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文檔簡(jiǎn)介

1、徐師大-屈艾老師制作,1,第二章 基因克隆的工具酶 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化 第二節(jié) DNA連接酶 第三節(jié) DNA聚合酶 第四節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄酶及其它酶,徐師大-屈艾老師制作,2,基因工程工具酶,“工若善其事,必先利其器”。 基因工程的操作,是分子水平的操作,它涉及到一系列相互關(guān)連的酶促反應(yīng),要靠一些重要酶類作工具,對(duì)基因進(jìn)行人工切割和拼接,故稱為“工具酶”。已知有許多酶在基因克隆實(shí)驗(yàn)中有著廣泛的用途。 工具酶是從哪里獲得的呢?,徐師大-屈艾老師制作,3,基因工程工具酶,自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。 這些酶類參與微生物的核酸代謝,在核酸復(fù)制和修復(fù)等反應(yīng)中具有重要

2、作用,有的酶還具有微生物區(qū)別自己DNA和非己DNA的功能,進(jìn)而作為降解非己DNA的防御工具。 在研究掌握了利用這些酶類對(duì)基因切割、拼接操作方法后,人類即獲得了最好的基因工程“工具”。 以其功能可分為三大類:核酸降解酶類、核酸合成酶類、核酸修飾酶類,徐師大-屈艾老師制作,4,徐師大-屈艾老師制作,5,第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化(九個(gè)問題),一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 二核酸內(nèi)切限制酶的類型 及切割頻率 三核酸內(nèi)切限制酶的命名原則 四.型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性 五影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素(5點(diǎn)+1) 六. 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止 七、限制酶消化反應(yīng)的步驟 八. 使用限制酶的注意點(diǎn)(4

3、點(diǎn)) 九、DNA的片段化,徐師大-屈艾老師制作,6,一、限制性內(nèi)切酶(restriction enzyme)的發(fā)現(xiàn) 1限制性核酸內(nèi)切酶: -是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。它們主要是從原核生物中分離純化出來的。 根據(jù)1994年美國(guó)出版的分子生物學(xué)百科全書的統(tǒng)計(jì)數(shù)字,僅型核酸內(nèi)切限制酶一項(xiàng)迄今就已從各種不同的微生物當(dāng)中,分離出2 300種以上,可識(shí)別230種不同的DNA序列。 2、發(fā)現(xiàn) 早在20世紀(jì)中期,以Arber等人對(duì)入噬菌體在大腸桿菌不同菌株的平板培養(yǎng)效應(yīng)的研究中,就發(fā)現(xiàn)了原核生物體內(nèi)存在著寄主控制的限制(Restriction)和

4、修飾(Modification)系統(tǒng)(R-M系統(tǒng))。,徐師大-屈艾老師制作,7,在限制-修飾系統(tǒng)中限制作用是指宿主細(xì)菌可以通過自身限制酶的作用,破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等),使得外源DNA對(duì)生物細(xì)胞的入侵受到限制,而保護(hù)了宿主菌; 而生物細(xì)胞(如宿主)的DNA分子合成后,通過自身修飾酶的作用,使特定位置上的堿基發(fā)生甲基化而得到了修飾,可免遭自身限制性酶的破壞,這就是R-M系統(tǒng)中修飾作用的含義。 1978年 W. Arber,H. O.Smith,Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對(duì)其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)。,徐師大-屈艾老師制作,8,l,徐師大-屈艾老師制作,9,徐師大-屈

