轉(zhuǎn)錄組測序(RNASeq)楊軍.ppt

1、轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq),Jun Yang,RNA-Seq 的技術(shù)背景,RNA-Seq又稱轉(zhuǎn)錄組高通量測序(transcriptome sequencing)或稱為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序(Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS) 2005年以來, 以Roche 公司的454 技術(shù)、Illumina 公司的Solexa 技術(shù)和ABI 公司的SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的新一代測序技術(shù)誕生, 之后HelicosBiosciences 公司又推出單分子測序(Single molecule sequencing, SMS)技術(shù)。新一代測序又稱作深度測序或高通量測

2、序。,轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA。 轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）廣義上指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA的集合。蛋白質(zhì)是行使細(xì)胞功能的主要承擔(dān)者，蛋白質(zhì)組是細(xì)胞功能和狀態(tài)的最直接描述，轉(zhuǎn)錄組成為研究基因表達(dá)的主要手段，轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。,轉(zhuǎn)錄組？,轉(zhuǎn)錄本,All transcripts,All mRNAs,Total RNA樣品檢測,

3、OD260/280:1.82.2； RNA 28S:18S 1.0; RIN7 ； 樣品總量不低于15ug； 樣品濃度：total RNA濃度不低于400ng/ul。,樣品RNA準(zhǔn)備 2. 測序文庫構(gòu)建 使用oligo dT微珠純化mRNA mRNA片段化處理 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成合成雙鏈cDNA 雙鏈DNA末端修復(fù)及3末端加A 使用特定的測序接頭連接DNA片段兩端 高保真聚合酶擴(kuò)增構(gòu)建成功的測序文庫 3. DNA成簇（Cluster）擴(kuò)增 4. 高通量測序（Illumina Genome Analyzer IIx） 5. 數(shù)據(jù)分析 原始數(shù)據(jù)讀取 與數(shù)據(jù)庫比對并進(jìn)行注釋 深層次數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)流程,標(biāo)

4、準(zhǔn)信息分析流程,生物信息分析,基本信息分析,數(shù)據(jù)量產(chǎn)出：2Gb per sample 測序策略：HiSeq2000, PE91 or 101 插入片段大?。?00 bps 測序質(zhì)量控制：Q20% 80,相關(guān)概念,高通量測序中，每測一個(gè)堿基會(huì)給出一個(gè)相應(yīng)的質(zhì)量值，這個(gè)質(zhì)量值是衡量測序準(zhǔn)確度的。Q20與Q30則表示質(zhì)量值大于等于20或30的堿基所占百分比。 Q20值是指的測序過程堿基識(shí)別過程中，對所識(shí)別的堿基給出的錯(cuò)誤概率。 質(zhì)量值Q20，錯(cuò)誤識(shí)別概率是1%，即正確率是99%；質(zhì)量值Q30，錯(cuò)誤識(shí)別概率是0.1%，即正確率是99.9%；質(zhì)量值Q40，錯(cuò)誤識(shí)別概率是0.01%，即正確率99.99%；

5、Q“N”0的質(zhì)量值，就是正確率有N個(gè)9的百分比。 N50 即覆蓋50%所有核苷酸的最大Unigene長度或覆蓋 50%所有核苷酸的最大序列重疊群長度。,相關(guān)概念,高通量測序時(shí)，在芯片上的每個(gè)反應(yīng)，會(huì)讀出一條序列，是比較短的，叫read，它們是原始數(shù)據(jù)；有很多reads通過片段重疊，能夠組裝成一個(gè)更大的片段，稱為contig；多個(gè)contigs通過片段重疊，組成一個(gè)更長的scaffold；一個(gè)contig被組成出來之后，鑒定發(fā)現(xiàn)它是編碼蛋白質(zhì)的基因，就叫singleton；多個(gè)contigs組裝成scaffold之后，鑒定發(fā)現(xiàn)它編碼蛋白質(zhì)的基因，叫unigene。 Unigene是UniqueG

