胰酶消化貼壁細(xì)胞ppt課件.ppt

1、貼壁細(xì)胞的消化和處理及注意事項(xiàng)、貼壁細(xì)胞：必須附著在支持物表面才能在體外生長(zhǎng)。例如CHO細(xì)胞。消化：將分散的組織或粘附的培養(yǎng)物從彼此或培養(yǎng)基中分離出來(lái)，形成單細(xì)胞或小細(xì)胞群的操作。2。粘附細(xì)胞的消化。貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)成致密的單層后，沒(méi)有足夠的空間進(jìn)一步生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分被消耗得更多。同時(shí)，積累了更多的代謝廢物，需要在單獨(dú)的瓶中培養(yǎng)、擴(kuò)增和傳代培養(yǎng)。粘附緊密的細(xì)胞，如Hela、HepG2、CHO等。需要用細(xì)胞消化液消化才能脫落、分散和擴(kuò)展瓶子。常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸等。3.主要消化方法有：1 .酶消化(胰蛋白酶)；2.離子螯合劑；4.1.酶消化(胰蛋白酶)；1)胰蛋白酶

2、消化原理：胰酶是一種蛋白酶。通過(guò)降解特定位置的蛋白質(zhì)，細(xì)胞膜和培養(yǎng)皿壁連接處的蛋白質(zhì)被降解和分離。此時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)部骨架的張力和培養(yǎng)液的表面張力，細(xì)胞變成球形。用于細(xì)胞消化的胰蛋白酶通常在0.25的工作濃度和7.2-7.4的酸堿度下使用。5，2)酶消化法的操作過(guò)程：(以下操作必須嚴(yán)格按照無(wú)菌操作的要求進(jìn)行)，將細(xì)胞瓶中生長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞的原始培養(yǎng)液丟棄；根據(jù)細(xì)胞瓶的大小(取決于培養(yǎng)容器的大小)，以0.5毫升或更大的體積加入0.25毫升胰酶溶液，進(jìn)行完全滲透；通常，消化時(shí)間約為1至3分鐘。當(dāng)瓶底從半透明(細(xì)胞單層連接成碎片)變?yōu)辄c(diǎn)狀透明(出現(xiàn)微小縫隙)時(shí)，胰酶被丟棄，加入適量血清培養(yǎng)基停止消化，

3、并將其吹散。7，圖片：CHO貼壁細(xì)胞，8，培養(yǎng)48小時(shí)后，成為致密的單層，9，加入0.25%胰蛋白酶后，細(xì)胞逐漸縮小變圓，細(xì)胞間隙增大，不再致密；10、細(xì)胞明顯萎縮變小，細(xì)胞間隙增大，不再致密，部分細(xì)胞保持正常形態(tài)，部分細(xì)胞萎縮變圓。11、細(xì)胞基本上收縮并變圓，當(dāng)細(xì)胞被吹倒時(shí)，12、細(xì)胞完全收縮并變圓，胰酶應(yīng)被丟棄，細(xì)胞可在加入培養(yǎng)基后通過(guò)搖動(dòng)從細(xì)胞瓶壁上洗掉，細(xì)胞懸液可通過(guò)吸管吹走然后傳遞，13、經(jīng)驗(yàn)后，可以用肉眼觀察附著在壁上的半透明細(xì)胞層以判斷消化程度。如果你消化得太多，你會(huì)看到許多細(xì)胞脫落并隨著廢棄的胰酶溶液流失，甚至導(dǎo)致細(xì)胞破碎。也可以在倒數(shù)第二步和第三步中丟棄胰酶，并繼續(xù)使用瓶中剩

4、余的胰酶，以達(dá)到最后一步的消化水平，這有點(diǎn)太多，影響很小。14.注意事項(xiàng)：1溶解后一周內(nèi)，使用冰箱4中儲(chǔ)存的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶可能在4點(diǎn)開(kāi)始降解。如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘，它將變得不穩(wěn)定。2.在使用胰酶細(xì)胞消化液的過(guò)程中，應(yīng)特別注意避免細(xì)菌污染。胰酶細(xì)胞消化液的消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則細(xì)胞擴(kuò)散后會(huì)生長(zhǎng)不良。消化不充分使得細(xì)胞很難從瓶壁上吹下來(lái)，反復(fù)吹也會(huì)損害細(xì)胞活性。4.37: 00時(shí)，胰酶活性最強(qiáng)。16，5。溶液中的Ca2、Mg2和血清中的非特異性胰蛋白酶抑制劑會(huì)降低胰蛋白酶的活性，因此加入血清培養(yǎng)基可以停止反應(yīng)。17.用胰蛋白酶消化后，細(xì)胞仍會(huì)結(jié)塊?？赡艿脑蚴鞘裁?？消化時(shí)間不夠