5、艾老師制作,10,二核酸內(nèi)切限制酶的類型 及切割頻率 1、類型,徐師大-屈艾老師制作,11,徐師大-屈艾老師制作,12,2、切割頻率,-是指某限制性核酸內(nèi)切酶在DNA分子中預(yù)期的切割概率。有了它,又知道DNA序列的長(zhǎng)度,就可以估算該限制性核酸內(nèi)切酶在某種DNA分子中的切點(diǎn)數(shù)N。 但前提是:假定DNA的堿基組成是均一的、識(shí)別序列在DNA分子上是隨機(jī)分布的。 因?yàn)樗械腄NA分子都是由4種脫氧核苷酸組成的,每一種出現(xiàn)的概率即為1/4 。如果某限制性核酸內(nèi)切,徐師大-屈艾老師制作,13,酶的識(shí)別序列是6 bp時(shí),則其切割頻率為(1/4)6 =1/4096,即每隔4.1kb就可能有一個(gè)切割點(diǎn)。 當(dāng)識(shí)別

6、序列為n個(gè) bp, 則其切割頻率為(1/4)n 。,徐師大-屈艾老師制作,14,三核酸內(nèi)切限制酶的命名原則 由于發(fā)現(xiàn)了大量的限制酶,所以需要有一個(gè)統(tǒng)一的命名法。HOSmith和DNathans(1973)提議的命名系統(tǒng),已被廣大學(xué)者所接受。他們建議的命名原則包括如下幾點(diǎn): (1) 用屬名的第1個(gè)字母(大寫)和種名的頭2個(gè)字母(小寫),組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名稱。例如,大腸桿菌(Escherichia coli)用Eco表示,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。,徐師大-屈艾老師制作,15,限制性核酸內(nèi)切酶的命名,EcoR I,Escherichi

7、a,屬名,Coli,種名,Ry13,株系,編號(hào),若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。,徐師大-屈艾老師制作,16,(2) 用一個(gè)寫在右下方的標(biāo)注字母代表菌株或型,例如Ecok、 Hind 。 (3)如果一種特殊的寄主菌株,具有幾個(gè)不同的R-M體系時(shí),則以羅馬數(shù)字表示。例如,流感嗜血菌Rd菌株的幾個(gè)限制與修飾體系分別表示為HindI、HindII、HindIII等等。,徐師大-屈艾老師制作,17,(4)名稱: 限制酶,核酸內(nèi)切限制酶用R表示外,還要帶有系統(tǒng)的名稱,例如,流感嗜血菌核酸內(nèi)切酶 RHindIII; 修飾酶,則在它的系統(tǒng)名稱之前加上甲基化酶M表示。相應(yīng)于核酸內(nèi)切酶

8、RHindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修飾酶,命名為甲基化酶M. HindIII。 但在實(shí)際應(yīng)用上,這個(gè)命名體系已經(jīng)作了進(jìn)一步的簡(jiǎn)化: 由于附有標(biāo)注字母在印刷上很不方便,所以現(xiàn)在通行的是把全部略語(yǔ)字母寫成一行。 在上下文已經(jīng)交待得十分清楚只涉及限制酶的地方,限制性核酸內(nèi)切酶的名稱R便被省去。,徐師大-屈艾老師制作,18,四.型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性,1. 為單鏈多肽, 最適pH6-8, 能被鹽抑制、被Mg2+激活; ,2. 底物DNA分子雙鏈中有特異性識(shí)別序列,通常有4-8個(gè)bP甚或更多,大都為一回文對(duì)稱的結(jié)構(gòu)(即識(shí)別序列中有一個(gè)中心對(duì)稱軸,若從這個(gè)軸向兩側(cè)方向“讀”,內(nèi)容都是完全相同的,

9、也稱為反向重復(fù)序列)。 3 . 一般可在特異性識(shí)別序列內(nèi)切割雙鏈DNA分子(有例外),產(chǎn)生鏈的斷裂,斷裂端有粘性末端和平齊末端之分。其中兩個(gè)粘性末端可以互補(bǔ)配對(duì)連結(jié)成重組分子。 4. 其他:同裂酶、同尾酶、遠(yuǎn)距離裂解酶、雙切割酶等。分述如下: c,徐師大-屈艾老師制作,19,A.識(shí)別序列,識(shí)別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)或靶序列。 回文序列的概念:具有特異性識(shí)別的反向重復(fù)序列稱為回文序列。 識(shí)別序列有連續(xù)的(如GATC)和間斷的(如GANTC)兩種,它們都呈回文結(jié)構(gòu)。,A B C C B A,A B C C B A,A B N B A,A B N B A,A B B A,A B B A,或,或