6、ene的英文縮寫，意為廣泛通用的基因數(shù)據(jù)庫，通過電腦對相同基因座(Locus)的收集整理集合形成一個(gè)非冗余的基因數(shù)據(jù)庫。,相關(guān)數(shù)據(jù)庫概念,NR是NCBI里的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫，即NCBI的blastp程序中的NR數(shù)據(jù)庫 ，我們可以用自己的query序列，blast搜索這個(gè)數(shù)據(jù)庫，得到這些query序列的具有序列相似性的蛋白序列。 NT：NCBI的blast頁面，選擇nucleotide blast，數(shù)據(jù)庫選others，也就是（nr/nt）. SWISS-PROT是經(jīng)過注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，由歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)維護(hù)。 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes

7、 and Genomes，京都基因與基因組百科全書)是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫。 COG是Cluster of Orthologous Groups of proteins（蛋白相鄰類的聚簇）的縮寫，即直系同源基因數(shù)據(jù)庫。 COG是對基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫，每個(gè)COG蛋白都被假定來自祖先蛋白，COG數(shù)據(jù)庫是基于細(xì)菌、藻類、真核生物具有完整基因組的編碼蛋白、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行構(gòu)建的，我們將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，預(yù)測Unigene可能的功能并對其做功能分類統(tǒng)計(jì)，從宏觀上認(rèn)識(shí)該物種的基因功能分布特征。 GO(gene ontology)是基因本體聯(lián)合會(huì)(Gene Onotolo

8、gy Consortium)所建立的數(shù)據(jù)庫，旨在建立一個(gè)適用于各種物種的，堆積因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述的，并能隨著研究不斷深入而更新的語言詞匯標(biāo)準(zhǔn),相關(guān)概念,基因的編碼區(qū)(Coding region），亦稱為“編碼序列”（Coding sequence）或“CDS”（Coding DNA Sequence），是指mRNA序列中編碼蛋白質(zhì)的那部分序列。CDS也等同于ORF（open reading frame）是編碼蛋白質(zhì)的序列，以ATG開始-終止密碼子結(jié)束。,環(huán)境轉(zhuǎn)錄組也可以這樣做,使用RNA-seq手段對實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，關(guān)注個(gè)體或者組織器官在不同環(huán)境條件下基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，挖掘

9、生物對逆境適應(yīng)的分子機(jī)制。 方案設(shè)計(jì)思路建議： （1）植物個(gè)體受到較多環(huán)境因素的影響，包括溫度、干旱、澇害、光照、鹽堿、污染物、蟲害以及病原菌侵染等等,相應(yīng)采取的應(yīng)答策略也較為多樣，可以通過激素信號分子和細(xì)胞表面受體調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。建議設(shè)置多個(gè)關(guān)鍵處理時(shí)間點(diǎn)，研究植物個(gè)體短時(shí)間內(nèi)和長時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化趨勢；揭示同一器官組織在不同環(huán)境脅迫下或不同器官組織在同一環(huán)境脅迫下基因的時(shí)空表達(dá)模式； （2）動(dòng)物器官組織樣本主要來源畜牧動(dòng)物、水產(chǎn)動(dòng)物、昆蟲、人以及模式動(dòng)物小鼠和線蟲，關(guān)注點(diǎn)為溫度處理、光照處理、污染物處理、病原菌/蟲感染、用藥前后特異性表達(dá)基因，根據(jù)基因表達(dá)模式分析揭示器官組織響應(yīng)環(huán)境

10、脅迫過程的分子機(jī)制； （3）對于微生物樣本，主要通過環(huán)境轉(zhuǎn)錄組分析不同培養(yǎng)環(huán)境、次生代謝產(chǎn)物積累以及毒素產(chǎn)生差異基因表達(dá)，解析環(huán)境誘導(dǎo)活性物質(zhì)生產(chǎn)的分子機(jī)理。,環(huán)境轉(zhuǎn)錄組也可以這樣做,有參考基因組序列生物信息分析,基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化 鑒定基因可變剪接 預(yù)測新轉(zhuǎn)錄本 SNP 分析 基因融合鑒定,有參考基因組序列信息分析流程,無參考基因組生物信息分析,Unigene功能注釋 Unigene的GO分類 Unigene代謝通路分析 預(yù)測編碼蛋白框（CDS） Unigene表達(dá)差異分析 Unigene在樣品間的差異GO分類和Pathway富集性分析,De novo reads組裝流程,Unigene GO 分類,Unigene COG 功能分類,基因表達(dá)差異分析,N1:total tag Number in sample A N2:total tag Number in sample B X :Gene expression level in sample A y :Gene expression level in sam