課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),專題 2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨和二氧化碳之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌能利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?3、常見的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌。,4、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌 (計(jì)數(shù)),一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,.設(shè)置對照,1、實(shí)例： PCR技術(shù),啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生

2、存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,原因：因?yàn)闊崛獪囟?0800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制(PCR)的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,.篩選菌株,要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等； 方法： 抑制大多數(shù)微生物的生長 促進(jìn)目的菌株的生長 結(jié)果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。,2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,3、土壤中分解尿素的

3、細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？ 從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,選擇培養(yǎng)基,尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源， 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源，才能生長。 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,5、該培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基,尿素,尿素,6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為 唯一氮源 的培養(yǎng)基,牛肉膏

4、蛋白胨 培養(yǎng)基,是,分離能分解尿素的 細(xì)菌,判斷該 培養(yǎng)基 有無選 擇性,只生長能分解尿素的細(xì)菌,生長多種微生物,是,欄目鏈接,用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對照是( ) A未接種的選擇培養(yǎng)基 B未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 C接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 D接種了的選擇培養(yǎng)基,C,1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,利用血球計(jì)數(shù)板(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板），在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度； 個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點(diǎn)：,2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基

5、上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,看課本P22，并討論你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？,第一位同學(xué)：沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個平板） 第二位同學(xué)：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值,注意事項(xiàng) 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。 為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。(即設(shè)置重復(fù)組求平均數(shù)

6、) 統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。,微生物的計(jì)數(shù)法,顯微鏡直接計(jì)數(shù)、 間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）、 比濁法、 濾膜法,計(jì)算公式：,每克樣品中的菌株數(shù) =（CV）M,某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106 的培養(yǎng)基中測得 平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣 品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液 的體積為0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,B,（三）設(shè)置對照,判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染：,將未接種的培養(yǎng)基同時進(jìn)行培養(yǎng)。,判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：,完全培養(yǎng)基（營養(yǎng)成分齊全）接種后培養(yǎng) 觀察菌落數(shù)目。,主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)

7、 結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。,原因： 土樣不同 培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),小結(jié)：通過這個事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,方案二：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn),方案一：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的

8、配制有問題。,將細(xì)菌放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，它會繁殖并形成菌落(如下圖)。某實(shí)驗(yàn)小組想檢驗(yàn)兩種抗生素的殺菌作用，下列哪個實(shí)驗(yàn)方案最合適( ),C,菌落計(jì)數(shù),系列稀釋,涂布平板與培養(yǎng),配制土壤溶液,根據(jù)圖示27填寫以下實(shí)驗(yàn)流程：,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：,（一）土壤取樣,（二）制備培養(yǎng)基,（三）土壤樣品的稀釋,（四）取樣涂布,（五）微生物的培養(yǎng)與觀察,（八）鑒定,（七）細(xì)菌的計(jì)數(shù),二.實(shí)驗(yàn)的操作流程,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。,“微生物的天然培養(yǎng)基”,一土壤取樣,數(shù)量最大、種類最多,大約70%90%是細(xì)菌,取土樣用的小鐵鏟和

9、盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。,二制備培養(yǎng)基,由于初次實(shí)驗(yàn)，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103107。 準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。還需要8個滅菌試管和1個滅菌移液管 。 將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保證獲得菌

10、落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板,（三）樣品的稀釋,問題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。 結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,.取樣涂布,實(shí)驗(yàn)時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀

11、釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計(jì)數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,微生物的培養(yǎng)與觀察,同種微生物有穩(wěn)定的菌落特征：形狀，大小，隆起程度，顏色,操作提示,一無菌操作 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞

12、好棉塞。 3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好標(biāo)記 注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品 的稀釋度等。 三規(guī)劃時間,三、,（一）培養(yǎng)物(即培養(yǎng)的目的菌種)中是否有雜菌污染? 以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落?,對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,四.結(jié)果分析與評價,如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步分析產(chǎn)生差異的原因。,（二）樣品的稀釋操作是否成功,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作

13、比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。,（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致,鑒別培養(yǎng)基：加入某種指示劑或化學(xué)藥品，不影響微生物的生存 1、酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細(xì)菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨培養(yǎng)基堿性增強(qiáng) 酚紅變紅脲酶陽性 2、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：鑒定大腸桿菌 原理：代謝產(chǎn)物與伊紅美藍(lán)結(jié)合 菌落呈黑色并帶有金屬光澤。,屬鑒別培養(yǎng)基，它并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長,五.課外延伸,伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因?yàn)榈拇x產(chǎn)物與伊紅美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。,例如：鑒

14、別大腸桿菌培養(yǎng)基,大腸桿菌呈黑色中心 ,有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征,接種,不接種,接種,接種,需將未接種的選擇培養(yǎng)基同時進(jìn)行培養(yǎng),需設(shè)立牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行接種后培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)基上菌落數(shù)目、進(jìn)行對比得出結(jié),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則 (1)設(shè)立重復(fù)組： 統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)時，要至少涂布三個平板作重復(fù)組，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說服力與準(zhǔn)確性。 (2)設(shè)立兩種對照組：,欄目鏈接,四.結(jié)果分析與評價,2,2,本課題知識小結(jié):,課本問題答案對正,課題成果評價 （一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌

15、污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。 （二）樣品的稀釋操作是否成功 如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。 （三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致 如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，教師需要引導(dǎo)學(xué)生一起分析產(chǎn)生差異的原因。,（一）旁欄思考題 1.想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？ 答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。 2.為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸?/p>