熒光及其熒光單分子跟蹤技術(shù).ppt

1、熒光及其熒光單分子跟蹤技術(shù),2011.11,鄢志丹,熒光 什么是熒光；分子熒光的主要特性有那些； 熒光顯微技術(shù) 熒光顯微鏡；探測(cè)傳感器；熒光顯微技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域； 熒光單分子檢測(cè)技術(shù) 單分子檢測(cè)意義；熒光單分子檢測(cè)特點(diǎn)、應(yīng)用范圍和關(guān)鍵技術(shù)； 一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法 圖像去噪；位置估計(jì)；偽點(diǎn)剔除；精細(xì)定位；軌跡生成；特性評(píng)價(jià)；真空設(shè)備； 總結(jié)及思考題,主要內(nèi)容:,思考題,思考題,1、什么是熒光？它有哪些主要特點(diǎn)？ 2、熒光如何從激發(fā)光中分離出來，它有那么主要的探測(cè)器件？ 3、單分子檢測(cè)的應(yīng)用領(lǐng)域有哪些？ 4、單分子跟蹤算法分為幾個(gè)重要步驟？ 5、IDGM（圖像去噪高斯掩膜）與2DDGF

2、（二維直接高斯擬合）算法相比，有什么優(yōu)勢(shì)？ 6、熒光顯微技術(shù)如何實(shí)現(xiàn)與真空分子生長(zhǎng)（蒸發(fā)）技術(shù)的耦合？,熒光,熒光（ 1852年，英國(guó)科學(xué)家Stokes) ：,1/5：熒光（Fluorescence）,光致發(fā)光： 某些分子受外界可見光或紫外線激發(fā) 而出射光子的現(xiàn)象； 熒光和磷光： 激發(fā)態(tài)電子排布和光子發(fā)射路徑不同； 熒光發(fā)射過程： 吸收、內(nèi)轉(zhuǎn)移、振動(dòng)馳豫、熒光發(fā)射 磷光發(fā)射：系間竄越,分子熒光發(fā)射能量圖,光致發(fā)光,分子熒光特性：,1/5：熒光（Fluorescence）,量子跳躍特性： 發(fā)射暗態(tài)交替的量子跳躍過程；在實(shí)驗(yàn)中可觀察到單分子熒光強(qiáng)度和熒光光譜的漲落；,熒光偏振特性： 單個(gè)熒光分子因

3、其具有唯一的固有熒光和吸收躍遷偶極矩， 因而只吸收那些偏振方向與其吸收躍遷偶極矩方向一致的 光子，并發(fā)出具有一定偏振方向的熒光；,分子熒光特性：,1/5：熒光（Fluorescence）,熒光顯微技術(shù),熒光顯微鏡家族：,種類繁多，包括落射式熒光顯微鏡、全內(nèi)反射式熒光顯微鏡、激光掃描共焦顯微鏡、駐波熒光顯微鏡、受激發(fā)射損耗熒光顯微鏡等； 激發(fā)樣品方式不同，但熒光分離原理近似；,基本原理：利用熒光濾鏡組出射一定波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)樣品以產(chǎn)生熒光（比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)），該熒光被物鏡采集后，再次經(jīng)由熒光濾鏡組消除不是熒光波長(zhǎng)的其他光，最終使熒光到達(dá)光學(xué)傳感器。,落射式熒光顯微鏡,2/5：熒光顯微技術(shù)（Fluo

4、rescence Microscopy）,特點(diǎn)：高靈敏度、高分子選擇性、高信噪比；,熒光濾鏡組：,把微弱的熒光從激發(fā)光中分離出來。,2/5：熒光顯微技術(shù)（Fluorescence Microscopy）,結(jié)構(gòu)圖,光譜圖,激發(fā)濾鏡的帶通波長(zhǎng)范圍必須是分色濾鏡和發(fā)射濾鏡的阻礙波長(zhǎng)范圍，而發(fā)射濾鏡的通過波長(zhǎng)范圍在分色濾鏡的通過波長(zhǎng)范圍之內(nèi)； 熒光濾鏡組的選擇要針對(duì)所觀測(cè)分子，須明確其激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜特征。,探測(cè)傳感器：,2/5：熒光顯微技術(shù)（Fluorescence Microscopy）,熒光顯微技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：,2/5：熒光顯微技術(shù)（Fluorescence Microscopy）,熒光單分

