科技探索之路　基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程.ppt

1、基因工程的基本操作程序,制作人：周蔚蔚,新課導(dǎo)入,外星來客？,虎蠶,白斑馬,你是否相信？,普通玉米,有抗蟲基因的玉米,基因工程的基本操作程序,制作人：周蔚蔚,基因工程的基本操作程序,（1）目的基因的獲取 （2） （3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 （4）目的基因的檢測與鑒定,基因表達(dá)載體的構(gòu)建,一、目的基因的獲取,1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。 2、獲取方法： （1）從基因文庫中獲取目的基因； （2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因； （3）通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成,（一）從基因文庫中獲取目的基因,1.什么叫基因文庫？ 將含有某種生物不同基因的許多

2、DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。,閱讀課本第10頁，回答下列問題,1.基因文庫的構(gòu)建方法？ 2.CDNA文庫的構(gòu)建方法？ 3.比較基因文庫與CDNA文庫的不 同,基因組文庫的構(gòu)建模式圖,通過對 受體菌 的培養(yǎng)而儲存基因,生物某個(gè)發(fā)育時(shí)期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組DNA,與載體連接,cDNA文庫,反轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,導(dǎo)入受體菌中儲存, cDNA文庫的構(gòu)建-逆轉(zhuǎn)錄法：,基因組文庫和部分基因文庫的比較,小,大,無,有,無,有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可以,部分基因可以,思考： 如何從基因文庫中得到所需要的基

3、因？,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色體上的位置； 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA； 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。,注意：,基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。,DNA的復(fù)制（動(dòng)畫）,DNA解旋酶,RNA引物酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA連接酶,DNA解旋酶打開DNA雙鏈,引物酶合成引物（RNA），為復(fù)制準(zhǔn)備,A,DNA聚合酶合成DNA片段,A,后隨鏈繼續(xù)合成新的引物，然后合成新的片段,A,DNA聚合酶切除引物片段，留下一個(gè)小缺口（紅色區(qū)域）,A,DNA連接酶填補(bǔ)小缺口,A,解旋酶脫下，DNA復(fù)制完成,邊解旋復(fù)制,半保留復(fù)制

4、,多起點(diǎn)復(fù)制,半不連續(xù)復(fù)制,（四） PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）,1、 DNA聚合酶特性,不能從頭合成DNA，只能從DNA的3端開始延伸DNA鏈，因此， DNA復(fù)制需要引物,2、 DNA聚合酶作用過程,當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后， DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈， DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸,A T C G A A T C G G T T,U A C C T T A G C C A A,DNA 聚合酶,母鏈 DNA,子鏈 DNA,引物,3,3,5,5,DNA聚合酶,高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNA聚合酶

5、解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化,3、 Taq DNA聚合酶的應(yīng)用,4、 緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì),DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行,PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出,6、 PCR技術(shù)的特點(diǎn),7、PCR和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的不同點(diǎn), PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為2030個(gè)脫氧核苷酸, PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制

6、來實(shí)現(xiàn)的,（五） PCR的反應(yīng)過程,1、PCR的反應(yīng)步驟,PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性和延伸,變性（模板DNA解旋）,模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,2、循環(huán)過程,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),第1輪結(jié)束,第2輪開始,PCR的基本原理

7、,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),第2輪結(jié)束,3、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量,4、PCR 循環(huán)的結(jié)果, DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增,在第_輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。,從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物_ 作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物 結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸,設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。,第1

8、組：_ _； 第2組：_ _。,引物和引物局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配,對而失效,引物自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基,互補(bǔ)配對而失效,人工合成,(基因比較小),DNA合成儀,【例1】 水稻種子中70%的磷以植酸形式存在。植酸易同鐵、鈣等金屬離子或蛋白質(zhì)結(jié)合排出體外，是多種動(dòng)物的抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)，排出的大量磷進(jìn)入水體易引起水華。為從根本上解決水稻中的高植酸問題，可將植酸酶基因?qū)胨?，培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。下圖是獲取植酸酶基因的流程。,目的基因的獲取,據(jù)圖回答下面的問題。 (1)圖中基因組文庫_(填“小于”“等于”“大于”)cDNA文庫。 (2)B過程需要的酶是_； A、C過程中_(填“可以”“不可以”)使

9、用同一種探針篩選含目的基因的菌株。 (3)目的基因和除從構(gòu)建的文庫中分離外，還可以分別利用圖中_和_為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該過程中所用酶的顯著特點(diǎn)是_。,深度剖析基因組文庫包含本物種全部遺傳信息，cDNA文庫僅包含部分遺傳信息；由mRNA構(gòu)建cDNA文庫需逆轉(zhuǎn)錄酶，篩選目的基因時(shí)，可用同一種探針對由基因組文庫或cDNA文庫中獲取的目的基因予以檢測，若通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，可利用DNA或cDNA作為模板，該擴(kuò)增過程需耐高溫的DNA聚合酶參與。 答案(1)大于(2)逆轉(zhuǎn)錄酶可以(3)DNAcDNA耐高溫,【例2】 1抗胰蛋白酶缺乏癥是北美常見的一種單基因遺傳病，患者成年后會(huì)出現(xiàn)肺氣腫及其

10、他疾病，嚴(yán)重者甚至死亡。利用基因工程技術(shù)將控制該酶合成的基因?qū)胙虻氖芫眩罱K培育出能在乳腺細(xì)胞表達(dá)人1抗胰蛋白酶的轉(zhuǎn)基因羊，從而更容易獲得這種酶。,基因表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化,下列關(guān)于該過程的敘述中錯(cuò)誤的是 ( ) A載體上綠色熒光蛋白基因(GFP)的作用是便于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞 B將目的基因?qū)胙虬螂准?xì)胞中，將會(huì)更加容易得到1抗胰蛋白酶 C培養(yǎng)出的轉(zhuǎn)基因羊的所有細(xì)胞中都含有該目的基因，故該羊有性生殖產(chǎn)生的后代也都能產(chǎn)生1抗胰蛋白酶 D目的基因與載體重組過程需要DNA連接酶的催化作用,深度剖析基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞，常以受精卵作為

11、受體細(xì)胞；將目的基因與載體結(jié)合，需要DNA連接酶的催化作用。 答案C,1.下列屬于獲取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取 從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成,2哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分( ) A啟動(dòng)子 B終止密碼 C標(biāo)記基因 D目的基因,3.資料顯示，近十年來，PCR技術(shù)（DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)）成為分子生物實(shí)驗(yàn)的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制的特性，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制（如下圖），在很短的時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍，使分子生物實(shí)驗(yàn)所需的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。請據(jù)圖回答：,（1）加熱至94的目的是使DNA樣品中的_鍵斷裂，該過程在生物體細(xì)胞內(nèi)是通過_酶的作用完成的。分析可知新合成DNA分子中A=T，C=G，這說明DNA分子的合成遵循_。 （2）與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比，PCR技術(shù)所需要的DNA聚合酶的最適溫度比較_（高、低）。,（3）通過PCR技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制時(shí)，若將一個(gè)用15N標(biāo)