10、,徐師大-屈艾老師制作,20,EcoR :,Pst:,不同核酸內(nèi)切酶的特異識(shí)別位點(diǎn),徐師大-屈艾老師制作,21,B. 切割類型: 檢驗(yàn)大量的實(shí)驗(yàn)事例之后發(fā)現(xiàn),由核酸內(nèi)切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割類型,通常是屬于下述兩種排列方式之一: (1)兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列,這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片段( 3- 和 5- ); (2)兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心,這樣形式的斷裂是形成具有平齊末端的DNA片段。,徐師大-屈艾老師制作,22,三種酶切末端,5粘性末端(如EcoR ),3粘性末端(如Pst ),平齊末端(如Sma、A

11、lu、Hae),徐師大-屈艾老師制作,23,5-CTGCA G-3,5-CTGCA-OH-3 P-G-3,,(a)Pst I切割位點(diǎn) , 切割后形成3-OH的單鏈粘性末端,3-G ACGTC-5, 3-G -P + 3- HO-ACGTC-5,,(b) EcoRI切割位點(diǎn),切割后形成5-P的單鏈粘性末端,5-G |AATTC-3 5-G -OH + 5-P-AATTC-3,3-CTTAA| G-5 3-CTTAA-P-5 HO-G-5,(c)EcoRV切割位點(diǎn),切割后形成平齊末端,5-GAT ATC-3 5-GAT + ATC-3,3-CTA TAG-5 3-CTA TAG-5,徐師大-屈艾老

12、師制作,24,產(chǎn)生的末端特征: 我們所說的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)(若是-3),它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新連結(jié)起來。 平末端的DNA片段與粘性末端相比,則不易于重新連結(jié),耗能多。,徐師大-屈艾老師制作,25,(2) 同裂酶 (isoschizomers) 來源不同的限制酶識(shí)別序列相同,產(chǎn)生同樣的切割,形成同樣的末端,這類酶稱為同裂酶(isoschizomers)。 若同裂酶的切點(diǎn)相同,會(huì)形成同樣的末端。例如,Hpa和MspI(C/CGG);,徐師大-屈艾老師制作,26,來源不同,識(shí)別的靶序列也各不相同,但都能產(chǎn)生相同的粘性末端,稱為同尾

13、酶。 常用的BamH I, Bcl I, Bgl, Xho I就是一組同尾酶。它們切割DNA之后都形成由 -GATC- 4個(gè)核苷酸組成的粘性末端,很顯然,由同尾酶所產(chǎn)生的DNA片段,是能夠通過其粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來的,因此在基因克隆中很有用處。,(3) 同尾酶 (isocaudamer),徐師大-屈艾老師制作,27,例如:,BamH Bcl Bgl三種酶可產(chǎn)生相同的5GATC粘性末端,由這種同尾酶產(chǎn)生的DNA片段可因粘性末端的互補(bǔ)而彼此再連接起來。,徐師大-屈艾老師制作,28,由同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn),稱之為“雜種位點(diǎn)”(hybrid site)。 但必須指

14、出,這類雜種位點(diǎn)的結(jié)構(gòu),一般不能再被原來的任何一種同尾酶所識(shí)別切割的。例如:Sal I (5-G TCGAC-3)和 XhoI (5-C TCGAG-3)的消化片段相連,但所形成的重組片段(5-GTCGAG-3)則不能被上述2種酶的任一種酶識(shí)別和切割。(也可能有少數(shù)例外)。,徐師大-屈艾老師制作,29,表:幾種常見的限制性核酸內(nèi)切酶,徐師大-屈艾老師制作,30,五影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素(5點(diǎn)+1),1) DNA的純度 2) DNA的甲基化程度 3) 酶切消化反應(yīng)的溫度 4) DNA的分子結(jié)構(gòu) 5) 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液 * 關(guān)于限制性內(nèi)切酶的星活性,徐師大-屈艾老師制作,31,1 、