5、子檢測(cè)技術(shù),3/5：熒光單分子檢測(cè)技術(shù)（Fluorescence Single Molecule Detection）,為什么要進(jìn)行單分子檢測(cè)：,2. 單分子的特征對(duì)局部場(chǎng)的存在非常敏感， 可以反映局部微觀環(huán)境的信息,3. 能夠揭示隨時(shí)間變化的分子特性,3/5：熒光單分子檢測(cè)技術(shù)（Fluorescence Single Molecule Detection）,目前的主要方法：,近場(chǎng)方法：STM，AFM等； 遠(yuǎn)場(chǎng)方法：熒光顯微鏡； 其他方法：微流體、磁鑷、光鑷、超快振動(dòng)譜等。,掃描隧道顯微鏡,原子力顯微鏡,3/5：熒光單分子檢測(cè)技術(shù)（Fluorescence Single Molecule De

6、tection）,熒光單分子檢測(cè)：,快速；非接觸；多分子檢測(cè)與跟蹤；分子選擇 性強(qiáng)；納米級(jí)分辨率；光譜信息和圖像信息,熒光單分子檢測(cè),3/5：熒光單分子檢測(cè)技術(shù)（Fluorescence Single Molecule Detection）,熒光單分子檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)：,確保單分子的信號(hào)大于背景干擾信號(hào) (有效減少拉 曼散射、瑞利散射及其雜質(zhì)熒光所造成的干擾),在被照射的體積中只有一個(gè)分子與激發(fā)光發(fā)生相互作用（調(diào)整研究體系的濃度或密度）,一種高精度快速的熒光 單分子跟蹤算法,基于熒光顯微成像的單分子跟蹤,多方面的單分子跟蹤實(shí)驗(yàn)以及單分子跟蹤算法的研究。如：美國(guó)埃默里大學(xué)、喬治城大學(xué)、華盛頓大學(xué)、

7、伊利諾伊衛(wèi)斯理大學(xué)，英國(guó)曼徹斯特大學(xué)和瑞士生物醫(yī)學(xué)圖像組等,四種典型運(yùn)動(dòng)軌跡 （A 靜態(tài)；B 簡(jiǎn)單擴(kuò)散；C 單方向擴(kuò)散；D 限制區(qū)域擴(kuò)散,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,材料科學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物物理、生物化學(xué)等領(lǐng)域 跟蹤分子運(yùn)動(dòng)、獲取運(yùn)動(dòng)軌跡、分析擴(kuò)散方式、精確擴(kuò)散速率，可得到豐富而詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)信息。 分子馬達(dá)特性；蛋白分子的聚核與裂解；膠體相互作用；細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間反應(yīng)機(jī)理等,20,原始圖像,圖像去噪,特征點(diǎn)位置估計(jì),偽點(diǎn)剔除,高斯掩膜精細(xì)定位,概率軌跡鏈接,實(shí)現(xiàn)快速高精度,快速高精度單分子跟蹤算法,快速高精度單分子實(shí)時(shí)跟蹤算法是進(jìn)行實(shí)時(shí)單分子跟蹤的必然要求。 該算法包括圖像

8、去噪處理與高斯掩膜質(zhì)心法相結(jié)合的定位算法和同時(shí)考慮等效光強(qiáng)和幀間最大運(yùn)動(dòng)位移的同分子概率鏈接算法。,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,圖像重構(gòu) A (轉(zhuǎn)化為浮點(diǎn)型數(shù)組),散粒噪聲,背景噪聲: 光學(xué)器件殘余熒光； 樣品雜質(zhì)熒光； 非焦平面雜散熒光； 瑞利散射光； CCD讀取噪聲、暗電流； 散粒噪聲（像素噪聲，離散化噪聲）： CCD器件進(jìn)行離散光電子計(jì)數(shù)產(chǎn)生的具有 泊松分布的信號(hào),的選取很重要,用圖像去噪算法去除背景噪聲和散粒噪聲的后，單分子圖像信息便凸顯出來,背景噪聲,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,特征點(diǎn)位置估計(jì): 像素級(jí)分辨率,采用圖像數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)處理技術(shù)中的256級(jí)灰度

