分子生物學研究方法上.ppt

1、第五章 分子生物學研究方法（上）,本章主要內(nèi)容 常見的DNA操作技術 基因克隆技術簡介 蛋白質(zhì)組學及研究技術,引言,重組DNA技術發(fā)展史上的重大事件 40年代，解決了遺傳的物質(zhì)基礎問題。確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)。 50年代，解決了基因的自我復制和世代交替問題。建立了DNA分子的雙螺旋結構模型，提出了半保留復制機制。 50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說, 成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達途徑。,從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。,1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效

2、地吸收噬菌體DNA。,1972年，Cohen等人又報道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。,基因工程的主要內(nèi)容或步驟 “分-切-連-轉(zhuǎn)-篩” （1）從基因組中分離、或PCR擴增、或人工合成帶有目的基因的DNA片段。 （2）用適當?shù)南拗泼阜謩e切割適當?shù)妮d體分子和含有目的基因的DNA分子。 （3）將目的基因連接到載體分子上，形成重組DNA分子。 （4）將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞中并增殖。 （5）篩選重組轉(zhuǎn)化子，擴增目的基因。再將目的基因克隆到表達載體上，導入受體細胞，使表達目的產(chǎn)物。,基因工程技術區(qū)別于其它技術的根本特征：具有跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無

3、親緣關系的新的寄主生物細胞之中的能力。,1962年Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶， 1967年Gellert發(fā)現(xiàn)了 DNA 連接酶。,重組DNA實驗中常見的主要工具酶,科學家已幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。,1 DNA操作技術,DNA分子的切割與連接 核酸分子雜交 凝膠電泳 細胞轉(zhuǎn)化 核酸序列分析 基因的人工合成 基因的定點突變 PCR擴增 基因敲除,1.1 核酸的凝膠電泳,原理： 種類：瓊脂糖（agarose）凝膠電泳； 聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠電泳 用途：鑒定重組DNA分

4、子 蛋白質(zhì)與核酸相互作用 DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作圖,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2 - 50kb之間,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為1-1000個堿基對,凝膠的分辨能力同凝膠類型和濃度有關，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。,1.2 轉(zhuǎn)基因方法 1.2.1 細菌轉(zhuǎn)基因的方法 (1)結合（conjugation） (2)轉(zhuǎn)化（transformation）(常規(guī)轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等) (3)轉(zhuǎn)染（transfection） (4

5、)轉(zhuǎn)導（transduction） 1.2.2 動物轉(zhuǎn)基因的方法 (1)顯微注射法：包括細胞核內(nèi)和細胞質(zhì)內(nèi)注射。 (2)電導轉(zhuǎn)基因法 (3)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導法 (4)胚胎干細胞介導法 (5)精子載體法 1.2.3 植物轉(zhuǎn)基因的方法 (1)Ti質(zhì)粒介導 (2)電轉(zhuǎn)化法 (3)基因槍法,1.3.1 放射性同位素技術 同位素：原子序數(shù)相同而質(zhì)量不同的元素。 放射性同位素 同位素可分為穩(wěn)定同位素和不穩(wěn)定同位素，后者又稱為放射性同位素。不穩(wěn)定同位素原子核結構不穩(wěn)定，易自發(fā)產(chǎn)生衰變，產(chǎn)生-射線、-射線和-射線等，同時從不穩(wěn)定同位素變成穩(wěn)定同位素。在分子生物學研究中，得到應用的是放射性同位素。,1.3 核酸的

6、分子雜交,放射性的衰變類型 -射線：帶正電荷的高速粒子流 -射線：帶負電荷的粒子流 -射線：光子流 分子生物學研究中常用的放射性同位素及其性質(zhì) 元素名稱 半衰期 12.1年 5700年 14.3天 87.1天 5.8年,147N + 10n 146C + 11H 146C 147N + 0-1e 23892U 20682Pb + 842He + 60-1e (t1/2 = 4.5109a),放射性強度的探測 （1）蓋革計數(shù)器（Geiger counter tuber），閃爍計數(shù)器。 （2）放射自顯影：X-光乳膠片覆蓋于樣品，在黑暗中，-70，曝光。 放射性分子的制備：核物理，化學，生化反應，生

