P47,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（一）、食品中細(xì)菌菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)

41、的檢測(cè) 食品中細(xì)菌總數(shù)：用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定（即菌種分離純化技術(shù)的平板混合法） 平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞,取一定量的稀釋液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品的一個(gè)單細(xì)胞.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以,長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可能來(lái)自樣品中2-3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果,現(xiàn)在已傾向使用菌落形成的單位(colony-forming units,cfu)而不以絕對(duì)菌

42、落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,2食品中大腸菌群數(shù): 用多管發(fā)酵法測(cè)定.包括初(步)發(fā)酵試驗(yàn),平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)三個(gè)部分(略) 發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基,并倒置一杜氏發(fā)酵小管.乳糖能起選擇作用,因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖,而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣.為便于觀察細(xì)菌產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為PH指示劑,細(xì)菌產(chǎn)酸后,培養(yǎng)基即由原來(lái)的紫色變?yōu)辄S色.溴甲酚紫還有抑制其他細(xì)菌如芽孢菌生長(zhǎng)的作用。,圖7-1 食品檢樣稀釋及傾注平板示意圖,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,操作圖示：,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（二）、準(zhǔn)備下次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基（P30-31） (1)肉湯瓊脂培養(yǎng)基：100 mL，裝在250 mL三角

43、瓶(加2%瓊脂) (2)肉湯上層培養(yǎng)基：50 mL，分裝8小試管，每支5 mL（1/4試管） （加0.8%瓊脂） (3)蛋白胨水：30 mL分裝5支小試管,每支4.5 mL (4)吸管：1 mL6支 (5)培養(yǎng)皿：12皿，包成兩包，6個(gè)/包 （三）、觀察上次實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,1食品微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告(格式)： 微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告 送檢單位:有限公司 送檢樣品: 檢測(cè)項(xiàng)目:細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù) 檢測(cè)方法: (1)食品中細(xì)菌總數(shù): 用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定.(根據(jù)國(guó)標(biāo)GB47892-94) (2)食品中大腸菌群數(shù): 用多管發(fā)酵法測(cè)定.(根據(jù)國(guó)標(biāo)GB47893-94) 檢測(cè)結(jié)果: (1

44、)食品中細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果: (2)食品中大腸菌群數(shù)檢測(cè)結(jié)果:陽(yáng)性結(jié)果記“+”;陰性結(jié)果記“_”。一支管一個(gè)記號(hào)。 結(jié)論: 檢測(cè)單位:華工生物工程級(jí) 檢測(cè)人(報(bào)告人): 日期:200-,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,2.思考題 為什么融化后培養(yǎng)基要冷卻至50左右才能倒平板？ 要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵？為什么？ 試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用。 當(dāng)你的平板上長(zhǎng)出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時(shí)， 你認(rèn)為問(wèn)題在哪里？ 用傾注平板法和涂布平板法計(jì)數(shù)，其平板上長(zhǎng)出的菌落有何不 同？為什么要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間（48小時(shí)）后觀察結(jié)果？ 大腸菌群的定義是什么？ 大腸菌群中的細(xì)菌種類，一般并

45、非是病原菌，為什么要選用大 腸菌群作為食品被污染的指標(biāo)？,實(shí)驗(yàn)八,噬菌體效價(jià)的測(cè)定,一、目的要求,學(xué)會(huì)噬菌體的檢查及其效價(jià)測(cè)定方法 學(xué)會(huì)觀察識(shí)別噬菌斑,二、基本原理,噬菌體的效價(jià)就是1 mL培養(yǎng)液中所含活噬菌體的數(shù)量。效加測(cè)定的方法，一般應(yīng)用雙層瓊脂平板法。由于在含有特異宿主細(xì)菌的瓊脂平板上，噬菌體長(zhǎng)生肉眼可見(jiàn)的噬菌斑。因此，能進(jìn)行噬菌體的計(jì)數(shù)。但因噬菌斑計(jì)數(shù)方法其實(shí)效率難以接近100%（一般偏低，因?yàn)橛猩贁?shù)活噬菌體可能未引起感染），所以為了準(zhǔn)確地表達(dá)病毒菌懸液的濃度（效價(jià)）一般不用病毒粒子的絕對(duì)數(shù)量而是用噬菌斑形成單位（plague-forming units，簡(jiǎn)寫成pfu）,三、實(shí)驗(yàn)材料,