9、膨脹算法來實(shí)現(xiàn)區(qū)域極大值的選擇，在進(jìn)行膨脹算法時(shí)，以w為半徑創(chuàng)建結(jié)構(gòu)圓，并將圖像向上下左右四個(gè)方向外延w個(gè)像素，選擇圖像膨脹前后像素值的相同點(diǎn)即是極大值點(diǎn),濾波后圖像,膨脹后圖像,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,偽點(diǎn),偽點(diǎn)剔除,設(shè)定一個(gè)百分比r，當(dāng)極值點(diǎn)像素值位于全部像素值前 時(shí)r ，此極大值即為估計(jì)中心位置，否則剔除之；,特征點(diǎn),3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,采用結(jié)合質(zhì)心法和二維直接高斯擬合兩種算法優(yōu)點(diǎn)的高斯掩膜精細(xì)定位算法； 運(yùn)算速度快； 精度高； 適合實(shí)時(shí)的單分子跟蹤研究,精細(xì)定位,式中：,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,第i個(gè)特征點(diǎn)在兩幀間移動(dòng)的實(shí)

10、際距離,相鄰兩幀分子可能移動(dòng)的最大距離,兩特征點(diǎn)點(diǎn)等效光強(qiáng)之差,最大可能移動(dòng)距離,下一幀檢測(cè)到的特征點(diǎn),軌跡鏈接,式中：,兩特征點(diǎn)點(diǎn)等效光強(qiáng)的平均值,鏈接，即在確定每幀的單分子位置坐標(biāo)后，通過合理的鏈接算法把表示同一分子的點(diǎn)以時(shí)間序列的方式連接起來 以等效光強(qiáng)和運(yùn)動(dòng)位移為評(píng)價(jià)因素的概率法，是一種有效的特征點(diǎn)匹配方法,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,熒光單分子仿真圖像,實(shí)驗(yàn)用熒光顯微成像系統(tǒng)配置,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,IDGM與2DDGF(直接二維擬合）的比較分析,單分子定位算法精度分析一,IDGM和2DDGF算法的運(yùn)算時(shí)間比較,3/5：一種高精度快速的熒光單分

11、子跟蹤算法,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,仿真與實(shí)驗(yàn),熒光單分子跟蹤研究的真空設(shè)備,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,超高真空系統(tǒng)整體示意圖,1)超高真空腔；2)真空閥門；3)傳輸真空腔；4)襯底/樣品傳輸機(jī)構(gòu)；5)渦輪分子泵（下接旋轉(zhuǎn)機(jī)械泵）；6)分子蒸發(fā)源接口；7)橢偏儀接口；8)線性驅(qū)動(dòng)真空波紋管；9)樣品架；10)反射差分光譜儀接口；11)結(jié)構(gòu)架；12)支撐柱；13)鈦升華泵；14)懸掛彈簧；15)離子泵；16)液氦低溫冷頭；17)x-y平面移動(dòng)平臺(tái)；18)熒光顯微鏡；19)CCD攝像機(jī),真空系統(tǒng)裝配實(shí)物圖,熒光單分子跟蹤研究的真空設(shè)備,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,5/5：總結(jié)及思考題,2、 熒光顯微技術(shù)、探測(cè)傳感器以及熒光顯微術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域；,3、熒光單分子檢測(cè)特點(diǎn)、應(yīng)用范圍和關(guān)鍵技術(shù)；,4、一種快速高精度的單分子跟蹤算法的實(shí)現(xiàn)過程、特性評(píng)價(jià)及典型的單分子研究裝置。,總結(jié),思考題,5/5：總結(jié)及思考題,1、什么是熒光？它有