5、；吹得不夠強(qiáng)；胰酶消化液的濃度不夠；胰酶本身；細(xì)胞密度高；離子螯合劑：(乙二胺四乙酸)，1)乙二胺四乙酸消化原理：乙二胺四乙酸是一種螯合劑，因?yàn)樵S多結(jié)合到細(xì)胞表面培養(yǎng)皿上的蛋白質(zhì)攜帶Ca2或Mg2，而乙二胺四乙酸螯合Ca2或Mg2，從而加速細(xì)胞從培養(yǎng)皿中分離。19，2)使用乙二胺四乙酸消化液的注意事項(xiàng)，1。常見(jiàn)濃度約為0。3.乙二胺四乙酸能顯著影響酸堿度，并且不會(huì)被中和，因此消化的細(xì)胞應(yīng)該用PBS洗滌一次，20，適用范圍，因?yàn)橐叶匪囊宜岵黄茐募?xì)胞表面分子，而只與Ca2和Mg2螯合。因此，它適用于待檢測(cè)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞消化。細(xì)胞保存是細(xì)胞保存的主要方法之一。低溫保存技術(shù)是將細(xì)胞低溫保存在-1

6、96液氮中，使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)，保持其細(xì)胞特性，必要時(shí)將細(xì)胞復(fù)蘇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞復(fù)蘇：解凍冷凍細(xì)胞，然后傳代培養(yǎng)。為了獲得良好的冷凍保存和復(fù)蘇效果，我們必須了解以下問(wèn)題：冷凍速率、復(fù)溫速率、冷凍保護(hù)劑的冷凍溫度、24、1、冷凍速率(指冷卻速度)是活細(xì)胞能否冷凍到可永久保存的溫度的主要因素。如果冷凍速度太快或太慢，細(xì)胞將會(huì)受損。只有以最佳的冷凍速率冷凍細(xì)胞，才能獲得最佳的冷凍效果。25，2，再加熱速率再加熱速率是指細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程中溫度升高的速率。當(dāng)冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，不適當(dāng)?shù)膹?fù)溫率也會(huì)降低冷凍保存的存活率。一般來(lái)說(shuō)，回溫速度越快越好。在37水浴中，復(fù)溫應(yīng)在12分鐘內(nèi)完成。防凍劑防凍劑是能夠保護(hù)

7、細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，通常被添加到某些溶液中以制備成防凍劑。常用的冷凍保護(hù)劑：27、4、冷凍溫度是指能長(zhǎng)期保存細(xì)胞的深低溫。在這個(gè)溫度下，細(xì)胞的生化反應(yīng)極其緩慢或停止，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期保存和恢復(fù)，它們?nèi)阅鼙３终５慕Y(jié)構(gòu)和功能。從實(shí)用和效益的角度來(lái)看，液氮溫度(196)是目前最好的冷凍保存溫度，而28，是一種滲透性保護(hù)劑，它能迅速滲透到細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞膜對(duì)水的滲透性，降低冰點(diǎn)，延緩冷凍過(guò)程，并使細(xì)胞內(nèi)的水在冷凍前排出細(xì)胞，在細(xì)胞外形成冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的傷害。它的濃度必須等于10%，即使在低溫下對(duì)細(xì)胞也是有毒的。一些細(xì)胞不能使用二甲基亞砜，但甘油。29，細(xì)胞冷凍保存程序，1個(gè)細(xì)胞在冷凍保存前24-48小時(shí)傳代培養(yǎng)，2個(gè)細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期，2個(gè)細(xì)胞被胰酶消化，然后加入適量的培養(yǎng)基，吹入細(xì)胞懸液3中，加入新生牛血清4并滅菌，過(guò)濾，5混合均勻，30，6，將懸液加入滅菌的冷凍管中，1-2 ml/管，密封，并置于標(biāo)明細(xì)胞名稱的4度冰箱中。30分鐘后轉(zhuǎn)移至-20冰箱，30分鐘后轉(zhuǎn)移至液氮口，數(shù)小時(shí)后轉(zhuǎn)移至液氮保存。8.使細(xì)胞復(fù)蘇，檢查它是否活躍。31.細(xì)胞復(fù)蘇程序，取出儲(chǔ)存的細(xì)胞，在37水浴中快速融化，然后直接用完整的生長(zhǎng)培養(yǎng)基平板培養(yǎng)細(xì)胞。1