46、菌種 （1）噬菌體待檢液的制備：參照實(shí)驗(yàn)講義P35 （2）指示菌液的制備：參照實(shí)驗(yàn)講義P35 培養(yǎng)基及玻璃器皿 已在實(shí)驗(yàn)七預(yù)先準(zhǔn)備 其它器材 水浴鍋、電爐、酒精燈、接種環(huán)等,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,圖8-1 平板點(diǎn)滴法噬檢操作過(guò)程,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,圖8-2 單層瓊脂法噬檢操作過(guò)程,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,圖8-3 雙層瓊脂法測(cè)定噬菌體效價(jià)操作過(guò)程,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,1、噬菌體的效價(jià) 雙層法： (每組做3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2皿；另加對(duì)照1皿， 共7皿) 注意事項(xiàng)： 噬菌體對(duì)溫度極其敏感，一般噬菌體60下5分鐘絕大部分失活.因此加入上層培養(yǎng)基的溫度要嚴(yán)格保持50以下，為防止瓊脂凝固,此步操作要快,均勻鋪滿，不能出氣泡。

47、 為保證獲得單一，彼此分離的噬菌斑，培養(yǎng)皿蓋上和培養(yǎng)基表面不得有凝結(jié)水滴。正置培養(yǎng)，不能倒置。每皿噬菌體數(shù)量不能太多，維持100-300個(gè)為宜,否則噬菌斑不能分開(kāi)而連成一片。 同組同學(xué)分工合作協(xié)調(diào)好，一位稀釋噬菌體同時(shí)移噬菌體液以及移指示菌液；一位倒制底層平板同時(shí)拿上層試管接好移液。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,噬菌體效價(jià)測(cè)定操作圖示:,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,2、準(zhǔn)備下次實(shí)驗(yàn)配培養(yǎng)基和玻璃器皿(每實(shí)驗(yàn)臺(tái)) 1）完全培養(yǎng)基 2）再生培養(yǎng)基 3）生理鹽水 4）緩沖液 A.0.1mol/L,PH6.0磷酸緩沖液. B.高滲緩沖液,于上述緩沖液中加入0.8mol/L甘露醇 5）原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM) 5mol/L蔗糖,2

48、0mol/LMgCl20.02mol/L順丁烯二酸,調(diào)PH6.5 6）促融合劑 40%聚乙二醇(PEG-4000)SMM溶液 7）玻璃器皿包扎： A培養(yǎng)皿：18皿，6皿/包，包成3包 B小試管：20支 C吸嘴：1盒（約60個(gè)） 3、觀察上次實(shí)驗(yàn)結(jié)果,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,1、記錄雙層平板上的噬菌斑數(shù)目，計(jì)算噬菌體效價(jià),注:噬菌體校價(jià)=pfu數(shù)稀釋倍數(shù)10,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,2、思考題： 測(cè)定噬菌體的效價(jià)，操作時(shí)要注意些什么才能測(cè) 定準(zhǔn)確？ 計(jì)算噬菌體效價(jià)時(shí)，選擇30-300個(gè)pfu的平板計(jì) 數(shù)較好，為什么？ 如果在你的測(cè)定平板上，偶爾出現(xiàn)其他細(xì)菌的 菌落，是否影響你的噬菌體效價(jià)測(cè)定？,大型綜合實(shí)驗(yàn)一,酵母

49、菌原生質(zhì)體 誘變育種,一、目的要求,1觀察酵母菌子囊孢子的形成及學(xué)習(xí)酵母單倍體營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞 的制備方法； 2學(xué)習(xí)酵母原生質(zhì)體的制備過(guò)程； 3掌握用化學(xué)誘變劑處理原生質(zhì)體的操作方法； 4學(xué)會(huì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選和鑒定的一般方法； 5綜合訓(xùn)練微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的操作技能和科研能力。,二、基本原理,在高滲壓溶液中，用酶法將細(xì)胞壁分解除掉，剩下由原生質(zhì)膜包住的球狀胞體，稱為原生質(zhì)體（Protoplast）。它保持了原細(xì)胞的一切活性。 原生質(zhì)體誘變的原理是利用原生質(zhì)體因去掉細(xì)胞壁屏障而對(duì)誘變劑的敏感性強(qiáng)和變異率高的特點(diǎn)來(lái)選育人們需要的變異菌株，是菌種選育的一種行之有效的方法。 原生質(zhì)體可采用物理或化學(xué)因素誘發(fā)其基因的突