7、化分離技術,核酸分子的放射性同位素標記應用舉例 利用切口平移技術制備DNA放射性探針,1.3.2 分子雜交類型,根據(jù)鑒定對象不同，可將分子雜交法分為3種類型：,Southern雜交由E.M.Southern于1975年創(chuàng)立。,Southern雜交：將DNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，然后與核酸探針進行雜交。 Northern雜交：將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，然后與核酸探針進行雜交。 Western雜交：將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質(zhì)進行反應。,1.3.3 核酸分子雜交,復性（退火）：在一定條件下變性的兩條單鏈重新結合為雙鏈的過程

8、 雜交：來源不同的兩條單鏈結合為雙鏈分子的過程。 核酸探針：指序列或功能特性已知的標記分子，為雙鏈或單鏈，長度通常為幾十至幾百bp,包括DNA探針、RNA探針和cDNA探針。,若退火的核酸來自不同的生物有機體，則所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。,（1）Southern雜交（Southern印跡）：用適當?shù)南拗泼赶郎yDNA，電泳后，將凝膠浸于堿性溶液中以變性DNA，再經(jīng)毛細作用將變性的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移至雜交膜上并固定，然后與放射性同位素標記的核酸探針雜交，再經(jīng)放射自顯影顯示雜交結果。該技術可有效地分析基因結構或檢測待測DNA樣本中是否含有特定的序列。,1)電泳:將已酶切的待檢DNA樣

9、品進行瓊脂糖凝膠電泳。 2)轉(zhuǎn)膜:將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到濾膜上（印跡轉(zhuǎn)移）。 3)雜交:將濾膜與標記的DNA或RNA探針進行雜交。,印跡法：凝膠印跡法、斑點和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法。 雜交膜：尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜等。,雜交模式圖,某作者用人的一放射性DNA探針與鼠基因組DNA進行雜交，在所得到的雜交圖譜中，第1泳道的點樣處有一略呈拖尾狀的放射性雜交斑點；第2泳道呈較長的彌散形雜交帶；第3泳道有3條較清晰的雜交條帶，上下兩條帶的顯色程度相當，中間的條帶顯色最深，約分別為其上下兩側(cè)條帶的兩倍。試分析上述實驗結果。,例題：,Southern雜交應用舉例,環(huán)狀芽孢桿菌基因啟動子的分離與鑒定

10、,環(huán)狀芽孢桿菌C-2基因啟動子探針與重組DNA分子的斑點雜交,（2）斑點雜交（Dot blot）：直接將DNA樣品點在濾膜上使之成為斑點，變性并固定，與探針雜交，放射自顯影。,檢測重組體克隆的菌落雜交技術,（3）菌落原位雜交（Hybridization in situ)：又分為菌落雜交和空斑雜交。在雜交膜上接種轉(zhuǎn)化子細胞，裂解以釋放待檢DNA，變性并固定DNA，與探針雜交，放射自顯影。用于鑒定陽性重組體。,（4）組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）： 指組織或細胞的原位雜交。經(jīng)適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，以確定探針互補

11、序列在胞內(nèi)的空間位置。,Localization of RNA,1.4 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR） PCR技術簡史 1.4.1 PCR原理 PCR是一種體外無性擴增DNA的實驗技術。待擴增DNA片段經(jīng)高溫變性成為單鏈后，在低溫（如52）下與寡聚核苷酸引物退火，然后在中溫下以每一條單鏈為模板，由多聚酶催化延伸引物鏈，分別合成一條新鏈。經(jīng)過解鏈、退火和鏈延伸等多個循環(huán)反應，原DNA片段就可得到大量擴增。,注: Taq來自Thermus aquaticus,PCR儀,1.4.2 PCR反應體系 Tmplate DNA DNA Primers dNTP

12、s Taq DNA Polymerase 10 Buffer 1.4.3 基本反應步驟,1個循環(huán)包括高溫變性、低溫退火和中溫延伸反應。經(jīng)n次循環(huán)后, 一個DNA分子可擴增為2n個分子。, 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時間后，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便與引物結合。,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,3, 模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈上的互補序列配對結合。,3,3,5,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase

13、, 引物的延伸：DNA模板-引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對原則，合成一條新的與模板DNA互補的鏈。,一般每完成一個循環(huán)需2-4分鐘，2-3小時就能將待擴增目的基因擴增放大幾百萬倍。,1個PCR循環(huán)產(chǎn)生2條雙鏈分子,PCR的基本原理,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,第1輪結束,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的

14、特點,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,第2輪結束,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,第1輪擴增,第2輪擴增,第3輪擴增,第4輪擴增,第5輪擴增,第6輪擴增,電泳分析,PCR設備,電泳分析,（3）PCR的應用 反向PCR：擴增已知序列旁側(cè)的未知DNA序列 錨定PCR: 用于測定基因結構 不對稱PCR: 用于擴增某一單鏈模板 RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-PCR): 逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合PCR以擴增cDNA 復合PCR: 用多對引物同時擴增幾條DNA片段 易錯PCR：引入錯配堿基，導致隨機突變 熒光定量PCR: 用于估計模板DNA的濃度 免疫PCR

15、：擴增抗原-抗體復合物上的DNA分子 原位PCR：在組織或細胞標本片上直接進行PCR 微生物PCR: 用于微生物的鑒定和分類,設計引物應遵循以下原則： 引物長度：15-30bp，常為20nt左右。引物擴增跨度：以200-500bp為宜。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜。避免5個以上相同堿基的成串排列。引物內(nèi)部應避免出現(xiàn)出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補。引物3末端堿基，應與模板單鏈嚴格配對。引物中具有或能夠加上合適的酶切位點。特異性：與數(shù)據(jù)庫中的其它序列無明顯同源性。,pPICZ物理圖譜,定向克隆應用舉例,Primer F：5- GCT GAA TTC ATG GGC AAC TCA GC

16、G CTC GAC CTT - 3 Primer R：5- TGT TCT AGA TTA GAC GTT ACC GGC GGC GCC AGT - 3 上、下游引物的5端分別設有1個EcoR 和1個Xba 酶切位點（黑體字母表示）及3個保護堿基。,定向克隆應用舉例-PCR引物設計,粗毛栓菌熱激蛋白cDNA PCR擴增-引物設計:,5CTTCCACGACGCTATC-/-GAGAGATTCGCCTGCA 3,關于PCR引物設計,例題1：根據(jù)以下cDNA編碼區(qū)片段的兩末端已知序列，如何設計下游引物，以擴增該cDNA片段。,例題2: 如何利用網(wǎng)絡技術和DNA分析軟件設計簡并引物, 以PCR擴增某

17、蛋白的cDNA? 演示: (1)登錄NCBI等網(wǎng)站,收集有關cDNA序列信息; (2)利用DNA分析軟件(如,DNAman等)對所收集的cDNA序列進行比對分析,利用最保守序列設計引物。,再論cDNA,38種MnP同工酶cDNA序列的同源性比較 右側(cè)1列符號表示相應的cDNA序列在GenBank中的登錄號,酶法測序(Sanger) 化學測序法(Maxam-Gilbert) 待測DNA片段 待測DNA片段 次克隆 5-末端標記 篩選重組子 鏈分離 限制酶切 模板增殖與純化 純化標記的ss-DNA 與引物退火 定序反應 定序反應 聚丙烯酰胺凝膠電泳 真空干燥 放射自顯影 閱讀序列和計算機錄入 核苷

18、酸序列的分析與比較,1.5.1 Sanger雙脫氧核苷酸鏈終止法 （1）原理：雙脫氧（2，3）-核苷酸可以象2-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3 端不具OH基，DNA鏈合成至此終止。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列。,dsDNA變性與1條標記引物退火在4個反應管中分別加入dNTP和1種雙脫氧核苷酸DNA聚合反應反應產(chǎn)物變性電泳凝膠干燥放射自顯影序列讀取。,（2）步驟,雙脫氧核苷酸鏈終止法測序示意圖,DNA sequencing gel showing the separation of fragments in th