15、DNA的純度 核酸內(nèi)切限制酶消化DNA底物的反應(yīng)效率,在很大程度上是取決于所使用的DNA本身的純度。若污染了在DNA制劑中的某些物質(zhì)后,(例如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸EDTA、SDS十二烷基硫酸鈉、以及高濃度的鹽離子等)都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶的活性。,徐師大-屈艾老師制作,32,為了提高核酸內(nèi)切酶對(duì)低純度DNA的反應(yīng)效率,一般采用如下三種方法: 增加核酸內(nèi)切限制酶的用量,平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些。(加大成本) 擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積,以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)地稀釋。 延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。,徐師大-屈艾老師制作,33,在有些DNA制劑中,尤其是按微量堿法制

16、備的,會(huì)含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在,而在DNA的貯存緩沖液中含有螯合二價(jià)金屬離子的EDTA,因此在這種貯存制劑中的DNA仍然是穩(wěn)定的。 然而在加入了核酸內(nèi)切限制酶緩沖液之后(內(nèi)含Mg2+ ),DNA則會(huì)被DNase迅速地降解掉。要避免發(fā)生這種情況,唯一的辦法就是使用高純度的DNA 。,徐師大-屈艾老師制作,34,2、 DNA的甲基化程度 限制性核酸內(nèi)切酶是原核生物限制修飾體系的組成部分,因此識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化作用,會(huì)強(qiáng)烈地影響酶的活性。 為避免產(chǎn)生這樣的問題,在基因克隆中使用的是從失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備的質(zhì)粒DNA。,徐師大-屈艾老師

17、制作,35,3、 酶切消化反應(yīng)的溫度 DNA消化反應(yīng)的溫度,是影響核酸內(nèi)切限制酶活性的另一個(gè)重要因素。 不同的核酸內(nèi)切限制酶,具有不同的最適反應(yīng)溫度,而且彼此之間有相當(dāng)大的變動(dòng)范圍。大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37,但也有許多例外的情況。其中有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度低于標(biāo)準(zhǔn)的37,例如SmaI是25、ApaI是30;有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度則高于標(biāo)準(zhǔn)的37,例如MaeI是45、Bcl I是50、MaelII是55;還有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度可高達(dá)60以上。 消化反應(yīng)的溫度低于或高于最適溫度,都會(huì)影響核酸內(nèi)切限制酶的活性,甚至最終導(dǎo)致完全失活。,徐師大-屈艾老師

18、制作,36,4、DNA的分子結(jié)構(gòu) DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量,要比消化線性DNA的高出許多倍,最高的可達(dá)20倍。 此外,還有一些核酸內(nèi)切限制酶,切割它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn),其效率亦有明顯的差別。據(jù)推測(cè),這很可能是由于側(cè)翼序列的核苷酸成份的差異造成的(位點(diǎn)偏愛 見教材P42)。,徐師大-屈艾老師制作,37,5、限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液 核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組份包括: 氯化鎂或醋酸鎂,氯化納或醋酸鉀 Tris-HCl(-AC), -巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT),牛血清白蛋白(BSA)

19、等。酶活性的正常發(fā)揮,是絕對(duì)需要二價(jià)陽(yáng)離子的,通常是Mg2+。購(gòu)買時(shí)廠家會(huì)提供專門的緩沖液并有說明其成分。有些核酸內(nèi)切酶可以在2種甚至4種緩沖液中均有較高的催化活性。,對(duì)絕大多數(shù)限制酶來說,在pH=74的條件下,其功能最佳,一般為pH68。,徐師大-屈艾老師制作,38,6.星()活性:在“非最適的”反應(yīng)條件下(包括高濃度的核酸內(nèi)切限制酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等),有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”,從其“正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子,這種現(xiàn)象稱為Star活性。,有些核酸內(nèi)切限制酶的切割特異性,受所用的緩沖液成份的影響比較明

