實驗四+醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白.ppt

1、實驗4:血清蛋白醋酸纖維膜電泳，目的1。掌握電泳的基本原理。掌握電泳的基本操作和原理電泳：帶電粒子在電場中游動的現(xiàn)象。在相同的酸堿度條件下，不同的蛋白質(zhì)由于分子量和電荷量不同，在電場中的遷移率不同而被分離。使用不帶支持物的支持物1)紙電泳2)淀粉凝膠電泳3)瓊脂糖凝膠電泳4)醋酸纖維素薄膜電泳5)聚丙烯酰胺凝膠電泳，遷移率U，遷移率：單位電場強度下帶電粒子的遷移速度U=v/E=dl/Vt E:電場強度，每厘米電壓降，V/l v:粒子的D/t d:粒子的移動距離t:帶電時間v:實際電壓施加到支持物的兩端l v:有效長度影響游泳速度的主要因素，1)電場強度：(移動速度越大)常壓電泳：100-500

2、伏，2-10伏/厘米高壓電泳：500-10000伏8.60 3)溶液離子強度：(離子強度越大，速度越慢； 緩沖效果越好)，介于0.02和0.2之間。電滲現(xiàn)象：電場中液體相對于固體支持物的相對運動。盡量避免支持高電滲。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，Davis和Ornstein 1959-人血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠：丙烯酰胺(Acr，單體)和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis，交聯(lián)劑)共聚(由過硫酸銨-四乙基乙二胺TEMED體系或核黃素-TEMED體系激發(fā))。分子篩可以通過調(diào)節(jié)單體濃度或與交聯(lián)劑的比例來控制孔徑大小，以達到不同的分離目的。凝膠可以是平板(垂直平板型)或柱(圓盤型)，SDS:十二烷基硫

3、酸鈉CH3(CH2)11OSO3Na，與蛋白質(zhì)結合的陰離子洗滌劑，可以破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水相互作用，破壞蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結構。1)加入還原劑如巰基乙醇以打開-s-s-；2)SDS破壞蛋白質(zhì)構象，與氨基酸側鏈結合形成蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束。SDS是陰離子，使多肽鏈帶負電荷，遠遠超過蛋白質(zhì)分子的原始電荷，掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異。電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)或亞單位的分子量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，可使蛋白質(zhì)成為亞單位，形成蛋白質(zhì)-十二烷基硫酸鈉膠束，消除蛋白質(zhì)分子間的電荷和形狀差異；橢圓桿，短軸為1.8納米，長軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比。分子量為15200千道爾頓，

4、電泳遷移率與分子量的對數(shù)成線性關系。LogM=a-bRf，Rf為遷移率，醋酸膜電泳(CAM)，一種以醋酸膜為支持的區(qū)域電泳技術，將血清樣品點在醋酸膜上，然后在pH8.6緩沖液中電泳，所有血清蛋白帶負電并移至正電極。由于血清中蛋白質(zhì)組分的等電點不同，表面凈電荷不同，分子大小和形狀也不同，所以電泳遷移率不同，可以相互分離。電泳后，經(jīng)染色和沖洗后，計算機輔助制造可清晰顯示白蛋白、1、2和球蛋白的五個條帶。人血清中常見蛋白質(zhì)的等電點和分子量，蛋白質(zhì)等電點分子量的正常參考值(%)白蛋白4.88 69000 57-68 1-球蛋白5.06 200000 1.0-5.7 2-球蛋白5.06 300000 4

5、.9-11.2-球蛋白5.12 90000-150000 7-13-球蛋白6.85-7.2 150 9.8-pH8.6負電極1巴比妥緩沖液2氨基黑10b染色液：取0.5g氨基黑10B、50ml甲醇和10ml冰醋酸，加水至100ml。 沖洗液：95乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，蒸餾水50毫升，操作準備，醋酸纖維素薄膜的制備：將薄膜放入緩沖液中，自然浸泡約20分鐘。2電泳槽的準備：水平放置，將緩沖液注入電泳槽，兩側的緩沖液相同，在框架上放置一個濾紙橋，蓋上電泳槽蓋。3取樣：取出完全浸濕的膠片(膠片上無白色痕跡)，用濾紙輕輕吸干膠片上多余的緩沖液，用粗糙面(無光澤面)取樣，用血清蘸取載玻片，垂直印在CAM的粗糙面上。操作-電泳，4添加樣品后，將薄膜條放在支持物的兩端，取樣側朝下，取樣側在負端。薄膜應平直無彎曲，并應在與罐蓋平衡5分鐘后通電。5連接電泳槽和電泳儀的正負極，接通電源。電壓為160伏。電泳50分鐘，關閉電源。6染色：用鑷子取出薄膜條，放入染色液中8分鐘。染色時輕輕搖動染色盤，使染色完成。7.沖洗：從染液中取出薄膜條，盡可能多地排出染液，并在沖洗盤中反復沖洗，直到背景被沖洗干凈。此時，5個條帶清晰可見，需