50、變?；瘜W(xué)誘變劑N -甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（簡(jiǎn)稱亞硝基胍，NTG）對(duì)誘變選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型非常有效。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，必須在其培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成份才能正常生長(zhǎng)的變異株。與其相對(duì)應(yīng)的是野生型菌株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)和研究上用途很廣，目前生產(chǎn)氨基酸和核苷酸的菌種大多是各種類型的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。要研究代謝途徑，要進(jìn)行原生質(zhì)體融合育種或其它重組育種技術(shù)，一般都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為研究材料。 本實(shí)驗(yàn)擬以兩種不同性狀的酵母菌（雙倍體）為出發(fā)菌株，先獲得其單倍體細(xì)胞，再分別制備其原生質(zhì)體。然后采用亞硝基胍進(jìn)行化學(xué)誘變處理，由再生菌落中檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型，再確定其生

51、長(zhǎng)譜。所獲得的精確營(yíng)養(yǎng)缺陷型可作為原生質(zhì)體融合育種的親本菌株。,三、實(shí)驗(yàn)材料,（一）出發(fā)菌株 1酵母菌A：耐高溫酒精酵母（雙倍體，能產(chǎn)生子囊孢子） 2酵母菌B：高糖面包酵母（雙倍體，能產(chǎn)生子囊孢子） （二）培養(yǎng)基 已在實(shí)驗(yàn)八預(yù)先準(zhǔn)備 （三）試劑 1. 緩沖液、生理鹽水及原生質(zhì)體穩(wěn)定液已在實(shí)驗(yàn)八預(yù)先準(zhǔn)備 2. 1 mol/L巰基乙醇 3. 蝸牛酶：用高滲緩沖液配成50 mg/mL溶液 4. 1 mg/mL亞硝基胍(NTG)：用緩沖液B配成1 mg/mL溶液 （四）器具 顯微鏡、水浴鍋、培養(yǎng)箱、離心機(jī)、搖床、超凈臺(tái)、各種常用玻璃器皿,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（一）酵母子囊孢子的獲得與觀察 1將酵母斜面種接入

52、麥汁錐瓶中，振蕩培養(yǎng)1824小時(shí)， 離心、洗滌、得菌體。 2將菌體大量涂布于醋酸鈉瓊脂斜面上置2528培養(yǎng)3 天以上，使產(chǎn)生子囊孢子。 3鏡檢觀察子囊孢子的形態(tài)和數(shù)目。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（二）單倍體酵母的分離制備 法一：用高滲緩沖液洗下醋酸鈉斜面上的菌體，加入1蝸牛酶作用4060分鐘。離心得菌體，加入少量硅藻土并用玻璃棒攪磨使子囊孢子分散。加入高滲液，攪勻靜置，取上清液涂布CM平板進(jìn)行分離培養(yǎng)后選取最小菌落接入CM斜面保存，若在醋酸鈉斜面上不產(chǎn)孢者則為單倍體。 法二：該法是根據(jù)子囊孢子比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞更耐熱的特性，用熱處理法分離單倍體菌株的。首先將酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞懸液（約 10-6 個(gè)/ml )浸于55

53、60恒溫水浴中加熱（不斷振蕩），每隔2分鐘用接種環(huán)醛取菌液接種于平板上。（約需10分鐘）。然后將平板置30培養(yǎng)2天，以確定完全不生長(zhǎng)或只有一兩個(gè)菌落生長(zhǎng)的處理?xiàng)l件。按著，從生孢子斜面上取菌體進(jìn)行同樣條件的處理，到時(shí)間后迅速冷卻，經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)行平板分離培養(yǎng)2天，挑取較小圓錐形菌落保存于斜面，再進(jìn)行鏡檢純化鑒定。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（三）單倍體酵母原生質(zhì)體的制備 1將單倍體酵母接入CM錐形瓶中，置30 振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，吸取2 mL菌液接入30 mL新鮮的CM液中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。 2上述菌液于3000轉(zhuǎn)分離心10分鐘，用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次，調(diào)整并制成約10-8個(gè)/mL的菌懸液。 3于無(wú)菌離心

54、管中加入： （1）菌懸液2 mL ； （2）1 mol/ L巰基乙醇0.1 mL； (3）緩沖液C0. 4 mL ； （4）混合鹽液1.6 mL ； （5）蝸牛酶1 mL （濃度1）。置30 水浴中處理約60分鐘，鏡檢。4以3000轉(zhuǎn)分離心5分鐘去酶，用高滲緩沖液B珠洗滌原生質(zhì)體兩次，恢復(fù)原體積，振蕩分散制成原生質(zhì)體懸浮液。用血球計(jì)數(shù)器于顯微鏡下直接觀察并計(jì)算原生質(zhì)體形成率。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（四）用亞硝基胍（NTG）誘變處理酵母 原生質(zhì)體 1吸取上述原生質(zhì)體懸浮液lml，加入0.2 lml亞硝基胍溶 液（處理濃度為0.150.5mg/ml），于30振蕩處理 3060分鐘。 2用高滲緩沖液B稀釋