20、顯。例如,最常用的EcoRI限制酶,在正常的情況下,是在G AATTC識(shí)別序列處發(fā)生切割作用的,但如果緩沖液中的甘油濃度超過5(VV),那么其識(shí)別序列的特異性就會(huì)發(fā)生松動(dòng),可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割作用。EcoRI限制酶的這種特殊的識(shí)別能力,通常叫做星活性,以EcoRI*表示。,徐師大-屈艾老師制作,39,六. 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止 消化DNA樣品后,在進(jìn)一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性,大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的鈍化方法是65溫浴5分鐘。 但有些酶,如BamHI和Hae對(duì)熱穩(wěn)定,則需加入終止反應(yīng)液(如加入05molL的EDTA使之在溶液中的終濃度達(dá)到10mmol

21、/L)?以終止反應(yīng)。 此外,還可以用等體積的酚抽提酶解產(chǎn)物,提取DNA。 如果用限制性內(nèi)切酶消化DNA分子后,為了進(jìn)行凝膠電泳分析,則可直接加入凝膠電泳加樣緩沖液,振蕩混合后,直接上樣進(jìn)行凝膠電泳。,徐師大-屈艾老師制作,40,七、限制酶消化反應(yīng)的步驟 以下是對(duì)0210 ugDNA進(jìn)行消化的典型反應(yīng)步驟,如要對(duì)更大量的DNA進(jìn)行消化,則反應(yīng)的各個(gè)成分須相應(yīng)放大。 1、將DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻,使總體積為18ul。 2、 加入2ul適當(dāng)?shù)?0X限制酶消化緩沖液。輕敲管外壁以混勻之。 3、 加入12單位限制酶,輕彈管外壁以混勻之。1單位酶通常定義為:在建議使用的緩沖液及溫

22、度下,在20u1反應(yīng)液中反應(yīng)1小時(shí),使l ug DNA完全消化所需的酶量。,徐師大-屈艾老師制作,41,4、將上述混合的反應(yīng)物置于適當(dāng)溫度并按所需的時(shí)間進(jìn)行溫育。 5、 加入05molL EDTA(pH80)使終濃度達(dá)10mmolL,以終止反應(yīng)。 6、 如果消化后DNA直接進(jìn)行凝膠電泳分析,可加入6ul凝膠電泳加樣緩沖液,振蕩混合后,即可加樣進(jìn)行電泳。 如欲純化消化后的DNA,可用酚:氯仿和氯仿各抽提1次,再用乙醇沉淀DNA。,徐師大-屈艾老師制作,42,八. 使用限制酶的注意點(diǎn)(4點(diǎn)) 1、 限制酶十分昂貴!遵循以下建議可以最大限度地節(jié)省開支。為能從貯存管內(nèi)取出小量的酶,只要用一次性使用的移

23、液器吸頭在酶溶液表面輕沾一下即可。這樣,你可以取到至少01ul的酶量。濃縮的限制酶也可在使用前用1X限制酶緩沖液稀釋。但切勿用水稀釋以免酶變性。,徐師大-屈艾老師制作,43,2.限制酶在50甘油中保存于-20時(shí)是穩(wěn)定的。 在進(jìn)行酶切消化時(shí):先加入除酶以外的所有反應(yīng)成分混勻后,再加入酶液,并且從冰箱內(nèi)取出的貯酶管要立即放置于冰上。操作要快速,用完后立即將酶放回冰箱,以使酶在冰箱外放置的時(shí)間盡可能縮短。 每次取酶時(shí)都應(yīng)換一個(gè)無菌吸頭,一旦限制酶中污染了DNA或其他酶,將造成財(cái)力和時(shí)間上的浪費(fèi)。,徐師大-屈艾老師制作,44,3、 盡量減少反應(yīng)中的加水量以使反應(yīng)體積減到最小。但要確保酶體積不超過反應(yīng)總