19、e four sequencing reactions (one per lane).,思考題： 假定某一基因克隆的部分序列為5TCACGTAAGT3，試根據(jù)Sanger序列分析方法原理畫出測定上述序列的放射自顯影示意圖，并對示意圖作必要的標注和解釋。,1.5.2 DNA序列測定的自動化 使用自動測序儀,使得模板制備自動化、定序反應自動化、凝膠電泳自動化、核苷酸序列閱讀與計算機輸入自動化。,DNA序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容:一是指“分析反應”的自動化;另一方面則是指“讀片過程”的自動化。,優(yōu)點：i. 四個反應系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和 點樣時間。ii.可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不

20、需干燥凝膠和放射自顯影。iii.可連續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列。 缺點：無法保留原始記錄, 四個反應產(chǎn)物點在一條道上,相互間會發(fā)生干擾, 導致讀序時分辨率下降。,DNA序列測定的自動化,熒光素標記核苷酸應用舉例,In DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes, all four ddNTPs are added to the same tube, and during primer extension, all combinations of chains are produced.,Auto

21、mated DNA sequencing using fluorescent dyes, one for each base,1.6 基因文庫的建立 克隆（clone）：作名詞用，是指具有相同DNA分子的一個群體或基因型相同的一個生物群體。作動詞用，指“進行克隆”或“去克隆”，將一特定DNA順序插入一個載體分子。 亞克?。ù慰寺。壙寺?，sub-clone）：是指從已經(jīng)克隆在載體中的一個大片段中取出較小的DNA片段再進行克隆的方法。 基因文庫(gene library):包括基因組文庫和cDNA文庫。 YAC和BAC文庫,基因工程基本操作步驟：“分、切、連、轉(zhuǎn)、篩”,基因組文庫的構建步驟,1

22、.6.1 基因組文庫 基因組文庫: 含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總體。 基因組文庫的規(guī)模：N = ln（1p）/ln（1-f） 上式中，N：克隆數(shù)；p：某DNA片段在基因文庫中出現(xiàn)的概率；f：插入片段的平均大小與基因組大小的比值。,1.6.2 cDNA文庫 從一定生長階段的某種細胞或組織分離得到的總mRNA反轉(zhuǎn)錄成總cDNA，插入到克隆載體，然后再將cDNA重組子轉(zhuǎn)移到宿主細胞中進行增殖。通過上述方法所獲得的無性繁殖系即為cDNA文庫。,cDNA文庫構建步驟,與cDNA克隆或文庫構建有關的幾個問題 cDNA的概念：第一鏈cDNA；cDNA基因；cDNA編碼序列。 mRNA質(zhì)量

23、的檢測：根據(jù)甲醛變性膠電泳的rRNA的帶型進行判定。 mRNA的純化：0ligo（dT）-纖維素柱層析；抗生物素蛋白磁珠吸附法。生物素標記0ligo（dT）。 cDNA重組子的形成：在cDNA雙鏈末端或添加同聚物單鏈尾巴，或添加含適當限制酶識別序列的“接頭”（linker），以便與適當載體重組。,Trametes gallica總RNA的甲醛變性電泳,mRNA質(zhì)量的檢測,mRNA的純化,Promega Poly（AT） tract mRNA Isolation System分離Poly(A)RNA：將用生物素標記的Oligo（dT)與總RNA共溫育；加入包被有抗生物素蛋白的微磁球；用磁場吸附O

24、ligo(dT)-mRNA。,cDNA文庫構建圖解,1.7 分子標記技術 遺傳標記: 是基因型的特殊的易于識別的表現(xiàn)形式，它是生物分類學、遺傳學、育種學、物種起源與進化等研究的主要技術指標之一。包括形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記和分子標記等。 分子標記: 分子標記指能反映生物個體或種群之間基因組DNA差異的DNA序列。分子標記廣泛存在于基因組的各個區(qū)域，數(shù)量大，多態(tài)性高。分子標記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)出來。是繼形態(tài)標記、細胞標記和生化標記之后發(fā)展起來的一種新的較為理想的直接從DNA水平上進行遺傳分析的遺傳標記。 應用 種質(zhì)資源研究、品質(zhì)純度鑒定、構建遺傳連鎖圖、基因定位標記輔助選擇、比較基因

