課題2　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數

1、課題2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數,專題 2微生物的培養(yǎng)與應用,一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農業(yè)氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨和二氧化碳之后才能被植物利用。,2、細菌能利用尿素的原因,土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶,3、常見的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌。,4、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌,統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌 (計數),一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計菌落數目,.設置對照,1、實例： PCR技術,啟示：尋找目的菌種時要根據它對生

2、存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。,原因：因為熱泉溫度70800C，淘汰了絕大多數微生物只有Taq細菌被篩選出來。,DNA多聚酶鏈式反應是一種在體外將少量DNA大量復制(PCR)的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,.篩選菌株,要分離一種微生物，必須根據該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等； 方法： 抑制大多數微生物的生長 促進目的菌株的生長 結果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純化培養(yǎng)分離。,2、實驗室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,3、土壤中分解尿素的

3、細菌的分離與計數所需培養(yǎng)基：,從物理性質看此培養(yǎng)基屬于哪類？ 從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,選擇培養(yǎng)基,尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源， 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源，才能生長。 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,5、該培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基,尿素,尿素,6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為 唯一氮源 的培養(yǎng)基,牛肉膏

4、蛋白胨 培養(yǎng)基,是,分離能分解尿素的 細菌,判斷該 培養(yǎng)基 有無選 擇性,只生長能分解尿素的細菌,生長多種微生物,是,欄目鏈接,用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設置的對照是( ) A未接種的選擇培養(yǎng)基 B未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 C接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 D接種了的選擇培養(yǎng)基,C,1、顯微鏡直接計數：,利用血球計數板(血細胞計數板），在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。,.統(tǒng)計菌落數目：,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運動細菌的計數； 需要相對高的細菌濃度； 個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點：,2.間接計數法（活菌計數法） 原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基

5、上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數。,看課本P22，并討論你認為這兩位同學的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？,第一位同學：沒有重復實驗（至少涂布3個平板） 第二位同學：A組結果誤差過大，不應用于計算平均值,注意事項 為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30300的平板上進行計數。 為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中，經涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數。(即設置重復組求平均數

6、) 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數目低。,微生物的計數法,顯微鏡直接計數、 間接計數法（活菌計數法）、 比濁法、 濾膜法,計算公式：,每克樣品中的菌株數 =（CV）M,某同學在稀釋倍數為106 的培養(yǎng)基中測得 平板上菌落數的平均數為234，那么每克樣 品中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液 的體積為0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,B,（三）設置對照,判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染：,將未接種的培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)。,判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：,完全培養(yǎng)基（營養(yǎng)成分齊全）接種后培養(yǎng) 觀察菌落數目。,主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗

7、 結果的影響，提高實驗結果的可信度。,實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數目的實驗時，A同學從對應的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。,原因： 土樣不同 培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質),小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。,方案二：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗,方案一：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結果預測：如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的

8、配制有問題。,將細菌放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，它會繁殖并形成菌落(如下圖)。某實驗小組想檢驗兩種抗生素的殺菌作用，下列哪個實驗方案最合適( ),C,菌落計數,系列稀釋,涂布平板與培養(yǎng),配制土壤溶液,根據圖示27填寫以下實驗流程：,實驗設計：,（一）土壤取樣,（二）制備培養(yǎng)基,（三）土壤樣品的稀釋,（四）取樣涂布,（五）微生物的培養(yǎng)與觀察,（八）鑒定,（七）細菌的計數,二.實驗的操作流程,實驗設計,從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。,“微生物的天然培養(yǎng)基”,一土壤取樣,數量最大、種類最多,大約70%90%是細菌,取土樣用的小鐵鏟和

9、盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。,二制備培養(yǎng)基,由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數為103107。 準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。還需要8個滅菌試管和1個滅菌移液管 。 將稀釋相同倍數的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數目應明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。,應在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保證獲得菌

10、落數在30300之間、適于計數的平板,（三）樣品的稀釋,問題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？,原因：土壤中各類微生物的數量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數約為2 185萬，放線菌數約為477萬，霉菌數約為23.1萬。 結論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,.取樣涂布,實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了2個或2個以上菌落數目在30300的平板，則說明稀

11、釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數，如果同一稀釋倍數的三個重復的菌落數相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計數時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數目。 選取菌落數目穩(wěn)定時的記錄作為結果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,微生物的培養(yǎng)與觀察,同種微生物有穩(wěn)定的菌落特征：形狀，大小，隆起程度，顏色,操作提示,一無菌操作 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞

12、好棉塞。 3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好標記 注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品 的稀釋度等。 三規(guī)劃時間,三、,（一）培養(yǎng)物(即培養(yǎng)的目的菌種)中是否有雜菌污染? 以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落?,對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,四.結果分析與評價,如果學生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結果應該接近。如果結果相差太遠，需要進一步分析產生差異的原因。,（二）樣品的稀釋操作是否成功,如果得到了2個或2個以上菌落數目在30300的平板，則說明稀釋操作

13、比較成功，并能夠進行菌落的計數。,（三）重復組的結果是否一致,鑒別培養(yǎng)基：加入某種指示劑或化學藥品，不影響微生物的生存 1、酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨培養(yǎng)基堿性增強 酚紅變紅脲酶陽性 2、伊紅美藍培養(yǎng)基：鑒定大腸桿菌 原理：代謝產物與伊紅美藍結合 菌落呈黑色并帶有金屬光澤。,屬鑒別培養(yǎng)基，它并沒有促進大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長,五.課外延伸,伊紅美藍培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標，因為的代謝產物與伊紅美藍結合，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。,例如：鑒

14、別大腸桿菌培養(yǎng)基,大腸桿菌呈黑色中心 ,有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征,接種,不接種,接種,接種,需將未接種的選擇培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng),需設立牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行接種后培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)基上菌落數目、進行對比得出結,實驗設計原則 (1)設立重復組： 統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數時，要至少涂布三個平板作重復組，增強實驗結果的說服力與準確性。 (2)設立兩種對照組：,欄目鏈接,四.結果分析與評價,2,2,本課題知識小結:,課本問題答案對正,課題成果評價 （一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌

15、污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。 （二）樣品的稀釋操作是否成功 如果得到了2個或2個以上菌落數目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數。 （三）重復組的結果是否一致 如果學生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結果應該接近。如果結果相差太遠，教師需要引導學生一起分析產生差異的原因。,（一）旁欄思考題 1.想一想，如何從平板上的菌落數推測出每克樣品中的菌落數？ 答：統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數的平均值，然后按課本旁欄的公式進行計算。 2.為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 答：這是因為土壤中各類微生