24、體積的110,否則,限制酶活性將受到甘油的抑制。 4、通常延長(zhǎng)消化時(shí)間可使所需的酶量減少。這在切割大量DNA時(shí)不失為一大節(jié)約方法。在消化過程中,可取少量反應(yīng)液進(jìn)行微膠電泳以判斷消化進(jìn)程。,徐師大-屈艾老師制作,45,九、DNA的片段化,1、單酶切法: 單酶切的DNA片段數(shù): 若底物DNA為環(huán)狀,完全切割后,產(chǎn)生與其切點(diǎn)數(shù)(N)相同的DNA片段數(shù); 若底物DNA為線狀,完全酶切后,則產(chǎn)生N+1個(gè)DNA片段數(shù)。,徐師大-屈艾老師制作,46,2、雙酶切法: 可在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行,也可在不同的反應(yīng)體系中分步進(jìn)行。 3、部分酶切:(不完全酶切) 有多種原因造成,使DNA片段得率降低;但專門創(chuàng)造部分酶切

25、條件可以獲得需要的DNA片段。(P49),徐師大-屈艾老師制作,47,4. DNA分子的限制性圖譜:,(1) 限制性圖譜: 根據(jù)用一種或多種限制酶酶切的結(jié)果,可以在DNA分子上標(biāo)識(shí)出各種酶切識(shí)別序列位點(diǎn),這種限制性酶切位點(diǎn)的分布圖譜,叫作DNA分子的限制性圖譜。即作圖的界標(biāo)(又稱遺傳標(biāo)記marker)實(shí)質(zhì)上是限制性酶的識(shí)別序列位點(diǎn)。 (2)根據(jù)作圖方法和界標(biāo)的不同,又可以分別稱作“遺傳圖”和“物理圖”。最精細(xì)的物理圖就是基因組的全序列圖,圖上界標(biāo)間的距離,是以物理長(zhǎng)度來表示,即以核苷酸對(duì)的數(shù)目來表示。,徐師大-屈艾老師制作,48,徐師大-屈艾老師制作,49,第二節(jié) DNA連接酶 一DNA 連接

26、酶的發(fā)現(xiàn) 二連接酶的連接機(jī)理 三、分類 四、連接酶最佳反應(yīng)溫度,徐師大-屈艾老師制作,50,一DNA連接酶的發(fā)現(xiàn) 1967年,世界上有數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶,即DNA連接酶(1igase)。 這種酶需要在一條DNA鏈的3,末端具有一個(gè)游離的羥基(OH),和在另一條DNA鏈的5,末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)(P),只有在這種情況下,才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用,徐師大-屈艾老師制作,51,在大腸桿菌及其它細(xì)菌中,DNA連接酶催化的連接反應(yīng),是利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)作能源的; 而在動(dòng)物細(xì)胞及噬菌體中,則是利用ATP腺苷三磷酸作能源。,值得

27、注意的是,DNA連接酶并不能夠連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子,被連接的鏈必須是雙螺旋的一部分。實(shí)際上,DNA連接酶是封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick),即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂;,徐師大-屈艾老師制作,52,徐師大-屈艾老師制作,53,二連接酶的連接機(jī)理 在反應(yīng)中,ATP(在有些連接酶是NAD+)提供了激活的AMP,同DNA連接酶生成一種共價(jià)結(jié)合的酶-AMP復(fù)合物,同時(shí)伴隨著釋放出焦磷酸(PPi)或煙酰胺單核苷酸(NMN)。其中,AMP(腺苷一磷酸)是通過一種磷酸酰胺鍵同DNA連接酶的賴氨酸之c氨基相連(圖)。 激活的