25、組研究、基因克隆（圖位克隆）、生物起源、進化、醫(yī)學及法醫(yī)學等。,現(xiàn)有的DNA分子標記技術大體上可分為2類，一類是以分子雜交為基礎的分子標記，其代表性技術是RFLP；另一類是以PCR為基礎的分子標記，如RAPD、SCAR、SSR、SSLP、ISSR、AFLP、STS、EST、SSCP和SNP等。 每種分子標記技術都有其優(yōu)缺點，可根據(jù)實驗材料和研究目的的不同靈活選用。,DNA分子標記類型,主要的DNA分子標記 英文縮寫 英文名稱 中文名稱 RFLP Restriction fragment length polymorphism 限制性片段長度多態(tài)性 STS Sequence tagged sit

26、e 序列標簽位點 RAPD Random amplified polymorphic DNA 隨機擴增多態(tài)性DNA SCAR Sequence-characterized amplified region 序列特異性擴增區(qū) AFLP Amplified fragment length polymorphism 擴增片斷長度多態(tài)性 SSR Simple sequence repeat 簡單序列重復 SSLP Simple sequence length polymorphism 簡單序列長度多態(tài)性 ISSR Inter-simple sequence repeats 間簡單序列重復 SSCP S

27、ingle-strand conformation polymorphism 單鏈構象多態(tài)性 SNP Simple nucleotide polymorphism 單核苷酸多態(tài)性,(1) RFLP (限制性片段長度多態(tài)性) 不同個體基因組內(nèi)的核苷酸序列因某種原因產(chǎn)生堿基突變后，改變了某種限制性內(nèi)切酶的剪切位點，導致酶切片段的大小發(fā)生變化，這種變化可以通過與特定探針進行雜交而得到檢測，從而可比較不同品種或個體的DNA水平的差異。這些限制性片段在不同個體間呈現(xiàn)的多態(tài)性現(xiàn)象稱為限制片段長度多態(tài)性。RFLP被稱為第一代分子標記。,同一物種不同生態(tài)型之間DNA的趨異性的RFLP,與放射性標記探針雜交,顯

28、示特異的DNA 片段,RFLP基本步驟,DNA“指紋”（DNA finger-print）:利用重復序列中的“核心序列”作探針，與經(jīng)內(nèi)切酶酶切的DNA片段進行Southern印跡雜交，每個人各有自己的雜交帶型，如同每個人各有自己的指紋圖形一樣。,(2) STS（sequence-tagged site）序列標簽位點 為已知核苷酸序列的DNA片段，是基因組中任何單拷貝的短DNA序列，長度在100500bp之間。任何DNA序列，只要知道它在基因組中的位置，都能被用作STS標簽。STS是基因組中較短的用于定位的序列。,(3) RAPD(Random amplified polymorphic DNA

29、) 隨機擴增多態(tài)性DNA 是一種建立在PCR基礎之上的可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的分子標記方法。以若干條人工合成的隨機引物( 通常為10nt), 對所研究的基因組DNA進行PCR 擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。一般一條引物可擴增6-12條DNA片段。RAPD不涉及印跡雜交、放射性自顯影等技術，因此簡便易行。,(4) SCAR (Sequence-characterized amplified region) 序列特異性擴增區(qū) 基于RAPD的分子標記技術，其基本流程為，先進行RAPD分析，然后將目標RAPD片段回收、克隆和測

30、序，再根據(jù)所測序列設計特定引物，此引物通常包含原RAPD引物，長度為20-24bp，再用此新引物對所研究的基因組進行PCR擴增，從而可把與原RAPD片段相對應的單一位點鑒定出來。,(5) AFLP(Amplified fragment length polymorphism) 擴增片斷長度多態(tài)性 是一種基于PCR反應以選擇性擴增基因組DNA限制性片段的DNA指紋技術，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割（限制性片段由2種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶），然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。AFLP結合了RFLP和PCR技術特點，具