55、1000倍中止作用。 3用同樣緩沖液作適當(dāng)稀釋后涂布在高滲再生培養(yǎng)基平板 上，于30培養(yǎng)數(shù)天，觀察再生菌落。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（五）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出 1分別制備酵母MM和CM兩種平板，并打格編號(hào)。 2用無(wú)菌牙簽將上述長(zhǎng)出的再生菌落逐一在MM和CM兩種 平板上依次在相應(yīng)位置上點(diǎn)種，經(jīng)培養(yǎng)后觀察并檢出營(yíng) 養(yǎng)缺陷型。 3檢出的缺陷型經(jīng)再次驗(yàn)證、分離、直至獲得純種精確的 營(yíng)養(yǎng)缺陷型。,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（六）營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜的確定。 1將缺陷型菌株接入CM液振蕩培養(yǎng)、離心、洗滌菌體，制備成細(xì)胞懸 浮液。 2取細(xì)胞懸液lml，與20m1 MM瓊脂培養(yǎng)基（融化并冷卻至50）混合 后傾注平皿，即為缺陷型平板。 3

56、將15種可能的營(yíng)養(yǎng)成分，配制成5組不同的營(yíng)養(yǎng)組合混合液，用濾紙 圈片吸飽后，分別放于上述缺陷型平板的5個(gè)區(qū)間上，培養(yǎng)后根據(jù)其 生長(zhǎng)情況，查表確定其營(yíng)養(yǎng)要求。 4將確定的營(yíng)養(yǎng)因子以合適濃度加入MM培養(yǎng)基中制成補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM) 同時(shí)接種缺陷型菌株于MM和SM上進(jìn)行缺陷營(yíng)養(yǎng)因子的確證試驗(yàn)。 5將選育獲得的營(yíng)養(yǎng)缺陷型移接于 CM斜面上，培養(yǎng)后注明其遺傳標(biāo) 記，妥善保存?zhèn)溆谩?大型綜合實(shí)驗(yàn)二,酵母菌原生質(zhì)體 融合育種,一、目的要求,1掌握原生質(zhì)體融合育種的基本理論和基本過(guò)程； 2掌握酵母原生質(zhì)體的制備、融合和再生的操作方法； 3，學(xué)習(xí)融合子的選擇及實(shí)用性優(yōu)良菌株的篩選思路和方法； 4培養(yǎng)和訓(xùn)練學(xué)生從事

57、微生物菌種選育的綜合技能，提高學(xué) 生從事科學(xué)實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)與科學(xué)研究的素質(zhì)。,二、基本原理,原生質(zhì)體融合屬于體細(xì)胞之間的無(wú)性融合，即用酶法將細(xì)胞膜外側(cè)的細(xì)胞壁除掉，制備成無(wú)細(xì)胞壁的球狀細(xì)胞體原生質(zhì)體。將兩種來(lái)源于微生物細(xì)胞A和B的原生質(zhì)體，在融合誘導(dǎo)劑（或促進(jìn)劑）聚乙二醇和Ca2+存在下等量混合起來(lái)，可使原生質(zhì)體表面形成電極性，相互之間易于吸引、脫水粘合而形成聚集物，進(jìn)而使原生質(zhì)體收縮變形，緊密接觸處的膜先形成原生質(zhì)橋，逐漸增大而實(shí)現(xiàn)融合。融合的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可再生出細(xì)胞壁而形成一個(gè)新細(xì)胞，這個(gè)細(xì)胞有可能具有A.B兩個(gè)原生質(zhì)體原有的特性或更加優(yōu)良的新的特性。 原生質(zhì)體融合育種是基因重組育種的一種重要方法，可分為下列幾個(gè)步驟： 1帶遺傳標(biāo)記融合親株的選擇 2原生質(zhì)體的制備 3原生質(zhì)體的融合 4原生質(zhì)體的再生 5融合子的選擇與實(shí)用性菌株的篩選,三、實(shí)驗(yàn)材料,（一）菌株 1酵母菌A：耐高溫酒精酵母（單倍體、營(yíng)養(yǎng)缺陷型）； 2酵母菌B：高糖面包酵母（單倍體、營(yíng)養(yǎng)缺陷型）； 3酵母菌C：耐高溫酒精酵母（雙倍體、不帶標(biāo)記、適于