28、AMP隨后從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5,末端磷酸基團(tuán)上,形成DNA腺苷酸復(fù)合物。 最后一步是3,OH對(duì)活躍的磷原子作親核攻擊,結(jié)果形成磷酸二酯鍵,同時(shí)釋放出AMP。,徐師大-屈艾老師制作,54,徐師大-屈艾老師制作,55,徐師大-屈艾老師制作,56,三、分類: 用于共價(jià)連接DNA限制片段的連接酶有兩種不同的來源:一種是由大腸桿菌染色體編碼的叫做DNA連接酶。 另一種是由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的叫做T4DNA連接酶。 這兩種DNA連接酶,除了前者用NAD+作能源輔助因子,后者用ATP作能源輔助因子外,其它的作用機(jī)理并沒有什么差別。,徐師大-屈艾老師制作,57,四、連接酶最佳反應(yīng)溫度

29、連接酶連接切刻DNA的最佳反應(yīng)溫度是37。但是在這個(gè)溫度下,粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此,連接粘性末端的最佳溫度,應(yīng)是界于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間,一般認(rèn)為 15比較合適,徐師大-屈艾老師制作,58,第三節(jié) DNA聚合酶(4個(gè)問題) 分子克隆操作中,常使用的DNA聚合酶有大腸桿菌DNA聚合酶I,大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow大片段,T4 DNA聚合酶,T7 DNA聚合酶,逆轉(zhuǎn)錄酶等。 這些DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是,它們都能把脫氧核糖核苷酸連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的3,一OH末端,催化核苷酸的聚合,而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。其中,T7 DNA聚合酶的聚合能力最強(qiáng)。,徐

30、師大-屈艾老師制作,59,一大腸桿菌DNA聚合酶I 1956年AKornberg等首先從Eco1i細(xì)胞中分離出來。它是在DNA模板的方向上催化核苷酸聚合的酶,由單一多肽組成的球蛋白。 1.功能: DNA聚合酶I是一個(gè)多功能酶,它包括三種不同的酶活力: (1) 5-3,聚合酶活性: 催化單核苷酸結(jié)合到DNA模板的3,一OH末端,以ssDNA作模板,沿引物的3,一OH方向按模板順序從5,一3延伸。 (2) 5, - 3,外切酶活性:Eco1i DNA 聚合酶1也能從游離的5,末端降解dsDNA成為單核苷酸。 (3) 3,- 5,外切酶活性:DNA聚合酶I還能從游離的3,OH末端降解dsDNA或ss

31、DNA成為單核苷酸。,徐師大-屈艾老師制作,60,P,P,P,P,P,P,P,P,P,P,T,T,A,A,A,A,G,G,C,C,HO,P,C,OH,G,P,OH,U,P,OH,U,P,OH,G,P,OH,OH,5,5,3,RNA primer,DNA polymerase (5 - 3 polymerase),徐師大-屈艾老師制作,61,2. E.Coli DNA聚合酶在基因工程中的重要用途:,(1)制備高比活的DNA探針 通過DNA缺口轉(zhuǎn)移,制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。 (2)用于分子克隆 (3)DNA序列分析,徐師大-屈艾老師制作,62,缺刻轉(zhuǎn)移(nicktransl

32、ation)指在DNA分子的單鏈缺口上,DNA聚合酶I的5-3,核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。這就是說,當(dāng)外切酶活性從缺口的5,一側(cè)移去一個(gè)核苷酸之后,聚合作用就會(huì)在缺口的3,一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。但由于PolI不能夠在3,OH和5,P之間成鍵,因此隨著反應(yīng)的進(jìn)行,5,一側(cè)的核苷酸不斷地被移去,3,一側(cè)的核苷酸又按序地增補(bǔ),于是缺口便沿著DNA分子按合成的方向移動(dòng)。這種移動(dòng)特稱為缺刻轉(zhuǎn)移。,徐師大-屈艾老師制作,63,徐師大-屈艾老師制作,64,二 Klenow片段 1.本質(zhì): 它是由大腸桿菌DNA聚合酶I全酶,經(jīng)枯草桿菌蛋白酶(一種蛋白質(zhì)分解酶)處理之后,產(chǎn)生出來的分子量為76 X