31、有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。,(6) SSR或STR （Simple Sequence Repeats，SSR）簡單序列重復,又稱微衛(wèi)星DNA ( Microsatellite DNA )或短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats，STR） 是一類由幾個核苷酸（一般為2-6個）為重復單位簇集而成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列，廣泛分布于真核生物基因組中，具有高度多態(tài)性。微衛(wèi)星在結構上的最大特點是其兩端序列較保守。人們根據(jù)微衛(wèi)星重復序列兩端的特定短序列設計引物，用來PCR擴增重復序列本身，從而揭示微衛(wèi)星的多態(tài)性。SSR被稱為繼RFLP之后的第二代分子遺傳標記。,

32、(7) SSLP (Simple sequence length polymorphism) 簡單序列長度多態(tài)性 根據(jù)串聯(lián)重復排列的微衛(wèi)星基序兩側(cè)的單一序列設計引物，對微衛(wèi)星序列進行PCR擴增，由微衛(wèi)星基序重復數(shù)目的變異而產(chǎn)生多態(tài)性。,(8) ISSR (inter-simple sequence repeats)間簡單序列重復 根據(jù)基因組中廣泛存在的微衛(wèi)星序列設計通用引物對基因組DNA進行PCR擴增，引物可以是微衛(wèi)星基序本身。ISSR保留了SSLP的優(yōu)點，同時還有效地克服了SSLP標記中引物設計困難的缺點。,(9) SSCP(Single-strand conformation polymo

33、rphism) 單鏈構象多態(tài)性 單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于其分子量和空間構象。雙鏈DNA經(jīng)變性后，再進行非變性膠電泳，在非變性膠中，單鏈DNA可形成二級結構，而該結構又與其堿基序列有關。通過電泳，不同的單鏈DNA被分離，單鏈DNA在凝膠中的位置差異反映了其序列組成的差異，從而呈現(xiàn)單鏈構象多態(tài)性。SSCP可用于檢測點突變。 PCR-SSCP是將PCR與SSCP相結合的用于檢測PCR產(chǎn)物DNA片段中的點突變的技術，其步驟為，用一對引物對基因組DNA進行擴增，PCR產(chǎn)物變性后，再經(jīng)非變性膠電泳，盡而檢測單鏈點突變。該技術在人類遺傳病和癌癥的點突變位點的檢測中曾發(fā)揮重要作用。,(

34、10) SNP(Simple nucleotide polymorphism)單核苷酸多態(tài)性 在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性，只涉及到單個堿基的變異(轉(zhuǎn)換或顛換)，也可由堿基的插入或缺失所致。被稱為第三代分子遺傳標記。,SNP檢測方法: 測序、RFLP、SSCP、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)、基因芯片技術等。 PCR-SSCP的應用舉例 PCR擴增不同樣本的DNA片段；PCR產(chǎn)物的變性；非變性凝膠電泳；根據(jù)單鏈構象多態(tài)性檢測點突變。 SNP技術的應用：用于構建高密度遺傳連鎖圖譜；進行致病基因以及人類起源、遷移、進化的研究；用于家畜遺傳育種研究以及遺傳圖譜和

35、物理圖譜的繪制。,99.9%的一致性，0.1的差異,從志愿者身上取得了DNA樣本，這些志愿者分別是歐洲、非洲和中國人的后裔。,2.1 RACE 技術（rapid amplification of cDNA ends, cDNA末端的快速擴增） RACE是根據(jù)已知序列以PCR快速擴增cDNA的5和3末端序列的技術。可分為3-RACE和5-RACE兩種。3- RACE和5- RACE都需先將mRNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。在3- RACE中，cDNA的合成起始于mRNA的ploy(A)尾，由含有oligo(dT)的接頭引物引發(fā)合成第一鏈cDNA，然后用3-錨定引物和一個5基因特異性引物（gene specific primer, GSP）進行擴增，可得到cDNA的3末端序列。在5- RACE中，先用一個GSP引發(fā)第一鏈cDNA的合成，然后在第一鏈cDNA的3端加上人工錨定序列，最后用5錨定引物和GSP下游引物進行擴增，得到cDNA的5末端序列。最后，從2個有相互重疊序列的3和 5-RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產(chǎn)物序列，合成相應引物,再擴增出全長cDNA。 意義：根據(jù)已得到的不完整的cDNA序列設計引物對mRNA的3端和5端進行擴增，