33、 103dal的大片段分子。稱為Klenow片段或者Klenow聚合酶。 2. 功能: Klenow聚合酶仍具有5,-3,的聚合活性和3,-5,的核酸外切酶活性,但失去了全酶的5,-3,的核酸外切酶活性。 ,徐師大-屈艾老師制作,65,3.主要用途 )修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3,隱蔽末端; )標(biāo)記DNA片段的末端; 以及CDNA克隆中的第二鏈CDNA的合成; PCR; 雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行DNA測(cè)序等。,徐師大-屈艾老師制作,66,徐師大-屈艾老師制作,67,三. T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶,是從T4 噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出來的一種特殊的DNA聚合酶。具有兩種

34、酶催活性,即5,-3,的聚合酶活性和3,-5,的核酸外切酶活性。 如同大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段一樣,T4 DNA聚合酶也可以用來標(biāo)記DNA平末端或隱蔽 的3,末端。,徐師大-屈艾老師制作,68,徐師大-屈艾老師制作,69,四、末端轉(zhuǎn)移酶(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶),從小牛胸腺和骨髓中提取。 可使dNTP添加到DNA分子的3-OH末端上,不要求模板,但需CO2+的存在。 添加的末端分2類:一類是加寡dA和dC,另一類是加寡dT和dG。 混合這2類后,可使同聚物dA和dT尾部退火連接。 用途:1)給載體或cDNA加上互補(bǔ)的同聚物; 2)用于DNA片段3末端的放射同位素標(biāo)記。,徐師大-屈艾

35、老師制作,70,另外幾種: 耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、 T7噬菌體DNA聚合酶(改造的測(cè)序酶)、 RNA聚合酶 :分為2種類型,一種以DNA為模板用來做RNA探針;一種不以DNA為模板又稱為poly(A)聚合酶,在缺少poly(A) 的RNA上加尾-A-A-A-A-A-。(再以olig(dT)為引物合成CDNA的第一連。,徐師大-屈艾老師制作,71,第四節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄酶及其他常用酶 (4個(gè)問題) 一、逆轉(zhuǎn)錄酶 又稱為依賴RNA的DNA聚合酶,這是一種有效的逆轉(zhuǎn)錄RNA合成為DNA的酶。其產(chǎn)物是與mRNA互補(bǔ)的DNA又稱cDNA 。,徐師大-屈艾老師制作,72,徐師大-屈艾老師制作,7

36、3,1、 逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶,主要有幾種不同的酶活性: (1)依賴RNA的DNA聚合酶 以RNA鏈為模板, 以帶3,一OH末端的DNA片段為引物,沿5,-3,方向合成cDNA鏈(第一鏈)。 (2)依賴DNA的DNA聚合酶 以ssDNA為模板,以帶有3一OH末端的DNA片段為引物,從5-3方向合成DNA鏈。 (3) 外切RNA酶活性 底物是RNADNA雜交分子中的RNA鏈,有兩種活性形式。 從RNA鏈5末端外切的稱5-3外切RNA酶;從RNA鏈3末端外切的稱3-5外切RNA酶H。,徐師大-屈艾老師制作,74,雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈,徐師大-屈艾老師制作,75,2、在基因工程中逆轉(zhuǎn)錄酶的主要用途是: 1)轉(zhuǎn)錄mRNA成為cDNA再進(jìn)一步制備基因片段。 2)以5突出端做模板沿著3鏈進(jìn)行補(bǔ)平并標(biāo)記,制備雜交探針。 3)可代替Klenow大片段,進(jìn)行測(cè)序。,徐師大-屈艾老師制作,76,二、S1核酸酶 1、 從米曲霉中提取。是一種高度特異性單鏈核苷酸內(nèi)切酶,可降解單鏈DNA和單鏈RNA,產(chǎn)生5單鏈核

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